在高精料条件下,由于淀粉降解产生大量的葡萄糖,为瘤胃微生物的生长提供了大量碳源,短时间内瘤胃微生物会大量的繁殖,瘤胃中挥发性脂肪酸会大量累积,导致瘤胃pH下降,不耐酸的菌群大量死亡[1],引起奶牛肠道环境出现紊乱,瘤胃微生物区系发生改变[2]。瘤胃菌群结构的合理性和稳定性直接影响到奶牛机体各方面的健康状况。有研究证明,乳脂的合成与瘤胃菌群结构存在一定的关系[3]。Pitta等[4]通过饲喂低纤维、高淀粉和高不饱和脂肪酸诱导荷斯坦奶牛乳脂下降,结果发现低乳脂奶牛模型瘤胃中拟杆菌门(Bacteroidetes)的丰度显著降低,厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)的丰度显著增加,其中拟杆菌门和厚壁菌门是哺乳动物胃肠道的优势菌群[5]。Heinrichs等[6]报道,甘露寡糖(MOS)能够优化牛的胃肠道微生态环境,促进双歧杆菌等有益菌的增殖,降低大肠杆菌等致病菌的数量。因此,本研究通过淀粉诱导构建低乳脂奶牛模型,探讨MOS对高精料诱导的低乳脂奶牛瘤胃细菌菌群的调控作用。
1 材料与方法 1.1 试验动物与设计试验选择4头泌乳阶段相近、胎次相同、体况良好、体重为650 kg左右的经产(2胎)中国荷斯坦奶牛作为试验动物。试验期共56 d,分为3个阶段,第1阶段:奶牛饲喂基础饲粮作为对照组,试验期为14 d (1~14 d);第2阶段:低乳脂奶牛模型构建期作为诱导组,试验期为28 d (15~42 d);第3阶段:添加MOS期作为调控组,试验期为14 d(43~56 d)。
低乳脂奶牛模型构建主要通过灌注玉米面,使奶牛饲粮淀粉含量达到27%左右;MOS(购自河南三化生物科技公司,纯度为99%)的添加量为200 g/(d·头),基础饲粮组成及营养水平见表 1。每个试验期的最后3 d为瘤胃液的正式采样期。
通过牛口腔导管采集瘤胃液,准备牛鼻夹把牛头固定,在口腔放入硬管(木头、硬塑胶均可,内径要超过取样软管),插入深度不要超过咽部,外面露出20 cm左右,工作人员能够用手把其固定,然后把软管(2.5 m左右)通过口腔硬管内径逐步送入瘤胃,将牛头压低,在牛的咀嚼过程中瘤胃液自然流出。用充有CO2的保温瓶盛放瘤胃液,并迅速转移至实验室,用4层纱布过滤,等量混匀,将混合好的瘤胃液分别装入50 mL离心管中,置于-80 ℃冻存备用。
1.3 样品测定 1.3.1 pH的测定利用pH计对瘤胃液pH进行测定。
1.3.2 挥发性脂肪酸含量的测定将过滤后的瘤胃液以10 000 r/min离心10 min;取离心后的瘤胃液1 mL,加入现配的25%偏磷酸溶液200 μL,再以10 000 r/min离心10 min,然后使用气相色谱仪(GC-2020,武汉恒信世纪科技有限公司)测定瘤胃挥发性脂肪酸含量。
1.3.3 瘤胃细菌菌群的分析测定 1.3.3.1 菌群DNA提取试剂菌群DNA采用试剂盒提取,试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
Buffer W2:在瓶内加入体积为56 mL的无水乙醇并混合均匀。
Buffer DV:按照2 mL Buffer DV-A与125 mL异丙醇和75 mL异丁醇的比例混合均匀。
溶菌酶:用50%的甘油溶解,使其浓度为50 mg/mL。
1.3.3.2 菌群DNA提取步骤1) 用2 mL的离心管收集1 mL OD600=1.0~1.5的瘤胃液,12 000×g离心30 s,弃上清加入150 μL的Buffer S悬浮液。
2) 将20 μL的溶菌酶贮存液加入步骤1)的离心管中,混合均匀,并室温下静置5 min。
3) 加入30 μL 0.25 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),混合均匀,冰浴5 min。
4) 加入450 μL Buffer G-A,漩涡振荡15 s,于65 ℃水浴10 min。
5) 加入400 μL Buffer G-B和1 mL Buffer DV混合均匀,12 000×g离心2 min。
6) 弃上清,保留沉淀和下相,加入1 mL Buffer DV混合均匀,12 000×g离心2 min。
7) 弃上相,将下相转移至滤器(滤器置于2 mL离心管中),12 000×g离心1 min。
8) 弃滤器,在滤液中加入400 μL的Buffer BV,混合均匀。
9) 将制备管置于2 mL离心管中,将步骤8)的液体转入制备管,12 000×g离心1 min。
10) 弃滤液,将制备管放入原2 mL离心管中,加入500 μL Buffer W1,12 000×g离心1 min。
11) 弃滤液,将制备管放到原2 mL离心管中,加入700 μL Buffer W2,12 000×g离心1 min,重复这个步骤。
12) 弃滤液,将制备管放回原2 mL的离心管中,12 000×g离心1 min。
13) 将制备管置于另一洁净的1.5 mL的离心管中,在制备管膜中加入150 μL洗脱液,室温静置1 min,12 000×g离心1 min,用于洗脱基因组DNA。
1.3.3.3 PCR扩增PCR扩增前用2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的纯度和浓度。取适量检测合格的样品于离心管中进行稀释,将稀释后的基因组DNA作为模板。DNA扩增目的片段为V3+V4区,大概长度468 bp,引物序列341F:3′-CCTAYGGGRBGCASCAG-5′;806R:3′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-5′[8]。
1.3.3.4 Illumina MiSeq测序测序服务由广州基迪奥生物科技有限公司提供,其测序采用MiSeq 2500 PE 250平台。
1.4 数据统计与分析数据采用Excel 2007进行初步处理,采用SAS 8.2软件中的完全随机设计的方差分析(one-way ANOVA)进行统计。数据由平均值±标准差表示。以P < 0.05作为差异显著判定标准,P < 0.01作为差异极显著判定标准。
2 结果与分析 2.1 MOS对高精料诱导的低乳脂奶牛瘤胃pH的影响由表 2可知,诱导组奶牛瘤胃pH较对照组极显著降低了8.89%(P < 0.01),添加MOS后奶牛瘤胃pH提高了8.78%,且差异极显著(P < 0.01),调控组瘤胃pH仍略低于对照组,但差异不显著(P>0.05)。
由表 3可知,与对照组相比,诱导组乙酸和丁酸的含量略有降低,差异均不显著(P>0.05);丙酸的含量显著增加了27.03%(P < 0.05)。调控组奶牛瘤胃中乙酸的含量较诱导组和对照组显著提高了14.97%、14.15%(P < 0.05);调控组奶牛瘤胃中丙酸的含量较诱导组显著降低了17.83%(P < 0.05),较对照组增加了4.37%,但差异不显著(P>0.05);调控组乙酸/丙酸较诱导组显著提高了37.04%(P < 0.05),较对照组提高了7.12%,但差异不显著(P>0.05)。
经Illumina Miseq测序结束后,除去低质量序列,通过序列拼接,应用Mothur根据97%的序列相似度,对序列进行OTU划分,对样品进行OTU的统计,见表 4,并根据OTU聚类分析结果,分析不同样品的聚类信息,依照其共有、特有的OTU信息绘制韦恩图,见图 1。诱导组奶牛瘤胃细菌OTU数要略低于对照组,但差异不显著(P>0.05);调控组奶牛瘤胃细菌OTU数较诱导组增加了8.72%,且差异极显著(P < 0.01),瘤胃细菌OTU数略高于对照组(P>0.05),说明高精料诱导奶牛会导致瘤胃细菌的总数降低,饲粮添加MOS可以提高奶牛瘤胃细菌的总数。
由表 5知,诱导组奶牛瘤胃菌群的ACE和Chao1指数均低于对照组(P>0.05),Shannon和Simpson指数均略低于对照组(P>0.05)。调控组奶牛瘤胃细菌的Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数均高于诱导组和对照组(P>0.05),说明饲粮添加MOS在一定程度上提高了高精料诱导的低乳脂奶牛瘤胃细菌的总数和多样性。
试验共检测到22个菌门(表 6),其中拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门(Proteobacteria)占到总菌的90%以上。与对照组相比,诱导组奶牛瘤胃中浮霉菌门(Planctomycetes)和放线菌门的丰度极显著增加(P < 0.01),分别增加了75.00%、125.00%;螺旋菌门(Spirochaetae)的丰度增加了37.97%(P < 0.05);软壁菌门(Tenericutes)和黏胶球形菌门(Lentisphaerae)的丰度均显著降低(P < 0.05),分别降低了39.29%、22.22%;其余菌门与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。
饲粮添加MOS使奶牛瘤胃中拟杆菌门的丰度降低,与诱导组相比差异显著(P < 0.05),但与对照组相比差异不显著(P>0.05);厚壁菌门的丰度较对照组和诱导组均显著增加(P < 0.05),且在瘤胃菌门中占比最高;Saccharibacteria的丰度增加,较诱导组显著增加(P < 0.05),其丰度较诱导组增加了123.26%,但与对照组相比差异不显著(P>0.05);纤维杆菌门(Fibrobacteres)的丰度较对照组和诱导组极显著增加(P < 0.01);梭杆菌门(Fusobacteria)的丰度与对照组和诱导组相比均显著增加(P < 0.05)。
2.3.3.2 属水平属水平上总共检测到389个菌属,由表 7可知,普雷沃氏菌属的占比最高,大概占到总菌属的40%。与对照组相比,诱导组瘤胃中普雷沃氏菌属_7(Prevotella_7)、普雷沃氏菌属_UCG-001(Prevotellaceae_UCG-001)、乳杆菌属(Lactobacillus)和乳球菌属(Lactococcus)的丰度极显著增加(P < 0.01),分别增加了1.60%、65.71%、1.20%和970.59%;真杆菌属_group(Coprostanoligenes_group)和密螺旋体属_2(Treponema_2)的丰度显著增加(P < 0.05),分别增加了55.56%和44.78%;肠球菌属(Enterococcus)和瘤胃菌属_UCG-010(Ruminococcaceae_UCG-010)的丰度极显著降低(P < 0.01),分别降低了95.52%和42.85%;克里斯滕森菌属_R-7_group(Christensenellaceae_R-7_group)和丁酸弧菌属_2(Butyrivibrio_2)的丰度显著降低(P < 0.05),分别降低了27.27%、37.14%。
与诱导组相比,饲粮添加MOS后奶牛瘤胃中丰度增加的菌属有普雷沃氏菌属_UCG-003(P < 0.01)、瘤胃球菌属_2(P < 0.01)、瘤胃球菌属_NK4A214_group(P < 0.01)、瘤胃球菌属_UCG-002(P < 0.01)、解琥珀酸弧菌属(P < 0.05)、真杆菌属(P < 0.01);丰度降低的菌属有普雷沃氏菌属_1(P < 0.01)、普雷沃氏菌属_7(P < 0.01)、乳杆菌属(P < 0.01)、乳球菌属(P < 0.01)和密螺旋体属_2(P < 0.05)。从结果中可以看出,MOS可以提高高精料诱导的低乳脂奶牛瘤胃中部分纤维降解菌的丰度,降低部分淀粉降解菌的丰度,降低产酸菌属的丰度,抑制部分致病菌的增殖。
2.4 菌群功能预测首先将KEGG数据库中已有基因组的原核生物16S rRNA序列与SILVA数据库中16S rRNA序列进行关联,然后将KEGG数据库已有的原核物种基因组进行序列打断,利用UProC对所有基因组的KO序列进行统计;最后利用16S的拷贝数对物种数目进行校正,最终实行KEGG预测以及KO丰度统计。由图 2可知,诱导组奶牛瘤胃中参与淀粉和蔗糖代谢的细菌菌群丰度要高于对照组,调控组奶牛瘤胃中参与淀粉和蔗糖代谢的细菌菌群丰度明显降低,说明饲粮添加MOS可以降低奶牛瘤胃对淀粉的降解速率。
在瘤胃细菌菌群门水平上,低乳脂奶牛瘤胃中拟杆菌门的丰度增加,拟杆菌可以分解多糖[7],李亚丹等[8]论述了拟杆菌VPI-5482具有ECF-typeσ因子,该因子可以使拟杆菌的基因表达受到环境因素的调节,拟杆菌基因组编码的外周蛋白SusC和SusD可以调节淀粉与细菌表面连接,达到降解淀粉的效果。添加MOS奶牛瘤胃中拟杆菌门的丰度较低乳脂奶牛显著降低,拟杆菌门丰度的降低,在一定程度上降低了瘤胃对淀粉的降解速率,对稳定奶牛瘤胃pH有一定的作用。厚壁菌门具有降解纤维素的功能。有研究表明,饲喂高谷物饲粮会导致厚壁菌门的丰度显著增加[9],但在本试验中,高精料诱导的低乳脂奶牛瘤胃中厚壁菌门的丰度较对照组并未发生显著的改变,厚壁菌门的丰度在添加MOS后显著增加,较低乳脂奶牛组提高了22.25%,而且奶牛瘤胃中厚壁菌门的丰度超过了拟杆菌门,厚壁菌门丰度的增加提高了纤维素的降解率,有研究证明,外源添加功能性MOS可以提高奶牛瘤胃中纤维素降解菌的活性和数量,改善瘤胃微生物区系[10-11],本研究中发现,添加MOS可以极显著增加纤维杆菌门的丰度,通过本研究可以总结出MOS可以提高瘤胃中厚壁菌门和纤维杆菌门的丰度,提高瘤胃中纤维素降解率,进而提高了牛奶的乳脂率。浮霉菌门是严格厌氧的革兰氏阴性细菌,刘冬英等[12]从制糖废水厌氧处理反应器的颗粒污泥中分离得到一株属于浮霉菌门的菌株,并发现该菌株可利用葡萄糖、麦芽糖、核糖等多种糖类作为唯一碳源,葡萄糖发酵的最终产物为乙酸和氢气,而且浮霉菌门与机体的健康有关系。刘志刚等[13]通过研究尼罗罗非鱼肠道菌群结构与链球菌病的相关性发现,健康尼罗罗非鱼的浮霉菌门的丰度显著低于发病组。本研究中高精料诱导的低乳脂奶牛瘤胃中浮霉菌门丰度的极显著增加,主要是由于在构建低乳脂奶牛模型过程中在奶牛的饲粮中添加玉米面,随着饲粮中淀粉含量占比增加,饲粮中碳水化合物含量增加,致使浮霉菌门的丰度增加。在低乳脂奶牛的饲粮中添加MOS之后浮霉菌门的丰度下降。
放线菌被认为是天然药物的重要来源之一,是由于放线菌能够产生丰富的活性物质,而且其代谢物质具有抗病毒、抗菌和抗肿瘤等活性,而且现如今发现的天然抗生素有2/3来源于放线菌,其被认为是新天然抗生素的重要来源[14-15]。本研究中在诱导乳脂下调的奶牛瘤胃中发现放线菌门的丰度显著增加,随着MOS的添加放线菌门的丰度略有降低。螺旋体门是一类很有特点的细菌,具有长的螺旋形盘绕的细胞。螺旋体门的密螺旋体属能与纤维素菌相互作用,可以参与纤维素的降解[16-17]。但同时螺旋体门的密螺旋体属可以引起猪痢疾[18]。倪莹等[19]通过16S rRNA高通量测序技术研究发现,重度牙周炎患者的唾液中含有较高的螺旋体门。在本研究中发现,高精料诱导的低乳脂奶牛瘤胃中螺旋体门的丰度较对照组显著增加,添加MOS后螺旋体门的丰度较低乳脂奶牛降低,这种现象极有可能是因为MOS可以调节奶牛瘤胃细菌菌群结构,既提高了奶牛瘤胃对纤维素的降解率,又调控了瘤胃细菌菌群结构的合理性。据报道,黏胶球形菌门与纤维二糖的降解有关[20-21],郭威等[22]研究发酵玉米秸秆对绵羊瘤胃菌群结构的影响发现,黏胶球形菌门和纤维杆菌门均为绵羊的优势菌群。本研究高精料诱导的低乳脂奶牛瘤胃中黏胶球形菌门的丰度较对照组显著降低,添加MOS可以增加黏胶球形菌门的丰度,说明饲粮中添加MOS可以缓解奶牛因饲粮淀粉含量过高而引起的瘤胃纤维降解菌下降的现象,可以提高瘤胃对纤维素的降解率。
在瘤胃细菌菌群属水平上,普雷沃氏菌属是奶牛瘤胃的优势菌属,普雷沃氏菌属具有多重功能和多种基因型,普雷沃氏菌属包含不同的菌种,不同的菌种在瘤胃中的功能也不尽相同,Purushe等[23]论述了布氏普雷沃氏菌和栖瘤胃普雷沃菌具有降解蛋白质、淀粉和寡糖的功能,同时也有研究发现了普雷沃氏菌属具有降解半纤维素的作用[24]。本试验中高精料诱导的低乳脂奶牛瘤胃中普雷沃氏菌属_7和普雷沃氏菌属_UCG-001的丰度较对照组均增加,普雷沃氏菌属是瘤胃中主要的耗氢菌属,可以通过丙烯酸和琥珀酸途径发酵糖类物质产生丙酸[25-26],奶牛在饲喂高精饲料导致亚急性瘤胃酸中毒(SARA)时,奶牛瘤胃中普雷沃氏菌属的丰度是正常奶牛的1.5倍[27],本试验诱导期奶牛瘤胃中丙酸的含量极显著增加也进一步验证了普雷沃氏菌属具有降解淀粉的能力。本试验研究发现,在低乳脂奶牛饲粮中添加MOS可以极显著降低普雷沃氏菌属_1和普雷沃氏菌属_7的丰度,同时通过对瘤胃细菌菌群功能预测发现,添加MOS可以明显降低参与淀粉代谢的菌群丰度。De Nardi等[28]研究发现,在高精饲粮中补充一定的有机酸和多酚可以降低短普雷沃氏菌(Prevotella brevis)的丰度,该研究表明适宜的饲粮添加剂可以降低瘤胃对淀粉的降解率。普雷沃氏菌属_1是瘤胃中普雷沃氏菌占比最多的菌属,普雷沃氏菌属_1丰度的极显著降低导致瘤胃对淀粉的降解作用降低,对维持瘤胃pH具有一定的作用,同时也降低了瘤胃中丙酸的含量。低乳脂奶牛饲粮添加MOS瘤胃中普雷沃氏菌属_UCG-001和普雷沃氏菌属_UCG-003的丰度均增加,其主要原因可能是普雷沃氏菌属_UCG-001和普雷沃氏菌属_UCG-003可以利用寡糖,MOS的添加为这2种菌属提供了更多的发酵底物,具体的原因还需要进一步的研究。本试验在饲粮中添加MOS可以提高低乳脂奶牛瘤胃中瘤胃球菌属的丰度,其中瘤胃球菌属_2、瘤胃球菌属_NK4A214_group和瘤胃球菌属_UCG-002的丰度均极显著的增加,瘤胃球菌属是瘤胃中主要的纤维降解菌,本研究还发现添加MOS可以极显著提高瘤胃中真杆菌属的丰度,显著提高解琥珀酸菌属的丰度。有研究发现,与半纤维素降解有关的丁酸弧菌属的丰度因瘤胃总淀粉的含量增加而降低[29],这与Petri等[30]的研究结果相一致,在本研究中,添加MOS对丁酸弧菌属_2丰度的降低并无缓解作用。乳球菌属和乳杆菌属是瘤胃中降解淀粉的主要菌属,本试验低乳脂奶牛瘤胃中这2类菌属丰度均出现大幅度的增加,乳杆菌属和乳球菌属丰度的增加可分解淀粉产生大量的乳酸,大量乳酸的堆积导致瘤胃pH的下降,致使瘤胃中许多纤维降解菌的增殖受到了限制,乳酸的大量生成也会导致乙酸的含量下降,乳脂的合成也受到了一定程度的限制。在本研究中检测到较高丰度的理研菌属RC9肠道群,高精料饲粮条件下,理研菌属的丰度增加。理研菌属RC9肠道群易受到饲粮结构的影响,Pitta等[31]研究发现,饲喂不同来源的干草显著影响理研菌属的丰度。以此推测MOS可以降低部分降解淀粉的普雷沃氏菌属的丰度,有利于瘤胃球菌属、真杆菌属和解琥珀酸菌属的增殖,提高瘤胃对纤维素的降解率,促进乙酸的合成,提高乳脂合成的前体物质。
4 结论低乳脂奶牛饲粮添加MOS提高了瘤胃纤维降解菌的丰度,提高了瘤胃对纤维素的降解率;降低了瘤胃中产酸菌种的增殖,对提高瘤胃pH具有积极的作用;同时抑制了瘤胃中一些致病菌的繁殖;但对半纤维降解菌丁酸弧菌属_2丰度的降低无缓解作用。对瘤胃菌群进行功能预测发现,低乳脂奶牛饲粮添加MOS降低了参与淀粉和蔗糖代谢的菌群丰度。
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