2. 甘肃农业大学动物医学院, 兰州 730070
2. College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China
益生菌具有调节肠道菌群、提供营养、提高免疫力、抗氧化和调节血压的功能[1]。在已发现的多种益生菌中，芽孢杆菌被证明具有较好的益生特性，其能够产生多种具有微生物活性、非致病性和无毒的抗菌物质，以及有较强的产芽孢能力，并具有耐热性和较长保质期的双重优势[2-3]；此外，芽孢杆菌在胃肠道低pH环境下的生存能力也已得到证实[4]，使其成为益生菌研究的热点。目前，在人类和动物上作为商业膳食补充剂、生长促进剂和竞争性排斥剂的芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、凝血芽孢杆菌、多发酵芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌[5]。研究证明芽孢杆菌种的益生菌潜力，如上皮定殖[6]、免疫刺激[7]和治疗胃肠道疾病的疗效[8]。Rdaci等[9]在C57BL/6J鼠细胞上进行了益生菌克劳氏芽孢杆菌菌株体外免疫调节特性的评价，证明菌株以其营养形式能够诱导诱导型一氧化氮合成酶活性提高、干扰素-γ(INF-γ)生成和CD4+ T细胞增殖。菌株坚强芽孢杆菌CX10(BF-CX10)是中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所采用培养基分离方法，从木食低等黄胸散白蚁肠道中分离纯化出的1株芽孢杆菌，其纤维素内切葡聚糖酶、滤纸酶、纤维素外切葡聚糖酶活性强，具有较强的纤维素降解能力。因此，为进一步探究该菌株作为动物饲料用益生菌应用于我国动物养殖业中的可能性，本试验开展了白蚁肠道源菌株BF-CX10对感染大肠杆菌O78小鼠体重、血清酶活性、相关免疫因子表达及肠道微生物变化影响的研究。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 菌株试验所用BF-CX10和大肠杆菌O78由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所保存。
1.1.2 主要试剂TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、TaKaRa反转录试剂盒以及TaKaRa Real Master Mix/SYBR购自大连宝生物工程有限公司；溶菌酶(LZY)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.1.3 主要试验仪器及设备细胞培养箱，Thermo Scientific，美国；低温冰箱，MDF-382，SANYO，日本；生物安全柜，HF safe-1500，力康生物医疗科技有限公司，中国；倒置显微镜，LEICA，德国；酶标仪，SpectraMax ® M2e，Molecular，美国；离心机3K15，Sigma，德国；定量PCR仪，iQ5，Bio Rad，美国。
1.2 试验方法 1.2.1 动物分组试验选用50只18~20 g雌性BALB/c小鼠，随机分为对照组、大肠杆菌自愈(ESH)组、低剂量BF-CX10(LBF)组、中剂量BF-CX10(MBF)组和高剂量BF-CX10(HBF)组，每组10只小鼠。试验时间1周。对照组小鼠全程灌胃生理盐水；ESH组小鼠前3 d灌胃大肠杆菌O78，后3 d灌胃生理盐水；BF-CX10组小鼠前3 d灌胃对应剂量的BF-CX10，后3 d用大肠杆菌O78灌胃，具体剂量见表 1。第7天处理各组小鼠。
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表 1 动物分组 Table 1 Grouping of animals |
最后1次灌胃24 h后，轻轻挤压小鼠腹部收集粪便，每组4~5 g，置于干燥无菌管中，-80 ℃保存；采用眼球采血，用10 mL抗凝管4 ℃保存，完成后转移到2.5 mL离心管，4 ℃ 3 500 r/min离心10 min，分离血清-80 ℃保存。将小鼠进行大体解剖，对每组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肾脏和胸腺进行称量，计算脏器指数。
1.2.3 小鼠血清酶活性检测各组小鼠收集血清样本进行非特异性免疫检测，血清LZY、ACP、AKP和GSH-Px活性测定依据试剂盒说明书进行。
1.2.4 总RNA提取和实时定量PCR检测将肾脏组织-80 ℃保存。取0.1 g肾脏组织放入1.5 mL EP管中，加入适量的磁珠和1 mL Trizol匀浆，12 000 r/min离心5 min，弃沉淀，加入200 μL氯仿振荡混匀后室温静置5 min；4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，吸取上层水相于新的EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀放置10 min，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，弃上清，RNA沉于管底；加入1 mL 75%乙醇混匀，4 ℃ 8 000 r/min离心5 min，弃上清，用50 μL RNase-free H2O溶解。将提取的总RNA用紫外分光光度计测定RNA浓度，根据A260/A280比值，判定RNA的纯度，比值在1.8~2.2则表明RNA纯度符合进一步试验的要求。用DNase-Ⅰ除去基因组DNA，用PrimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒合成cDNA，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)采用CFX96 Real-Time PCR Detection System的操作方法。根据GenBank中小鼠INF-γ、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-4、IL-10、IL-12及β-肌动蛋白(β-actin)的mRNA序列设计相关引物，引物序列见表 2。每个样品做3个平行，取平均值。相关因子的相对表达水平用2-ΔΔCt法计算，以小鼠β-actin基因作为内参。
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表 2 引物序列 Table 2 Primer sequences |
将采集的粪便用粪便基因组DNA提取试剂盒提取各组小鼠粪便样品中的微生物总DNA，于-80 ℃保存，对样品进行alpha多样性分析以及菌群构成分析。
1.3 统计学分析数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析和Duncan氏多重比较，结果以“平均值±标准误”表示，P＜0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 小鼠体重变化在试验期间，各组小鼠均无死亡，ESH组小鼠可明显观察到采食量下降、精神沉郁、活动量明显减少、呼吸加重并伴随腹式呼吸，90%的小鼠肛门红肿，周围黏有绿色稀便，眼睑红肿，部分有分泌物。其他各组小鼠在大肠杆菌攻毒后，采食量、精神、活动及粪便均无异常。进一步分析各组小鼠体重变化(图 1)后发现，ESH组小鼠灌胃前3 d体重迅速下降，最低为(16.12±0.05) g，比对照组低(4.73±0.02) g，与其他各组比较差异显著(P＜0.05)；LBF、MBF和HBF组小鼠与对照组小鼠相比，体重变化无显著性差异(P＞0.05)，小鼠体增重稳定，LBF组的体重略有下降。
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图 1 小鼠体重变化 Fig. 1 Weight changes of mice |
由图 2可知，与LBF、MBF和HBF组相比，ESH组小鼠心脏指数和肾脏指数显著降低(P＜0.05)；与对照组相比，ESH组小鼠心脏指数显著降低(P＜0.05)；各组小鼠肝脏指数、脾脏指数和胸腺指数无显著性差异(P＞0.05)。
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数据柱标注#表示与ESH组差异显著(P < 0.05)。下图同。 The marked # of data column indicated significant difference from ESH group (P < 0.05). The same as below. 图 2 小鼠脏器指数 Fig. 2 Visceral organ indices of mice |
取各组小鼠血清，检测大肠杆菌O78、BF-CX10对小鼠体液免疫的影响，整体来说，灌胃BF-CX10各组小鼠血清酶活性高于ESH组。由图 3可知，灌胃1周后，与ESH组相比，LBF、MBF和HBF组小鼠血清ACP和AKP活性显著提高(P＜0.05)，对照组小鼠血清ACP和AKP活性无显著性差异(P>0.05)；灌胃BF-CX10各组小鼠血清GSH-Px活性均显著高于ESH组(P＜0.05)；MBF和HBF组小鼠血清LYZ活性大于ESH组，但无显著性差异(P>0.05)；小鼠血清LYZ和ACP活性随BF-CX10菌株浓度提高而提高。
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图 3 小鼠血清酶活性 Fig. 3 Serum enzyme activity of mice |
由图 4可知，LBF、MBF和HBF组小鼠肾脏IFN-γ、IL-1β和IL-4 mRNA相对表达水平显著高于ESH组(P < 0.05)，LBF和HBF组小鼠肾脏TNF-α和IL-10 mRNA相对表达水平显著高于ESH组(P < 0.05)，LBF和MBF组小鼠肾脏IL-12 mRNA相对表达水平显著低于ESH组(P < 0.05)；小鼠肾脏IL-1β、IL-4和IL-12 mRNA相对表达水平随BF-CX10菌株浓度提高而提高。
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图 4 小鼠肾脏免疫相关细胞因子表达 Fig. 4 Expression of immune-related cytokines in kidney of mice |
由图 5-A可知，随着样品测序深度的增加，物种指数曲线趋于平缓，说明每个样本的测序深度足够反映该群落样本所包含的菌群多样性。图 5-B反映物种丰富度和均匀度，可看出随着操作分类单元(OTU)数量的增加，曲线趋于平缓，在横坐标跨度增大，说明样品的均匀度和丰富度达到很高的水平。
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A：稀释曲线dilution curve；B：Rank-Abundance曲线，每条曲线代表一个样本Rank-Abundance curve, each curve represented a sample。 C1~C10:对照组control group；ESH1~ESH10:ESH组ESH group；LBF1~LBF10:LBF组LBF group；HBF1~HBF10:HBF组HBF group。下图同the same as below。 图 5 样品多样性分析 Fig. 5 Sample diversity analysis |
由图 6-A可知，通过Wilcoxon秩和检验，发现测得的物种数在ESH组和HBF组之间具有显著的差异(P＜0.05)，测得的物种数在其他组间差异不显著(P>0.05)；由图 6-B可知，Shannon指数在ESH组和HBF组之间具有显著的差异(P＜0.05)，在其他组间差异不显著(P>0.05)。
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图 6 小鼠粪便菌群多样性变化 Fig. 6 Variation of fecal flora diversity of mice |
由图 7可知，所有OTU划分为10个门，变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和软壁菌门(Tenericutes)占序列总数的99.83%，其中变形菌门占40.3%，厚壁菌门和拟杆菌门分别占42.3%和12.3%，其余是放线菌门(Actinobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、未经识别的细菌(unidentified bacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和浮霉菌门(Planctomycetes)占0.1%，还有0.1%其他门类。不同组别的小鼠粪便菌群结构在门水平上的相对丰度差异显著(P < 0.05)，LBF和HBF组以拟杆菌门和厚壁菌门为优势菌群，对照组和ESH组以变形菌门和厚壁菌门为优势菌群；变形菌门相对丰度在LBF和HBF组与对照组和ESH组之间具有显著差异(P < 0.05)，厚壁菌门相对丰度在HBF组中最高。
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图 7 BF-CX10对小鼠粪便菌群门水平上相对丰度的影响 Fig. 7 Effects of BF-CX10 on relative abundance of fecal flora in mice at phylum level |
由图 8可知，OTU划分为占比较大的10个科是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、动球菌科(Planococcaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、Muribaculaceae、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)和疣微菌科(Ruminococcaceae)，其中对照组组肠杆菌科、乳杆菌科和葡萄球菌科的相对丰度为39.10%、10.01%和17.02%，ESH组分别为64.50%、19.10%和1.12%，经BF-CX10干预后分别为23.30%、23.70%和0.04%。
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图 8 BF-CX10对小鼠粪便菌群科水平上相对丰度的影响 Fig. 8 Effects of BF-CX10 on relative abundance of fecal flora in mice at family level |
根据样品在数据库中的功能注释及丰度信息，选取丰度排名前35的功能及每个样品中的丰度信息热图。由图 9可知，单个样品中功能类聚以人类疾病(human diseases)为主；在不同的分组中HBF组功能类聚以新陈代谢(metabolism)为主，LBF组以未知分类(unclassified)为主，ESH以细胞转化(celluar processes)为主，对照组以未知分类为主，但是环境信息处理(environmental information processing)的功能类聚也出现上调。
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图 9 BF-CX10对关键物种的影响 Fig. 9 Effects of BF-CX10 on key species |
由图 10可知，3组不同健康状态的样品与对照组交叠均不明显，HBF组与对照组完全分开，说明相比较于其他因素，BF-CX10对小鼠菌群结构调节作用较为明显，此外每个分组在横坐标轴上较为集中及主成分1(PC1，贡献率47.95%)方向尤为明显，说明HBF组和LBF组对ESH组干扰明显。在主成分(PC2)方向集中不明显，贡献率为17.08%，ESH组距离HBF组、LBF组和对照组越来越远，说明BF-CX10对小鼠肠道菌群具有平衡作用。
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图 10 主成分分析 Fig. 10 PCA |
芽孢杆菌具有良好的促生长作用和免疫调节作用，并且能够抵抗肠道致病细菌的感染[10]。益生性体内试验是对机体生长性能和免疫指标以及肠道微生物进行有效评价。本试验以小鼠作为试验动物，测定每日体重变化、血清酶活性、相关免疫因子表达和高通量测序粪便微生物作为评价指标。结果表明，在不同的动物试验分组中，BF-CX10灌胃组体增重明显，与ESH组相比体重变化具有显著性差异，由此可知BF-CX10在小鼠肠道占位明显以及抑菌效果较好。
LYZ作为微生物入侵的屏障，能够降解细菌细胞壁中的肽聚糖，导致革兰氏阳性菌的快速死亡，也是先天免疫系统的重要防御分子[11]。本试验中，BF-CX10对小鼠血清LYZ活性的影响不显著，可能由于剂量依赖效应，BF-CX10在适当的剂量下才能够刺激LYZ活性。ACP是一种定位于溶酶体内的酶，对细胞内吞噬抗原消化具有重要作用，已被用作哺乳动物模型和无脊椎动物巨噬细胞活化的标志物[12]。AKP是一种细胞外酶，水解各种有机化合物如蛋白质、磷脂和碳水化合物中的磷酸酯[13]。BF-CX10灌胃组小鼠血清ACP和AKP活性与ESH组相比呈显著性提高。庞清刚等[14]研究同样表明添加植物乳杆菌LL11与对照组相比，血清ACP和AKP活性较高。GSH-Px参与抗氧化防御系统，具有清除自由基和其他活性氧、加速自由基清除、减少脂质过氧化的发生等方面的作用[15]。在本试验中BF-CX10灌胃组与ESH组相比，小鼠血清GSH-Px活性显著提高。
本试验研究表明，与ESH组相比，BF-CX10灌胃1周后小鼠肾脏IFN-γ和TNF-α mRNA相对表达水平显著上调。Hamdan等[16]研究表明饲喂植物乳酸菌AH 78使得尼罗罗非鱼肝脏IFN-γ表达上调。饲喂添加2-羟基1, 4-萘醌西瓦氏菌的草鱼IL-1β和TNF-α表达显著升高[17]。本试验还表明，与ESH组相比，灌胃BF-CX10能显著提高小鼠肾脏IL-4和IL-10 mRNA相对表达水平，而显著降低小鼠肾脏IL-12 mRNA相对表达水平。BF-CX10对IL-10和IL-12的不同调节作用可能与这2种细胞因子的不同生物活性有关。Wang等[18]研究表明枯草芽孢杆菌PB6在人免疫能力强的外周血单核细胞中诱导了大量的IL-10，但IL-12水平非常低。
本试验通过小鼠粪便16S rRNA基因测序，对菌群进行整体分析，试验结果显示不同分组的菌群均匀度和丰富度较好，可以满足测序要求。粪便菌群测序多样性表明，测得的物种数在ESH和HBF 2组间具有显著的差异，说明BF-CX10对小鼠菌群的恢复有明显的作用。刘彩虹等[19]研究植物乳杆菌对肠道菌群失调的影响，结果显示益生菌对肠道菌群恢复作用明显。本试验物种注释结果显示，在门水平上，LBF和HBF组以拟杆菌门和厚壁菌门为优势菌群，其中厚壁菌门主要为芽孢杆菌科和乳杆菌科，而芽孢杆菌主要作用是维持动物肠道健康。菌群功能预测结果显示，HBF组功能类聚以新陈代谢为主，并且有所上调。根据试验各组小鼠粪便菌群含量和丰度变化可知，BF-CX10对肠道菌群具有维持平衡和恢复的作用，并且在一段时间内可以增加益生菌数量和菌群丰富度。
4 结论本研究发现，BF-CX10可预防小鼠腹泻, 维持正常体增重，提高血清酶活性和免疫功能，并对肠道微生物种群恢复具有显著作用。
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