2. 湖南畜禽安全生产协同创新中心, 长沙 410128
2. Hunan Co-Innovation Center of Animal Production Safety, Changsha 410128, China
随着畜牧生产由“数量型”向“质量型”的转变，“肠道健康”的概念引起了营养学家和兽医的极大兴趣[1]。如今农场的集约化养殖对动物健康和福利影响巨大，2020年又将全面实施禁抗，这无疑对动物健康尤其是胃肠道健康来说是一个挑战。完整的肠道黏膜组织形态、平衡的肠道微生物区系及健全的肠道免疫防御功能可为畜禽的健康生长及优质生产奠定基础[2]。
生物标志物是一种可用于测量和评估客观现象的生物学指标，能够诊断疾病，确定疾病发展倾向。胃肠道生物标志物可监测动物胃肠道疾病的发展和严重程度，它们的浓度能够直观、迅速、准确地反映动物胃肠功能的好坏。根据胃肠道生物标志物的来源可分为侵入性和非侵入性2种，由动物胃肠道自身产生分泌的为非侵入性生物标志物，相反，为侵入性生物标志物。随着新技术的迅速发展，国内外学者对胃肠道微生物群和胃肠道免疫这2个领域的生物标志物的研究取得一定成果，本文旨在对上述2个领域的生物标志物进行综述，并对其与动物胃肠功能的关系进行分析与讨论，以期为提高动物健康、福利和生产性能提供参考依据。
1 胃肠道微生物群生物标志物胃肠道微生物群被称为“第五器官”，能接收环境中的信号，并将这些信息传递给动物机体，具有调节多种生理功能的作用，如消化吸收、免疫系统发育和预防感染等[3-5]，对机体的健康起着至关重要的作用[6]。
胃肠道微生物与宿主竞争营养物质，代谢产物包括短链脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFA)、支链脂肪酸(branched-chain fatty acid，BCFA)、氨、胺和气体(包括氢气、甲烷和硫化氢)[7]。其中，SCFA可以在一定程度上降低肠道pH，从而抑制适宜生存pH比肠道益生菌高的病原微生物的活力，同时，还有利于提高肠道消化酶的活性。SCFA包括乙酸、丙酸、丁酸、乳酸及琥珀酸等，主要来自结肠内碳水化合物发酵和蛋白质降解，血液、粪便、食糜和尿液中这些代谢产物的浓度能够很好地反映胃肠道健康程度；氢气、甲烷、二氧化碳、氮氧化物及硫化氢等气体以及许多挥发性有机化合物均来源于胃肠微生物发酵过程，可反映肠道微生物群关键代谢途径的代谢结果[8]。这些气体还可通过自由扩散进入宿主血液[9]，所以可通过鉴定畜禽血样、尿液和粪便中的这些生物标志物的浓度来推断动物的胃肠道健康状况。
胃肠道微生物群生物标志物主要有乳酸、对甲酚、吲哚、琥珀酸、氨和硫化氢等。表 1中总结了这些生物标志物的种类与功能。
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表 1 胃肠道微生物群生物标志物的种类与功能 Table 1 Types and functions of biomarkers for gastrointestinal microbiota[10] |
在动物的胃肠道中乳酸和琥珀酸的浓度特别低，是因为它们通常代谢成了乙酸、丙酸和丁酸。相关研究表明琥珀酸参与多种代谢途径，包括平衡氧化还原反应和调节炎症，比如：在接受抗生素治疗及消化不良的腹泻仔猪粪便中乳酸和琥珀酸的浓度都有所增加[11]；小鼠经琥珀酸灌肠后表现出肠黏膜糜烂和黏膜下层水肿，继而可诱发结肠炎[12]。猪血浆中D-乳酸浓度升高与肠液分泌量增加和细菌异位有关；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)应激模型在动物试验中应用广泛，可导致肉鸡血浆中D-乳酸浓度呈明显上升趋势[13]，LPS免疫应激使断奶仔猪血浆D-乳酸含量[(920.90±35.10) μg/L]相对于生理盐水对照组[(705.10±23.03) μg/L]提高了29.57%[14]。可见当肠道黏膜受损伤时，动物机体肠道的通透性增加[15]，从而使血浆中D-乳酸浓度迅速上升[16]，说明动物血浆D-乳酸浓度可以反映肠道的通透性，所以乳酸和琥珀酸可作为生物标志物来改善动物的饲养管理。
1.2 对甲酚和吲哚芳香族氨基酸经肠道微生物发酵后可产生对甲酚、吲哚等酚类化合物，这些代谢产物可被胃肠道黏膜迅速吸收，并从尿液中排出[17]。对甲酚可通过抑制结肠上皮细胞的增殖和呼吸，从而降低细胞ATP含量、增加DNA损伤，对结肠上皮细胞产生负面影响[18]；当对动物进行高蛋白质饲粮饲喂时，其结肠中对甲酚的浓度增加[19]；当饲喂富含抗性淀粉或益生菌的饲粮时，其结肠中对甲酚的浓度降低[20]；Muszyńska等[21]和Zelante等[22]研究发现吲哚类化合物具有杀菌活性，可降低肠道炎症所带来的损伤，并且在一些患有胃肠疾病的畜禽粪便中也发现了吲哚类化合物浓度的下降。对甲酚、吲哚浓度的测定为学者监测动物胃肠道功能提供了便利，可作为生物标志物反映动物胃肠道健康程度。
1.3 氨畜禽对蛋白质的需求实质是对氨基酸的需求。在饲养畜禽的过程中，人们往往给予超过动物机体实际营养需要的高蛋白质饲粮[23]，这些高蛋白质中的氨基酸在大肠微生物的作用下发酵产生氨气(NH3)，而NH3很容易通过肠上皮细胞吸收进入血液循环，对肠细胞产生毒性作用[24]。饲粮蛋白质含量高不仅增加了氨的排放量，对环境造成影响，还会增加动物胃肠道、肝脏、肾脏的负担[25]。而低蛋白质饲粮的消化吸收效果更好，能够抑制有害菌的快速繁殖，减少疾病发生[26]。有研究表明，高硫饲粮饲喂的猪回肠组织炎症相关基因上调，粪便NH3浓度由81.9 μmol/g下降到45.9 μmol/g[27]；猪粪中氨氮含量的高低直接关系到猪粪中NH3的挥发量，在育肥猪的基础饲粮中添加1%的Z-27菌剂后，猪粪平均氨氮含量(3.01 g/kg)比对照组(8.81 g/kg)降低65.83%，说明Z-27菌剂能够极显著降低猪粪中NH3的含量[28]。动物体内微生物的存在影响着动物血液中NH3含量的变化，根据动物粪尿中NH3的含量，可以了解到其微生物发酵的情况，进而对合理化饲粮的配方设计起到指导作用。
1.4 硫化氢胃肠中的微生物(如沙门氏菌、幽门螺旋杆菌等)通过对含硫有机物(L-半胱氨酸)及硫酸盐的分解和还原可产生硫化氢，这一过程也是硫化氢来源的主要途径[29]。文献表明硫化氢可通过提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性，清除氧自由基，降低肠上皮细胞氧化损伤水平；同时，硫化氢还可以通过抑制核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)减少白细胞介素-1β(IL-1β)mRNA的表达，显著促进炎症的消退和组织损伤的修复[30]，保护胃黏膜的完整性[31]。Zhao等[32]发现，硫化氢可以削弱小鼠肠细胞的炎症反应，减轻黏膜损伤；吴忠明等[33]发现，硫化氢可有效地降低小肠缺血-再灌注损伤大鼠血炎症因子，改善内毒素血症；如果抑制硫化氢的合成，则会加剧大鼠肠黏膜损伤和炎性反应。那么，硫化氢可作为动物胃肠生物标志物来初步诊断炎症程度。然而，张夏薇等[34]通过使用高浓度硫氢化钠(NaHS，硫化氢供体)处理Caco-2细胞，结果显示，其显著上调了肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因表达水平。大量试验结果表明，低浓度硫化氢能够增强肠上皮细胞活力，提高氧化应激水平，降低炎症和肠道功能障碍；高浓度硫化氢反而会上调促炎因子的表达，影响细胞免疫应答，同时诱导肠上皮细胞氧化应激，对肠道健康造成不利影响，因此，对胃肠硫化氢最佳浓度的研究有待进一步深入。
广义来讲，凡是对宿主健康有益的活的微生物都称为益生菌[35]。随着人们对肠道微生态平衡的探索，发现益生菌往往是对肠道营养物质的摄取占主导地位的，它们在一定程度上能够起到抗生素的作用，干扰致病菌在肠黏膜的感染，维持和稳定胃肠道屏障功能[36]。益生菌在各种胃肠道疾病中得到了广泛研究，发现其对急性感染性腹泻、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、功能性胃肠疾病和坏死性肠炎等均有效。但是胃肠道微生物发酵产物的种类和比例受到动物机体自身代谢和饲料类别的极大影响，且益生菌对动物机体微生物群代谢物的作用和调控机理的研究尚待完善，从而使微生物生物标志物在监测动物胃肠道功能的实际应用中具有限制性。
2 胃肠道免疫生物标志物肠道不仅是所有营养物质消化吸收的最终场所，还因70%以上的免疫细胞都位于胃肠道而被称为动物体内最大的免疫器官[37]。胃肠道黏膜是隔绝外界抗原与病原体的屏障[38]，胃肠道屏障在将肠道内容物与宿主分离的同时，也是宿主与胃肠道内容物之间进行物质交换和信息交流的场所。肠道上皮细胞的功能依赖于完整的肠黏膜，肠黏膜与免疫系统之间稳态的平衡对动物的健康和生存至关重要。
胃肠道炎症和免疫功能的生物标志物可以提供胃肠道与环境相互作用的重要信息，以及胃肠道屏障功能的运转情况。当肠道出现炎症时，肠黏膜的结构难免遭受损伤，继而影响肠道功能，对畜禽健康造成威胁，因此，通过比较健康动物与致炎动物之间的病理差异来寻找生物标志物是有效且可行的[39]。
胃肠道免疫生物标志物主要有再生胰岛衍生蛋白、G蛋白偶联受体31(G protein-coupled receptor 31，GPR31)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、嗜酸性粒细胞蛋白X(eosinophil-peroxidase，EPX)、LPS、细胞因子和分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，sIgA)等。表 2中总结了这些生物标志物的种类与功能。
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表 2 胃肠道免疫生物标志物的种类与功能 Table 2 Types and functions of biomarkers for gastrointestinal immune status[10] |
再生胰岛衍生蛋白属于抗菌蛋白[40]，在生物体的胰腺、空肠、回肠和十二指肠等组织[41-43]上皮细胞中均有表达，可在肠内产生、储存和分泌，被称为“肠道上皮的看门人”。诱导表达和杀菌活性使其对肠道致病菌具有先天免疫效应。猪空肠被产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)感染后，再生胰岛衍生蛋白在局部抗菌反应里表现为过度表达[44]。大量试验结果表明在炎症、细菌或肠黏膜损伤[45]等刺激下，不仅表现为肠绒毛高度降低、隐窝深度增加，小肠再生胰岛衍生蛋白表达水平也会明显升高，尤其是回肠中表达最为丰富，且与严重程度呈正比，由此可推断再生胰岛衍生蛋白可以作为一种非侵入性的生物标志物。但是，再生胰岛衍生蛋白在细菌肠道感染中的作用还没有完全被了解，特别是对急性腹泻感染结束时的缓解期以及病原体如何最终从肠道腔内清除知之甚少，有待进一步探索。
2.2 GPR31最新报道表明，G蛋白偶联受体(G protein coupled-receptor，GPCR)家族在巨噬细胞表面的特异性受体GPR31蛋白可被酸性条件激活，进而促进巨噬细胞产生树突来“捕获”抗原[46-47]，这个酸性条件可由肠道菌群产生的代谢产物——乳酸和丙酮酸来提供。研究发现，缺乏GPR31蛋白的小鼠在酸性条件下表现出CX3CR1+巨噬细胞树突的产生量减少；当感染毒力较强的沙门氏菌菌株时，经过酸处理的正常小鼠比没有经过预处理的GPR31蛋白缺陷小鼠免疫反应增强，存活率明显上升[42]。GPR31蛋白有望成为激活免疫的新靶标，现阶段其可作为肠道功能的生物标志物来反映动物机体面对“抗原”进行免疫反应的能力。
2.3 MPO和EPXMPO为抗中性粒细胞胞浆抗体(anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)识别的主要抗原之一[48]，是中性粒细胞活性的特异性标志物[49]。哺乳动物的MPO活性与中性粒细胞的数量呈正相关，通过测量组织MPO活性可以评估肠道炎症的程度[50]。处于热应激下猪回肠中性粒细胞浸润的水平可由通过对MPO活性的测量来评估[51]；在右旋糖酐硫酸钠诱导的仔猪结肠炎模型中，肠道MPO活性由(234±25) mU/g显著增加到(361±32) mU/g[52]；2, 4, 6-三硝基苯磺酸(2, 4, 6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)和大肠杆菌(Escherichia coli)均可引起小鼠结肠炎，使结肠MPO活性显著增加[53]；人类婴儿肠道炎症与MPO活性提高有关[54]。
嗜酸性粒细胞是位于胃肠道固有层的促炎症白细胞，大量文献表明，胃肠道的许多炎症都表现为嗜酸性粒细胞活性增加[55]。嗜酸性粒细胞受到刺激后会分泌许多具有毒性的炎性分子，可导致组织损伤和细胞膜通透性增加。随着炎症反应的进行，粪便中EPX的含量由0.12~0.82 μg/g显著升高到0.42~1.70 μg/g[56]。粪便EPX和MPO分别被认为是研究胃肠道炎症的最佳嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞标志物。
2.4 LPSLPS是革兰氏阴性细菌外膜的组成部分[57]。低剂量LPS的毒性弱于黏附素和肠毒素[58]，但高剂量LPS经腹腔注射后，可导致机体胃肠黏膜上皮组织通透性增加[59]，促炎细胞因子[60-61]大量释放，严重威胁动物健康。目前研究发现，在细菌感染的动物试验中，IL-1β、白细胞介素-6(IL-6)、TNF-α等由促炎细胞因子所释放的分子可降低肠道的免疫屏障功能[62]；在以肠道通透性增加为特征的小鼠结肠炎模型中，血液LPS浓度由0.23 ng/mL显著升高到0.87 ng/mL[63]；在仔猪中，LPS刺激可降低空肠上皮淋巴细胞数目[64]，显著提高空肠固有层细胞密度[65]；猪粪便中LPS的浓度低于结肠食糜中LPS的浓度，这表明LPS在运输过程中会被代谢[66]；奶牛的瘤胃酸中毒可导致粪便中LPS浓度由2.80 μg/g显著增加到14.34 μg/g[67]。还有大量类似试验表明，动物肠道免疫应激可增加粪便LPS浓度。因此，LPS可作为可靠的生物标志物来反映动物机体胃肠道健康状况。
2.5 细胞因子细胞因子能够在细胞间传递信息[68]，具有免疫调节和效应功能[69]。黏膜免疫失调往往造成促炎、抗炎因子平衡的失调，引起白细胞介素-1(IL-1)、IL-6、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-12(IL-12)、TNF-α和干扰素-γ(IFN-γ)等促炎因子表达增加，白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)和白细胞介素-11(IL-11)等抗炎因子表达减少[34]。促炎细胞因子可诱导紧密连接蛋白的内吞机制，导致肠道通透性的增加[70]。ETEC K88攻毒使金华猪回肠促炎细胞因子IFN-γ水平由68.77 pg/mL极显著升高到120.44 pg/mL，TNF-α水平由96.75 pg/mL显著升高到107.46 pg/mL，抗炎细胞因子IL-4水平则由81.80 pg/mL显著降低到67.58 pg/mL[71]；对于溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)患者来说，其血清和肠黏膜中白细胞介素-18(IL-18)表达量显著高于健康人群[72]，且其含量与炎症严重程度呈正相关[73]；粪便钙卫蛋白、粪便免疫化学测试、粪便乳铁蛋白、C-反应蛋白、高迁移率族蛋白B1等标志物都与UC的黏膜愈合有关[74]。抗炎细胞因子IL-4、IL-10和转化生长因子-β(TGF-β)等在控制炎症反应的持续时间及严重程度[69]和抑制促炎细胞[75]产生方面发挥重要作用。由于细胞因子在机体的循环保存时间限制在几个小时之内，因此，当以动物粪便中细胞因子水平作为肠道炎症非侵入性生物标志物时，还要考虑降解对所测水平的影响。
2.6 sIgAsIgA在此尤指外分泌液中由胃肠道黏膜固有层的浆细胞产生和分泌的抗体[76]，是抵御肠毒素和病原微生物[77]进入的第1道防线。肠腔中的sIgA可结合病原体和毒素，抑制肠道组织非炎症反应的过程[78]。Gao等[71]的试验结果表明经ETEC K88攻毒后的猪粪便sIgA水平升高，其可导致细菌易位，并最终引发炎症级联反应，继而抑制肠道微生物的过度生长[79]；在感染大肠杆菌的仔猪的饲粮中添加抗菌肽可使肠道sIgA的浓度由167.8 μg/mL显著增加到185.4 μg/mL[80]；饲喂益生菌的肉鸡粪便中sIgA浓度显著升高[81]；饲喂索氏乳杆菌的仔猪在接受ETEC刺激1周后，粪便sIgA水平升高[82]。因此，监测粪便sIgA可为监测动物胃肠道免疫和健康状况提供帮助。
3 小结胃肠道生物标志物可反映动物胃肠健康状况和胃肠疾病发展及严重程度。动物胃肠道微生物及其代谢产物对调控胃肠道功能发挥着关键作用；胃肠道炎症和免疫功能的生物标志物可以提供胃肠道与环境相互作用的重要信息，以及胃肠道屏障功能的运转情况。现阶段存在的问题是非侵入性的生物标志物对动物机体影响较小，而侵入性的生物标志物往往需要牺牲动物来采集样本，增加了生产成本也不利于动物福利；此外，很多胃肠道生物标志物所折射出的是采样时间的问题，具有时效性，而可以在同一动物身上长期测量、对胃肠功能进行纵向评估的胃肠道生物标志物很少。
致谢:
感谢湖南农业大学动物科学技术学院薛俊敬博士和刘波硕士对文稿所提的宝贵意见。
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