动物营养学报    2019, Vol. 31 Issue (12): 5493-5499    PDF    
饲粮添加异亮氨酸对轮状病毒攻毒断奶仔猪回肠屏障功能的影响
毛湘冰 , 古长松 *, 陈代文 , 余冰 , 何军 , 郑萍 , 虞洁 , 罗钧秋 , 罗玉衡     
四川农业大学动物营养研究所, 动物抗病营养教育部重点实验室, 农业农村部动物抗病营养与饲料重点实验室, 动物抗病营养四川省重点实验室, 成都 611130
摘要: 本研究旨在探讨饲粮添加异亮氨酸是否可以缓解轮状病毒(RV)感染对断奶仔猪回肠屏障功能的影响。在细胞试验中,用8 mmol/L的L-异亮氨酸处理IPEC-J2细胞24 h;在动物饲养试验中,选取28头健康的21日龄断奶的"杜×长×大"仔猪,采用2×2双因子设计,即饲粮处理(添加1%L-异亮氨酸饲粮或添加0.68%L-丙氨酸饲粮)和RV攻毒(灌服RV或无菌培养液),RV攻毒于试验第15天早上进行。试验期为18 d。结果表明,L-异亮氨酸处理提高了IPEC-J2细胞中黏液蛋白2(mucin 2)、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)和闭合蛋白(occludin)的mRNA相对表达量(P < 0.05);RV攻毒提高了断奶仔猪平均腹泻指数和血清二胺氧化酶活性(P < 0.05),提高了回肠黏膜中RV的非结构蛋白4阳性率,降低了断奶仔猪回肠黏膜中mucin 2、ZO-1和occludin mRNA相对表达量(P < 0.05);而饲粮添加异亮氨酸缓解了RV攻毒对断奶仔猪平均腹泻指数、血清二胺氧化酶活性和回肠黏膜mucin 2、ZO-1和occludin mRNA相对表达量的影响(P < 0.05),降低了回肠黏膜中RV的非结构蛋白4阳性率。综上所述,在断奶仔猪的饲粮中补充1%异亮氨酸可以预防RV诱导发生的腹泻,而这一作用与其可改善回肠屏障功能有关。
关键词: 异亮氨酸    IPEC-J2细胞    断奶仔猪    轮状病毒    回肠屏障功能    
Effects of Dietary Isoleucine on Ileal Barrier Function of Weaned Piglets Challenged by Rotavirus
MAO Xiangbing , GU Changsong *, CHEN Daiwen , YU Bing , HE Jun , ZHENG Ping , YU Jie , LUO Junqiu , LUO Yuheng     
Key Laboratory of Animal Disease-Resistant Nutrition of Sichuan Province, Key Laboratory of Animal Disease-Resistant Nutrition and Feed of Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Key Laboratory for Animal Disease-Resistance Nutrition of Ministry of Education, Institute of Animal Nutrition, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China
Abstract: This experiment was conducted to determine whether dietary isoleucine alleviated the effects of rotavirus (RV) infection on ileal barrier function of weaned piglets. In cell culture experiment, IPEC-J2 cells were treated by 8 mmol/L L-isoleucine for 24 h. In animal breeding experiment, twenty-eight healthy crossbred (Duroc×Landrace×Yorkshire) piglets weaned at 21 days of age were used in a 2×2 factorial design. The trial factors included diet treatment (adding 1% L-isoleucine diet or adding 0.68% L-alanine diet) and RV challenge (infusing RV or sterile culture solution). On day 15, RV challenge was carried out. The trial duration was 18 days. The results showed that L-isoleucine treatment increased mRNA relative expression of mucin 2, zonula occludens-1 (ZO-1) and occludin in IPEC-J2 cells (P < 0.05). RV challenge increased average diarrhea index and serum diamine oxidase activity (P < 0.05), enhanced RV nonstructural protein 4 positive rate in ileal mucosa, and reduced mRNA relative expression of mucin 2, ZO-1 and occludin in ileal mucosa of weaned piglets (P < 0.05). Dietary isoleucine relieved the effects of RV challenge on average diarrhea index, serum diamine oxidase activity, and mRNA relative expression of mucin 2, ZO-1 and occludin in ileal mucosa (P < 0.05), and decreased RV nonstructural protein 4 positive rate in ileal mucosa of weaned piglets. These results suggest that dietary 1% isoleucine can prevent the RV-induced diarrhea, which is associated with the improvement of ileal barrier function of weaned pigs.
Key words: isoleucine    IPEC-J2 cells    weaned piglets    rotavirus    ileal barrier function    

异亮氨酸是一种支链氨基酸,也是动物机体的一种必需氨基酸。由于其在调节人和动物一些生理功能(如蛋白质代谢、脂肪酸代谢、葡萄糖转运和免疫等)过程中发挥着重要的作用,因此,异亮氨酸也是一种功能性氨基酸[1]。且本团队前期的研究表明,异亮氨酸处理可激活肠上皮细胞系(IPEC-J2)和肺泡巨噬细胞系(3D4/31)中抗原识别受体的表达,进而提高抗病毒细胞因子和抗菌肽的表达;且饲粮补充异亮氨酸也可改善断奶仔猪免疫功能[2]。但异亮氨酸是否可改善仔猪肠道屏障功能还尚未见报道。

轮状病毒(rotavirus, RV)是呼肠孤病毒科的一种双链RNA病毒,其特征是引起严重胃肠炎,是导致幼龄动物和婴幼儿腹泻的主要病毒性病原之一;流行病学表明,仔猪对RV极为易感,且死亡率高;RV易感部位主要集中在小肠,除了影响肠道免疫功能外,还会损伤肠道的屏障功能[3-6]。本团队前期的研究已表明,饲粮添加异亮氨酸缓解轮状病毒诱导的断奶仔猪腹泻和生长性能降低与提高的免疫功能有关[2]。但这是否与其改善肠道屏障功能有关有待于进一步研究。因此,本研究通过体内和体外试验结合的方法,考察异亮氨酸处理对肠道屏障功能的影响及其对RV感染仔猪肠道屏障功能的缓解作用,以期进一步探索异亮氨酸的作用,这将为完善异亮氨酸的营养生理作用,并为其在动物生产上的应用和推广提供试验支撑。

1 材料与方法 1.1 试验材料

L-异亮氨酸(饲料级):购于赢创(中国)工业股份公司,纯度>98.5%;L-异亮氨酸(生化试剂):购于Sigma-Aldrich公司,纯度>98.5%;L-丙氨酸(饲料级):购于赢创(中国)工业股份公司,纯度>98.5%;RV:OSU(G5P9)毒株(ATCC#VR-893),购自国家兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.2 细胞试验 1.2.1 细胞培养与处理

DMEM/F12培养基和胰岛素-转铁蛋白-硒(insulin-transferrin-selenium,ITS)试剂购买于美国Lonza公司,双抗和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购买于美国Atlanta生物公司。

IPEC-J2细胞(猪肠上皮细胞)系由美国俄克拉荷马州立大学(Oklahoma State University)的张国龙教授赠予。在细胞复苏后,IPEC-J2细胞以2.5×105个/孔接种于含有完全培养基(DMEM/F12培养基中添加10%FBS、1%双抗和0.2%ITS)的6孔板中,经过20 h的培养,进行8 mmol/L的L-异亮氨酸处理24 h(n=6),收集细胞。

1.2.2 IPEC-J2细胞中黏液蛋白和紧密连接蛋白的mRNA相对表达量

IPEC-J2细胞中黏液蛋白1(mucin 1)、黏液蛋白2(mucin 2)、闭锁小带蛋白-1(zonula occludens 1, ZO-1)和闭合蛋白(occludin)的mRNA相对表达量,采用实时荧光定量PCR技术测定,具体方法参考Mao等[7]

1.3 动物试验 1.3.1 试验动物与设计

试验选取28头平均体重约为6.95 kg健康的断奶仔猪(“杜×长×大”),采用2×2双因子试验设计,即饲粮处理(添加1%L-异亮氨酸饲粮或添加0.68%L-丙氨酸饲粮)和RV攻毒(灌服RV或无菌培养液)。本团队前期研究表明,饲粮添加1% L-异亮氨酸可改善仔猪生长性能,并缓解RV诱导的腹泻[2],因此,本试验中饲粮中L-异亮氨酸的添加剂量采用1%。全部仔猪采用代谢笼饲养。试验第1天空腹称重后,根据体重相近原则,将所有仔猪随机分为2个组,每组14个重复,每个重复1头猪,分别饲喂添加1% L-异亮氨酸饲粮或添加0.68% L-丙氨酸饲粮。试验第15天,所有仔猪灌服100 mmol/L碳酸氢钠(NaHCO3)溶液5 mL,20 min后,每个饲粮处理中随机选取7头仔猪口服RV[106半数组织培养感染量(TCID50)/mL]4 mL,剩余仔猪口服无菌培养液4 mL。试验期为18 d。

1.3.2 试验饲粮

试验采用玉米-豆粕型基础饲粮,参照NRC(2012)7~11 kg阶段仔猪营养需要配制。通过在基础饲粮中添加1% L-异亮氨酸或0.68% L-丙氨酸(等氮处理)构成试验饲粮,添加的L-异亮氨酸或L-丙氨酸等量替代基础饲粮中的玉米淀粉。基础饲粮组成及营养水平见表 1

表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)  
1.3.3 饲养管理

试验在四川农业大学动物营养研究所教学科研基地代谢室进行。所有仔猪预饲喂2 d,使其适应粉状饲粮和饲养环境。猪舍温度控制在27~30 ℃,相对湿度不高于80%,每天饲喂4次(08:00、12:00、16:00和20:00),以每次采食后料槽有少量余料为度。所有仔猪自由饮水,试验期间消毒、清扫按常规程序进行,并保持猪舍通风、清洁。

1.3.4 RV培养

本试验中RV培养、强化和病毒滴度测定按Mao等[8]提供的方法,选用恒河猴肾细胞系(MA104)进行。

1.3.5 测定指标及方法 1.3.5.1 腹泻情况

攻毒后,每天进行粪便评分(0,正常;1,黏性粪便;2,半液体状粪便;3,液体状粪便);计算平均腹泻指数,具体参考Mao等[9],即平均腹泻指数=(∑粪便评分)/n,式中:n为重复数。

1.3.5.2 样品采集

试验第19天,空腹采血10 mL,置于普通离心管中,室温静置30 min,3 000 r/min离心15 min,制备血清,于-20 ℃保存备用。采血后,通过心脏注射戊巴比妥钠(50 mg/kg BW)和颈静脉放血的方法屠宰所有仔猪,迅速取出回肠,用冰生理盐水冲洗,通过载玻片刮取回肠黏膜,经过液氮速冻后,存于-80 ℃。

1.3.5.3 血清二胺氧化酶活性

血清二胺氧化酶活性采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定,操作按说明书进行。

1.3.5.4 回肠黏膜RV非结构蛋白4(non-structural protein 4, NSP4)阳性率

称取约1 g回肠黏膜组织,按质量体积比1 : 9加入预冷的生理盐水,置于冰上匀浆后,匀浆液在冷冻离心机中5 000×g离心10 min,取上清液用于NSP4阳性率的测定。仔猪回肠黏膜RV NSP4的阳性率采用上海诺渊有限公司的酶联免疫吸附试剂盒测定,操作按照试剂盒说明书进行。

1.3.5.5 回肠黏膜中黏液蛋白和紧密连接蛋白的mRNA相对表达量

回肠黏膜中mucin 1、mucin 2、ZO-1和occludin的mRNA相对表达量采用实时荧光定量PCR技术测定,具体方法参考Mao等[10]

1.4 数据处理与分析

试验数据采用Excel 2013进行初步整理。细胞试验数据,采用SAS 8.2的非配对t检验进行统计分析;动物试验数据,除了NSP4阳性率的数据外,其他数据采用SPSS 21.0软件中两因子方差分析,模型主效应包括RV攻毒和饲粮添加异亮氨酸以及二者之间的互作,差异显著后进行Duncan氏多重比较,各指标以每个重复为单位统计,数据以“平均值±标准误”表示。以P < 0.05为差异显著判定标准,以P < 0.10为有差异趋势的判定标准。

2 结果 2.1 异亮氨酸对IPEC-J2细胞中黏液蛋白和紧密连接蛋白mRNA相对表达量的影响

异亮氨酸对IPEC-J2细胞中黏液蛋白和紧密连接蛋白mRNA相对表达量的影响见图 1。与对照组相比,L-异亮氨酸处理显著提高了IPEC-J2细胞中mucin 2、ZO-1和occludin的mRNA相对表达量(P < 0.05),但对mucin 1的mRNA相对表达量无显著影响(P>0.05)。

*表示与对照组相比差异显著(P < 0.05)。 * represented significant difference compared with the control group (P < 0.05). 图 1 异亮氨酸对IPEC-J2细胞黏液蛋白和紧密连接蛋白mRNA相对表达量的影响 Fig. 1 Effects of isoleucine on mRNA relative expression of mucins and tight junction proteins in IPEC-J2 cells
2.2 异亮氨酸对RV攻毒断奶仔猪腹泻情况和回肠黏膜RV NSP4阳性率的影响

异亮氨酸对RV攻毒断奶仔猪平均腹泻指数和RV NSP4阳性率的影响分别见表 2图 2。由表 2可知,RV攻毒显著提高了断奶仔猪平均腹泻指数(P < 0.05),而饲粮添加异亮氨酸可显著缓解RV诱导的断奶仔猪平均腹泻指数的提高(P < 0.05)。由图 2可知,RV攻毒提高了断奶仔猪回肠黏膜RV NSP4阳性率;在RV攻毒断奶仔猪中,饲粮添加异亮氨酸可降低回肠黏膜RV NSP4阳性率。

表 2 异亮氨酸对RV攻毒断奶仔猪平均腹泻指数的影响 Table 2 Effect of isoleucine on average diarrhea index of weaned piglets challenged by RV
图 2 异亮氨酸对RV攻毒断奶仔猪回肠黏膜RV NSP4阳性率的影响 Fig. 2 Effect of isoleucine on RV NSP4 positive rate in ileal mucosa of weaned pigs challenged by RV
2.3 异亮氨酸对RV攻毒断奶仔猪血清二胺氧化酶活性的影响

异亮氨酸对RV攻毒断奶仔猪血清二胺氧化酶活性的影响见表 3。由表可知,RV攻毒显著提高了断奶仔猪血清二胺氧化酶活性(P < 0.05),而饲粮添加异亮氨酸可显著降低断奶仔猪血清二胺氧化酶活性(P < 0.05);且在RV攻毒仔猪中,饲粮添加异亮氨酸显著缓解RV诱导的断奶仔猪血清中二胺氧化酶活性的提高(P < 0.05)。

表 3 异亮氨酸对RV攻毒断奶仔猪血清二胺氧化酶活性的影响 Table 3 Effect of isoleucine on serum diamine oxidase activity of weaned piglets challenged by RV  
2.4 异亮氨酸对RV攻毒断奶仔猪回肠黏膜黏液蛋白和紧密连接蛋白mRNA相对表达量的影响

异亮氨酸对RV攻毒断奶仔猪回肠黏膜黏液蛋白和紧密连接蛋白mRNA相对表达量的影响见表 4。由表可知,RV攻毒显著降低了断奶仔猪回肠黏膜中mucin 2、ZO-1和occludin mRNA相对表达量(P < 0.05),而饲粮添加异亮氨酸可提高断奶仔猪回肠黏膜中mucin 2(P=0.08)、ZO-1(P < 0.05)和occludin(P < 0.05)mRNA相对表达量;且在RV攻毒仔猪中,饲粮添加异亮氨酸显著缓解RV对断奶仔猪回肠黏膜中mucin 2、ZO-1和occludin mRNA相对表达量的影响(P < 0.05);但RV攻毒和饲粮添加异亮氨酸对断奶仔猪回肠黏膜中mucin 1 mRNA相对表达量无显著影响(P>0.05)。

表 4 异亮氨酸对RV攻毒断奶仔猪回肠黏膜黏液蛋白和紧密连接蛋白mRNA相对表达量的影响 Table 4 Effects of isoleucine on mRNA relative expression of mucins and tight junction proteins in ileal mucosa of weaned piglets challenged by RV
3 讨论

异亮氨酸是人和动物机体的一种必需氨基酸。在非反刍动物的玉米-豆粕型饲粮(尤其是低蛋白质饲粮)中,它也是一个限制性氨基酸[11-12]。异亮氨酸可调节人和动物一些生理功能,如蛋白质代谢、脂肪酸代谢、葡萄糖转运和免疫等[1]。本研究的细胞试验发现,L-异亮氨酸处理显著提高了IPEC-J2细胞中黏液蛋白和紧密连接蛋白(mucin 2、ZO-1和occludin)的mRNA相对表达量。这些蛋白是肠道屏障功能的非特异性屏障机制重要的组成部分。那么,可以推测异亮氨酸处理具有改善肠道屏障功能的作用。

RV是诱导幼龄动物和婴幼儿严重胃肠炎和腹泻的主要病毒性病原之一[3-6]。前人的大量研究表明,RV感染会诱导断奶仔猪腹泻,导致其肠道(主要是小肠)屏障功能严重损伤[8-10, 13-15],本研究的动物试验也得到了类似的结果。此外,本研究的结果也表明,RV攻毒提高了断奶仔猪回肠黏膜中RV的NSP4阳性率,并提高了断奶仔猪血清中二胺氧化酶的活性。这些结果说明,在本研究的动物试验中,RV感染模型构建成功。

作为RV的一种非结构蛋白,NSP4在RV诱导感染和引起腹泻过程中发挥着重要的作用,因此,NSP4常被作为一种RV感染的标识[16]。在本研究的动物试验中,给断奶仔猪灌服RV致使其回肠黏膜中NSP4的阳性率提高,但饲粮中补充异亮氨酸则降低了回肠黏膜中NSP4的阳性率。这表明,饲粮中补充异亮氨酸可以减少RV对回肠的侵袭。由于肠道黏膜屏障功能是机体的第1道屏障,其对于抑制病原侵袭十分重要,那么,异亮氨酸抑制RV对回肠侵袭可能源于其改善了仔猪肠道屏障功能。

本团队前期的研究已表明,饲粮添加1% L-异亮氨酸改善了正常仔猪日增重、日采食量和料重比,并可缓解轮状病毒攻毒诱导的仔猪采食量降低和体增重下降[2]。而肠道健康和屏障功能是保证机体生长和健康的重要因素,那么异亮氨酸可能提高了仔猪肠道健康。通过对上述试验仔猪的进一步分析发现,异亮氨酸可调节仔猪肠道黏膜中细胞因子、免疫球蛋白、特异性抗体和防御素的产生,进而增强了仔猪的肠道免疫屏障功能[2]。除了免疫屏障,非特异性屏障机制也是肠道屏障功能的组成成分,其包含了黏膜上皮细胞间的紧密连接和黏膜胶质层等[17]。二胺氧化酶是由肠道黏膜上皮细胞产生,当肠道上皮细胞损伤时,二胺氧化酶将进入血液,因此,血液中它的活性可作为判定肠道黏膜通透性和完整性的指标[18]。肠道黏膜上皮细胞间紧密连接蛋白表达量可间接表示细胞间紧密连接的状态[19]。肠道黏膜上皮细胞和杯状细胞产生和分泌的黏液蛋白是黏膜胶质层的主要成分[20]。本研究的动物试验发现,饲粮补充异亮氨酸可在不同程度上缓解RV攻毒诱导的血清二胺氧化酶活性提高,以及肠道黏膜上皮紧密连接蛋白和黏液蛋白表达的降低。通过以上结果的分析可知,除了调节免疫功能,饲粮补充异亮氨酸抑制RV侵袭回肠的过程也依赖于其改善了非特异性屏障机制。

4 结论

断奶仔猪饲粮添加1.0%异亮氨酸可以在一定程度上预防RV对其的感染和诱导的腹泻,而这一过程除了涉及到异亮氨酸对肠道免疫功能的优化作用,也涉及到了异亮氨酸改善断奶仔猪肠道屏障功能(尤其是非特异性屏障机制)。

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