当前，我国肉仔鸡养殖多采用高密度集约化模式，由于鸡群密度大，夏季天气炎热等，肉仔鸡容易发生热应激，热应激往往导致肉仔鸡生长性能下降，甚至大批死亡，给肉仔鸡养殖业造成重大经济损失[1]。热应激发生时，肉仔鸡采食量减少，采食的调节过程涉及众多食欲调控因子。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)参与调节机体能量平衡，与体内多个调控通路相互作用调控食欲，是当前食欲调控的研究热点。AMPK是一种异缘三聚体酶复合物，由催化亚基α和调节亚基β、γ组成，其中催化亚基α包括α1和α2 2种形式。激活的AMPK可促进食欲，提高采食量和体增重，而AMPK活性受到抑制时则发挥相反的作用[2]。AMPK激活后可以通过下游通路发挥调节作用，除调节相应物质代谢外，对促食欲因子和抑食欲因子也具有一定的调控作用，如AMPK-乙酰辅酶A羧化酶(ACC)-肉碱棕榈酰转移酶(CPT1)通路激活后，除可促进脂肪氧化外，还可以促进促食欲基因神经肽Y(NPY)/刺鼠色蛋白相关蛋白(AgRP)的转录和表达或者抑制抑食欲基因可卡因和安非他明调节转(CART)/阿片黑素细胞皮质激素(POMC)的转录和表达，调控食欲[3]。
因此，本试验以肉仔鸡为试验动物，旨在研究短期热应激对家禽生长性能和下丘脑AMPK信号通路的影响，探究家禽下丘脑中AMPK发挥食欲调控作用的分子机制，为完善家禽食欲调控和能量平衡理论奠定基础，为现代家禽饲养管理提供理论指导。
1 材料与方法 1.1 试验动物试验动物购自泰安大宝有限公司。选用体重相近的1日龄雄性爱拔益加(AA)肉仔鸡，试验期间鸡舍内温度、相对湿度和卫生学指标等均符合肉仔鸡饲养的卫生要求(GB/T 14925—1994)，笼养，正常程序免疫，自由采食和饮水，其他措施与常规饲养管理相同。试验饲粮选用泰安六和乐林饲料有限公司肉仔鸡配合饲料，饲粮营养水平均满足NRC(1994)推荐的肉仔鸡营养标准。
1.2 试验设计试验选取72只体重相近的28日龄雄性AA肉仔鸡，随机分为2个组：热应激组和对照组。每组6个重复，每个重复6只鸡，热应激组温度设定为(33±1) ℃，对照组温度设定为(25±1) ℃，试验持续10 h。鸡舍配置空调和加热器作为热源，根据温度计监测鸡舍内温度；利用加湿器控制鸡舍相对湿度，根据湿度计监测鸡舍内相对湿度。温度、相对湿度控制措施与周华金等[4]相同。肉仔鸡28日龄08:00开始试验，试验持续10 h。
1.3 指标测定 1.3.1 生长性能和直肠温度统计试验期间试验鸡生长性能(采食量、体增重)，试验期间用温度计测量肉仔鸡直肠温度，每只鸡测量3次，取平均值。
1.3.2 血浆生化指标每重复挑选1只体重接近平均体重的肉仔鸡，采集血浆样品。血浆葡萄糖(GLU)、尿酸(UA)、总胆固醇(TCHO)和甘油三酯(TG)含量利用比色法采用分光光度计进行测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.3.3 基因表达分析每重复挑选1只体重接近平均体重的肉仔鸡，采集下丘脑样品。下丘脑样品采集后迅速放液氮中，之后放置于-80 ℃冰箱中保存。测定指标包括大麻素1(CB1)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、AMPKα1、AMPKα2、肝激酶B1(LKB1)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和糖皮质激素受体(GR)的mRNA相对表达量。此外，测定下丘脑AMPK磷酸化水平。
用Trizol法提取下丘脑总RNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。根据TaKaRa的PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time试剂盒[编号：DRR037A，宝生物工程(大连)有限公司]要求，将总RNA反转录为cDNA。采用20 μL体系进行反转录。反转录条件为：37 ℃ 15 min×3个循环(反转录反应)；85 ℃ 5 s(反转录酶的失活反应)。
各基因PCR引物：所有引物均根据TaKaRa的SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒[编号：DRR041A，宝生物工程(大连)有限公司]要求，参照GenBank上已发表的序列，采用DNAMAN 5.0设计(跨内含子)，引物序列见表 1，由上海生工生物工程公司合成。参照文献[5]的方法，用2-△△Ct法定量目标基因的相对表达量，以β-肌动蛋白(β-actin)作为参照基因进行校准。
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表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences |
数据统计采用SAS 8.0统计软件的t检验进行分析，试验数据用平均值±标准误(mean±SE)表示，P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 短期热应激对肉仔鸡生长性能和直肠温度的影响由图 1可知，与对照组相比，热应激组肉仔鸡直肠温度显著提高(P＜0.05)，热应激组肉仔鸡体增重和采食量显著降低(P＜0.05)。
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数据柱标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，无字母表示差异不显著(P>0.05)。下图同。 Value columns with different small letters mean significant difference (P < 0.05), while with no letters mean no significant difference (P>0.05). The same as below. 图 1 短期热应激对肉仔鸡生长性能和直肠温度的影响 Fig. 1 Effects of short-time heat stress on growth performance and rectal temperature of broilers |
由表 2可知，与对照组相比，热应激组肉仔鸡血浆UA、GLU和TCHO含量均显著提高(P＜0.05)。
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表 2 短期热应激对肉仔鸡血浆生化指标的影响 Table 2 Effects of short-time heat stress on plasma biochemical parameters of broilers |
由表 3可知，与对照组相比，热应激组肉仔鸡下丘脑中LKB1、AKT1、mTOR和CB1的mRNA相对表达量均无显著差异(P＞0.05)。
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表 3 短期热应激对肉仔鸡下丘脑LKB1、AKT1、mTOR和CB1的mRNA相对表达量的影响 Table 3 Effects of short-time heat stress on hypothalamic LKB1, AKT1, mTOR and CB1 mRNA relative expression of broilers |
由图 2可知，与对照组相比，热应激组肉仔鸡下丘脑中AMPKα1和GR的mRNA相对表达量显著降低(P＜0.05)，热应激组肉仔鸡下丘脑中AMPKα2的mRNA相对表达量无显著差异(P＞0.05)。
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图 2 短期热应激对肉仔鸡下丘脑中AMPKα1、AMPKα2和GR的mRNA相对表达量的影响 Fig. 2 Effects of short-time heat stress on hypothalamic AMPKα1, AMPKα2 and GR mRNA relative expression of broilers |
由图 3可知，与对照组相比，热应激组肉仔鸡下丘脑中AMPK磷酸化水平显著降低(P＜0.05)，肉仔鸡下丘脑中AMPK蛋白水平无显著差异(P＞0.05)。
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图 3 短期热应激对肉仔鸡下丘脑中AMPK磷酸化水平的影响 Fig. 3 Effects of short-time heat stress on hypothalamic AMPK phosphorylation level of broilers |
据报道，28日龄左右肉仔鸡适宜环境温度为5~28 ℃，当环境温度超过适宜温度范围上限，肉仔鸡发生热应激[6]。本试验温度控制方法参考本实验室以往研究中热应激模型搭建方法[4, 7]，并稍作改动。在肉仔鸡热应激相关研究中，贺绍君等[1]和洪奇华等[8]构建热应激模型时分别设置环境温度为(32±1) ℃和(33±1) ℃，均对28日龄肉仔鸡造成热应激影响，环境温度设置与本试验相近。本试验中，与对照组相比，热应激组肉仔鸡直肠温度显著升高，且热应激组肉仔鸡精神萎靡，食欲减退，采食量和体增重均显著降低，符合热应激肉仔鸡状态，说明热应激模型搭建成功。热应激是家禽饲养过程中常见应激的一种，易引起肉仔鸡热应激综合征，影响下丘脑采食中枢，紊乱机体新陈代谢，从而导致肉仔鸡体温升高，采食量下降，影响肉仔鸡的生长性能[9]。本试验中，短期热应激导致肉仔鸡直肠温度升高，生长性能下降，与钟光等[10]研究结果一致。肉仔鸡发生热应激时，高温一方面对肉仔鸡下丘脑的摄食中枢发生作用，降低其兴奋性；另一方面作用于交感神经导致胃肠道活动减弱，肠道蠕动速度减慢，消化道中食糜排空减慢。此外，肉仔鸡发生热应激时饮水量加大。这些因素均会降低肉仔鸡采食量，影响肉仔鸡的生长性能。
本试验中，热应激组肉仔鸡血浆UA含量显著增高，与钟光等[11]研究结果一致。当机体发生应激时，体内两大系统发生反应：交感-肾上腺髓质系统激活，儿茶酚胺分泌增强；下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)激活，糖皮质激素分泌增强。糖皮质激素促进蛋白质、脂肪分解和肝脏糖原异生等异化过程，调节能量分配应对应激。蛋白质分解产生大量氨基酸用于分解供能，氨基酸生成氨和α-酮酸，α-酮酸可以再转变为氨基酸或者彻底分解为二氧化碳和水，家禽将体内多余的氨合成UA排出体外，导致肉仔鸡血浆UA含量升高。另外，糖皮质激素参与调节肾上腺素和胰高血糖素对糖原的分解和释放，从而影响血浆GLU含量。热应激对肉仔鸡血浆GLU含量的影响较为复杂，在前人的研究中，热应激对肉仔鸡血浆GLU含量的影响结果并不相同，热应激对肉仔鸡血浆GLU含量的影响可能与肉仔鸡的品种、日龄及热应激作用时间长短有关。在周杰等[6]的研究中，热应激使肉仔鸡血浆GLU含量显著下降；在李绍钰[12]等的研究中，热应激作用时间持续1周时可显著提高肉仔鸡血浆GLU含量，而当热应激作用时间延长至2周时，热应激未对肉仔鸡血浆GLU含量产生显著影响；在周华金等[13]的研究中，热应激作用时间持续24和72 h时，均显著提高肉仔鸡血浆GLU含量。本试验中，10 h热应激显著提高了肉仔鸡血浆GLU含量。这提示热应激对肉仔鸡血浆GLU含量的影响可能与作用时间有关，且随着作用时间延长，热应激对肉仔鸡血浆GLU含量的影响逐渐减弱。
热应激会增加肉仔鸡的脂肪沉积，提高肉仔鸡的腹脂率[14]，TG是脂肪的主要储存形式，血浆TG含量可一定程度反映脂肪沉积程度。在洪声安[15]的研究中，7 d热应激显著提高了肉仔鸡血浆TG含量，而在本试验中，10 h热应激对肉仔鸡血浆TG含量无显著影响，可能原因是长期热应激可显著影响机体肝脂肪代谢，而短期热应激对肉仔鸡脂肪代谢影响有限[13]。胆固醇参与形成免疫复合物(CIC)，在免疫系统中发挥重要作用[16]。胆固醇是合成胆汁酸和肾上腺皮质激素等生理活性物质的重要物质，热应激发生时，糖皮质激素(GC)分泌增加，为满足机体对胆固醇的需要量，周边组织合成和动员胆固醇导致血浆胆固醇含量升高。本试验中，与对照组相比，热应激组肉仔鸡血浆TCHO含量显著升高，与綦松智等[17]研究结果一致。
3.2 短期热应激对肉仔鸡下丘脑中相关分子基因表达和AMPK信号通路的影响LKB1是一种重要的蛋白激酶，可通过促进AMPKα亚基上苏氨酸(Thr)172的磷酸化激活AMPK，提高AMPK磷酸化水平。mTOR是一种典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)，具有调控食欲的功能[18]，mTOR活性受其上游信号通路磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-AKT-mTOR和LKB1-AMPK-mTOR的调节。PI3K-AKT-mTOR信号通路激活mTOR后，mTOR通过调节下游翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)通路和40S核糖体S6蛋白激酶(p70S6K)通路抑制促食欲因子NPY和AgRP表达，促进抑食欲因子POMC表达；LKB1可通过磷酸化AMPK，使AMPK被激活，激活状态的AMPK磷酸化肿瘤抑制因子结节性硬化复合物蛋白2(TSC2)，间接抑制mTOR活性或直接磷酸化mTOR的2 446位点上的Thr抑制mTOR活性，促进采食[19]。mTOR通路将能量变化信息作用于下丘脑，下丘脑反馈作用于食物摄取并调节机体能量均衡[20]。此外，mTOR还受到AKT的调节，激活的AKT可以直接磷酸化mTOR。本试验中，肉仔鸡下丘脑LKB1、AKT1和mTOR的mRNA相对表达量均未出现显著变化，可能原因是本试验热应激作用时间短、强度低，具体机理需进一步研究验证。
肉仔鸡发生应激时，HPA轴激活。内源性大麻素信号通路参与调节应激时HPA轴的活动，促进合成和释放GC以应对应激，GR是机体各组织细胞接受GC信息的装置，GC大部分功能的实现依赖于GR介导，GC与GR结合可以提高细胞的代谢率，通过促进糖原分解等提高血浆GLU含量[21-23]。本试验中，与对照组相比，热应激组肉仔鸡下丘脑中CB1的mRNA相对表达量无显著变化，GR的mRNA相对表达量显著降低，有利于GC发挥作用，调节能量分配以应对应激，降低应激对机体的损害。
AMPK参与调节细胞代谢和机体新陈代谢，在维持内环境稳定方面具有重要作用。LKB1活化AMPK后，降低3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)活性，从而抑制胆固醇、脂肪酸和TG的合成，并提高脂肪酸的氧化速度[24]；同时促进GLU的吸收，并快速调节6-磷酸果糖激酶活性，促进糖酵解，维持机体内环境稳定[25]。肉仔鸡下丘脑AMPK活性受到抑制时，通过中枢和外周途径同时通过抑制促食欲基因NPY/AgRP表达或者促进抑食欲基因CART/POMC表达抑制食欲，降低肉仔鸡采食量及体增重。本试验中，热应激组肉仔鸡下丘脑AMPKα1相对表达量和AMPK磷酸化水平显著低于对照组，表明短期热应激抑制肉仔鸡下丘脑AMPK活性，与前人研究结果[26-28]一致。AMPK的活性主要取决于其α亚基的Thr172的磷酸化状态，在王霆[29]的研究中，热应激时，HepG2细胞中AMPK磷酸化水平显著降低，与本试验结果相同，其认为热应激通过磷酸酶2A使AMPKα去磷酸化，从而降低AMPK活性。
4 结论短期热应激能显著降低肉仔鸡体增重和采食量，抑制肉仔鸡食欲，显著降低肉仔鸡下丘脑AMPK磷酸化水平，显著降低下丘脑中AMPKα1和GR的mRNA相对表达量，提示AMPK信号通路参与短期热应激抑制肉仔鸡食欲的调控过程。
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