拉萨裸裂尻鱼(Schizopygopsis youughusbaudi)隶属鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，裂腹鱼亚科(Schizothoracinae)，裸裂尻鱼属(Schizopygopsis)，地方名土鱼，是西藏高原较重要的土著经济鱼类之一，属冷水性鱼类，主要分布于雅鲁藏布江中上游干、支流及其附属水体，为我国特有品种^[1]。近年来，随着西藏经济社会的快速发展，消费市场对拉萨裸裂尻鱼的需求量不断增加，过度捕捞加之外来物种入侵等原因，原本是西藏高原水体中优势土著品种的拉萨裸裂尻鱼资源量呈减少趋势^[2-3]，且处于过度开发状态。因此，开展拉萨裸裂尻鱼的人工增殖工作尤为紧迫。当前，针对拉萨裸裂尻鱼的研究主要集中在早期发育、年龄生长、食性与摄食消化器官形态、开口饵料和分子生物学等方面^[4-7]，还有少数研究涉及疾病和肌肉营养^[8-10]。

开展人工增殖工作，拉萨裸裂尻鱼各养殖阶段的人工配合饲料营养水平是关键技术数据。关于拉萨裸裂尻鱼的人工配合饲料营养方面的研究仅有曾本和等^[11]开展了蛋白质水平对其生长、饲料利用率、形体指标和肌肉营养成分的影响研究，且未深入研究饲料蛋白质水平对其生化指标方面的影响。免疫酶及抗氧化酶是鱼体重要且敏感的生化指标，与表观和生理研究比较，在判断鱼体健康状况时，生化指标表现出高敏感性的优势。众多研究也已证明营养与免疫之间关联密切，通过营养调控来提高鱼类的免疫力，以养代防，既克服传统方法存在的缺陷，又更有利于鱼类的健康生长^[12]。蛋白质又是鱼类合成各种酶类和抗体蛋白所必需的原料，因此饲料蛋白质水平与机体免疫和抗氧化能力密切相关^[13]。长期投喂蛋白质水平不足的饲料会导致鱼类体质变弱，降低对环境的适应力和对疾病的抵抗力，从而导致较高的发病率和死亡率等^[14]；而过高的饲料蛋白质水平则会导致多余的蛋白质以氨氮等形式留在水环境中，既造成了能量浪费，还对养殖水体环境造成污染，影响鱼类健康生长^[15-19]。作者通过整理同种鱼同种规格通过生长指标得出的适宜饲料蛋白质水平似乎都高于生理生化指标得出的饲料蛋白质水平^[20-28]，如何选取值得探讨。

本试验在曾本和等^[11]的研究基础上，研究了饲料蛋白质水平对萨裸裂尻鱼幼鱼血清、肝脏免疫酶和抗氧化酶等生化指标的影响，以期为萨裸裂尻鱼人工增殖技术中饲料蛋白质适宜水平的选择提供理论优化依据，补充拉萨裸裂尻鱼人工增殖技术中饲料营养生化指标方面的理论数据，进一步避免由于营养水平不适合而造成的鱼苗健康问题，以保证放流的鱼苗处于更加健康的状态。

1 材料与方法 1.1 试验饲料

以酪蛋白、白鱼粉为蛋白质源，深海鱼油为脂肪源，玉米淀粉、糊化淀粉为糖源。配制蛋白质水平分别为20%、25%、30%、35%、40%、45%的6种等脂等能试验饲料。饲料原料经粉碎后过60目筛，按配比称重，采用逐级混匀法两两混合至均匀，制粒机制成直径2 mm饲料，置于-4 ℃冰箱中保存使用。试验饲料组成及营养水平见表 1。

1.2 试验设计及饲养管理

试验用拉萨裸裂尻鱼幼鱼为2017年5月于雅鲁藏布江日喀则江段捕获，当天充氧运回后在水泥池(长4.0 m×宽3.0 m×高0.6 m)中驯养8周，待野生幼鱼抢食活跃后，挑选大小均匀、健康、体重为(22.42±0.56) g的拉萨裸裂尻鱼540尾，随机分成6组，各组3个重复，每个重复30尾，分别放入18个水族缸(长0.6 m×宽0.5 m×高0.4 m)中，随机编为1~6号，分别投喂不同蛋白质水平的6种试验饲料。每天共表观饱食投喂3次(07:00、12:00、17:00)，每天投喂量为试验鱼体重的3%~5%，投饵1 h后将残饵和粪便吸出，整个试验持续60 d。试验用水为充分曝气后的井水，试验水族缸内水24 h循环，循环量为120 L/h，水温12.0~13.0 ℃，pH 8.0~8.5，溶氧浓度≥6.0 mg/L，氨氮浓度＜0.01 mg/L，亚硝酸盐浓度＜0.02 mg/L。

1.3 样品采集及指标测定

养殖试验结束后，所有试验鱼饥饿24 h，而后对每个重复分别进行计数、称重，计算体重增长率。在每个重复中分别随机取10尾试验鱼用50 mg/L的MS-222溶液麻醉，无菌注射器尾静脉取血后解剖取出肝脏，经液氮冻存24 h后转到-80 ℃冰箱保存，用于测定相应免疫和抗氧化指标。

血清和肝脏免疫和抗氧化指标均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定，严格照说明书进行检测。组织匀浆液中蛋白质浓度采用考马斯亮蓝法^[29]测定，以牛血清白蛋白作基准物。

1.4 数据统计

数据采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，若差异显著，再用Duncan氏法进一步做多重比较，差异显著水平为P < 0.05。试验结果用“平均值±标准差”表示。回归曲线均用Excel 2010绘制。

2 结果 2.1 饲料蛋白水平对拉萨裸裂尻鱼幼鱼生长的影响

由表 2可知，35%蛋白质水平组的终末体重显著高于20%、25%、40%、45%蛋白质水平组(P < 0.05)，与35%蛋白质水平组差异不显著(P>0.05)。30%、35%蛋白质水平组的体重增长率显著高于其他各组(P < 0.05)，但30%、35%蛋白质水平组之间差异不显著(P>0.05)；20%蛋白质水平组的体重增长率最低，为(29.57±2.46)%，与25%蛋白质水平组差异不显著(P>0.05)，且显著低于其他各组(P < 0.05)。25%、40%、45%蛋白质水平组之间终末体重和体重增长率接近，均差异不显著(P>0.05)。

2.2 饲料蛋白质水平对拉萨裸裂尻鱼幼鱼免疫能力的影响

饲料蛋白质水平对拉萨裸裂尻鱼幼鱼免疫能力的影响见图 1。血清溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活性和免疫球蛋白M(IgM)含量以及肝脏ACP、AKP活性均随饲料蛋白质水平的增加呈先升高后降低的趋势。多项式回归分析结果显示，各指标达最大值的饲料蛋白质水平各不相同，但主要集中在32.31%~35.05%。

35%蛋白质水平组的血清LSZ活性最高，为(46.460±2.481) μg/mL，与30%蛋白质水平组差异不显著(P>0.05)，显著高于其他各组(P < 0.05)；45%蛋白质水平组的血清LSZ活性最低，为(31.393±2.375) μg/mL，与20%蛋白质水平组差异不显著(P>0.05)，显著低于其他各组(P < 0.05)。35%蛋白质水平组的血清IgM含量最高，为(1.267±0.057) mg/mL，与40%、45%蛋白质水平组差异不显著(P < 0.05)，显著高于其他各组(P < 0.05)；20%蛋白质水平组的血清IgM含量最低，为(0.617±0.031) mg/mL，显著低于其他各组(P < 0.05)。

35%蛋白质水平组的肝脏ACP活性最高，为(187.387±7.750) U/g prot，显著高于其他各组(P < 0.05)；20%蛋白质水平组的肝脏ACP活性最低，为(123.519±6.850) U/g prot，与25%、45%蛋白质水平组差异不显著(P>0.05)，显著低于其他各组(P < 0.05)。30%蛋白质水平组的血清ACP活性最高，为(8.129±0.879) U/dL，显著高于其他各组(P < 0.05)；20%蛋白质水平组的血清ACP活性最低，为(5.382±0.677) U/dL，与25%、35%、40%、45%蛋白质水平组差异不显著(P>0.05)。与肝脏ACP活性相比，血清ACP活性随饲料蛋白质水平的变化不明显。

30%蛋白质水平的肝脏AKP活性最高，为(31.139±2.707) U/g prot，显著高于其他各组(P < 0.05)；20%蛋白质水平组的肝脏ACP活性最低，为(18.840±1.207) U/g prot，显著低于30%、35%蛋白质水平组(P < 0.05)。30%蛋白质水平的血清AKP活性最高，为(7.788±0.881) U/dL，显著高于20%、25%蛋白质水平组(P < 0.05)，与其他各组差异不显著(P>0.05)；20%蛋白质水平组的血清ACP活性最低，为(5.237±1.003) U/dL，显著低于30%、40%、45%蛋白质水平组(P < 0.05)。与肝脏AKP活性相比，血清AKP活性随饲料蛋白质水平的变化不明显。

2.3 饲料蛋白水平对拉萨裸裂尻鱼幼鱼抗氧化能力的影响

饲料蛋白水平对拉萨裸裂尻鱼幼鱼抗氧化能力的影响见图 2。血清和肝脏超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性均随饲料蛋白质水平的增加呈先升高后降低的趋势；肝脏丙二醛(MDA)含量随饲料蛋白质水平的增加呈先降低后趋于稳定的趋势，在饲料蛋白质水平超过35%后趋于稳定。多项式回归分析结果显示，血清和肝脏SOD、CAT活性达最大值的饲料蛋白质水平各不相同，但主要集中在30.43%~33.49%。

30%蛋白质水平组的肝脏SOD活性在最高，为(135.465±6.932) U/mg prot，显著高于其他各组(P < 0.05)；45%蛋白质水平组的肝脏SOD活性最低，为(67.037±4.010) U/mg prot，显著低于其他各组(P < 0.05)。30%蛋白质水平组的血清SOD活性最高，为(24.689±1.295) U/mL，显著高于其他各组(P < 0.05)；45%蛋白质水平组的血清SOD活性最低，为(11.840±1.550) U/mL，显著低于其他各组(P < 0.05)。血清和肝脏SOD活性均在饲料蛋白质水平达30%之后下降。

35%蛋白质水平组的肝脏CAT活性最高，为(22.948±2.723) U/mg prot，与30%蛋白质水平组差异不显著(P>0.05)，显著高于其他各组(P < 0.05)；45%蛋白质水平组的肝脏CAT活性最低，为(11.647±1.690) U/mg prot，与40%蛋白水平组组差异不显著(P>0.05)，显著低于其他各组(P < 0.05)。30%蛋白质水平组的血清CAT活性最高，为(8.854±0.903) U/mL，与35%蛋白质组差异不显著(P>0.05)，显著高于其他各组(P < 0.05)；20%蛋白质水平组的血清CAT活性最低，为(3.726±0.631) U/mL，显著低于其他各组(P < 0.05)。与肝脏CAT活性相比，血清CAT活性在达到峰值之后改变随饲料蛋白质水平的变化不明显。

20%、25%蛋白水平组的肝脏MDA含量显著高于其他各组(P < 0.05)，但20%、25%蛋白水平组之间差异不显著(P>0.05)，在饲料蛋白质水平超过35%后，肝脏MDA含量趋于稳定，45%蛋白质水平组肝脏MDA含量最低，为(1.450±0.080) nmol/g prot；30%蛋白质水平组肝脏MDA含量为(1.853±0.071) nmol/g prot，显著高于35%、40%、45%蛋白质组(P < 0.05)，显著低于20%、25%蛋白质水平组(P < 0.05)。

3 讨论 3.1 饲料蛋白质水平对拉萨裸裂尻鱼幼鱼生长和免疫能力的影响

鱼体为适应不同的饲料蛋白质水平，其免疫酶及抗氧化酶活性也将发生与之对应的改变^[30]。血清和肝脏中免疫酶活性影响鱼体的免疫能力，间接反映该饲料蛋白质水平下鱼体的健康状况。在本试验中，拉萨裸裂尻鱼幼鱼血清和肝脏中4种免疫酶活性均受饲料蛋白质水平的显著影响，且其活性和生长指标随饲料蛋白质水平的升高均呈先升高后降低的趋势，该结果提示，适宜的饲料蛋白质水平能一定程度提高拉萨裸裂尻鱼幼鱼的生长和免疫能力，与Huang等^[31]对镜鲤(Cyprinus carpio)幼鱼和强俊等^[32]对吉富罗非鱼(Oreochromis Niloticus)的研究结果一致。而张宝龙等^[33]对鲤鱼(Carp)、王常安等^[34]对大鳞鲃(Barbus capito)和乐贻荣等^[35]对奥尼罗非鱼(O.niloticus×O.aureus)的研究显示，饲料蛋白水平并未显著影响血清LSZ、AKP、ACP活性及IgM含量。本试验结果显示，当饲料蛋白质水平超过35%后，肝脏ACP、AKP活性降低，该结果提示过高的饲料蛋白质水平会对拉萨裸裂尻鱼幼鱼肝脏的免疫能力造成一定程度的损伤，与强俊等^[32]对吉富罗非鱼和朱仙龙^[36]对2种石斑鱼的研究结果一致。从上述差异中可知，饲料蛋白质水平对鱼类免疫能力的影响呈现品种的差异，对比上述各研究中的饲料配方发现，造成差异的原因可能是饲料蛋白源的不同和饲料配方中各营养素之间的不平衡(例如本试验饲料配方中碳水化合物的含量不同)。但是，饲料中碳水化合物的代谢对鱼的生长和生化指标是否有明显影响，还应当考虑能量蛋白比、碳水化合物脂肪比和食性等。例如杂食性的异育银鲫(Carassius auratus gibelio)和肉食性的长吻鮠(Leiocassis longirostris)随饲料中碳水化合物脂肪比增加，异育银鲫和长吻鮠的血清生化指标的变化趋势不明显^[37]，各种碳水化合物对黑鲷(Acanthopagrus schlegeii)幼鱼的生长均没有显著影响^[38]。海水养殖鱼种军曹鱼(Rachycentron canadum L.)和淡水养殖鱼种虹鳟(Oncorhynchus mykiss)蛋白质表观消化率不受饲料糖水平和来源的显著影响^[39]。当饲料蛋白质水平较高、能量蛋白比较低、总能处于低水平时，鱼类能量消耗的大部分能量由蛋白质提供，饲料淀粉的含量也相对处于低水平，淀粉就不会表现出对鱼体的生长等的不利影响^[40]，杂食性鱼类相对于肉食性鱼类可忍耐较高的饲料淀粉的含量^[41]。本试验中，当饲料蛋白质水平升高时，能量和粗脂肪水平均维持不变，能量蛋白质比和碳水化合物脂肪比都在降低。因此，本试验中糖类虽然也在变化，但对杂食性的拉萨裸裂尻鱼来说，并不明显影响试验结果。

AKP作为细胞膜标志酶，主要位于细胞膜上，通过转磷酸化作用，水解有机磷酸，参与细胞信号的传导，同时在肝脏也参与脂类的水解。而且目前由于AKP活性和脂类的吸收存在正相关，因此普遍把AKP的活性作为脂类吸收强度的指示物^[42]。当动物体在满足基本营养需要后，摄入的剩余能量将转化为脂肪沉积下来。结合本试验结果中血清和肝脏AKP活性随饲料蛋白质水平变化而变化的趋势，推测与肝细胞膜上AKP的信号传导有关，即随着饲料蛋白水平逐渐升高，AKP释放吸收更多能量的信号，增强其酶活性，在达到峰值之后，AKP释放信号维持其活性峰值，或稍有降低。而后由于过高的蛋白质水平导致肝细胞受损，肝细胞膜通透性增强，AKP渗出到血液中，这与在血清中AKP达到峰值之后检测到其活性未显著降低的结果吻合。孙静秋等^[43]研究发现，肝脏中ACP参与虾体脂类的水解。本试验中，在饲料蛋白水平达30%时，肝脏中作为脂类吸收强度指示物的AKP活性达到峰值，而紧随其后饲料蛋白水平达30%时，肝脏中参与脂类水解的ACP活性便达到峰值，之后肝脏ACP活性又显著下降，血清ACP活性也显著回归，这一过程符合营养物质在血液运输，刺激肝脏释放信号，通过加强脂肪吸收来沉积能量的一般规律。推测肝脏中ACP活性显著下降同样与肝细胞受损有关，血清中ACP活性的显著回归，从数据上看血清ACP活性对高蛋白质水平表现出一定的适应性调节，但长期看不利于鱼体健康。

孙静秋等^[43]研究认为AKP、ACP在对虾的生长和免疫反应中发挥着积极的作用。本试验通过上述4种免疫酶活性和生长指标的研究，也肯定适宜的饲料蛋白质水平下AKP、ACP对拉萨裸裂尻鱼幼鱼的免疫和生长发挥积极作用，生产中投喂拉萨裸裂尻鱼幼鱼的饲料蛋白质水平不宜过低或过高，否则不利于鱼体健康。

3.2 饲料蛋白质水平对拉萨裸裂尻鱼幼鱼抗氧化能力的影响

SOD和CAT是2个重要的抗氧化酶，能有效清除体内脂质过氧化产物^[44]。MDA作为脂质过氧化末端的主要产物之一，可反映机体脂质过氧化程度及其抗氧化能力的强弱^[45]。本试验结果显示，饲料蛋白质水平对拉萨裸裂尻鱼幼鱼血清和肝脏SOD、CAT活性及肝脏MDA活性均有显著影响，2种抗氧化酶活性均随饲料蛋白质水平的升高呈先升高后降低的趋势，肝脏MDA含量则呈先持续降低后趋于稳定的趋势。类似研究发现，鲤鱼(Cyprinus carpio)幼鱼^[20]和云纹石斑鱼幼鱼(Epinehelus moara)^[46]的肝脏SOD、CAT活性随饲料蛋白质水平升高的变化趋势一致，但肝脏MDA含量随饲料蛋白质水平升高的变化趋势稍有不同，即持续降低后又回升。更有不同的是唐媛媛^[28]对卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)的研究结果显示，肝脏SOD、CAT活性与饲料蛋白质水平呈正相关，并未出现下降趋势。造成上述研究差异的原因，可能是唐媛媛^[28]设置的蛋白质水平仅有3个，蛋白质水平刚好处于肝脏SOD、CAT活性下降之前的梯度，未设置到超鱼体承受限度的蛋白质水平梯度^[47]。本试验的差异可能是试验鱼对高蛋白质水平饲料耐受性差的原因，即随饲料蛋白质水平的升高，机体为应对高蛋白质水平饲料带来的氧化损伤，增强血清和肝脏SOD、CAT活性来清除脂质过氧化产物MDA，降低MDA带来的损伤。但当饲料蛋白质水平超过机体承受限度后，血清和肝脏SOD、CAT活性降低，对脂质过氧化产物MDA的清除能力降低。这一点从本试验血清和肝脏SOD、CAT活性在饲料蛋白质水平超过35%之后下降，但肝脏MDA含量下降至稳定的结果中也得到应证，即抗氧化系统平衡被打破后，拉萨裸裂尻鱼幼鱼的肝脏抗氧化能力降低，但基本的抗氧化能力仍然得以维持，表现为肝脏MDA含量持续降低后趋于稳定。上述研究结果提示，高饲料蛋白质水平使拉萨裸裂尻鱼幼鱼肝脏抗氧化能力长期处于较低水平，不利于鱼体健康生长。

3.3 拉萨裸裂尻鱼的适宜饲料蛋白质水平

曾本和等^[11]同一试验条件下采用生长指标研究得出(22.42±0.56) g的拉萨裸裂尻鱼幼鱼人工配合饲料的适宜蛋白质水平为34.01%~35.31%，本研究采用生化指标得出同一试验条件下的拉萨裸裂尻鱼幼鱼人工配合饲料的蛋白质水平为30.43%~33.88%，低于生长指标得出的饲料蛋白质水平。同样的结果也出现在鲤形目的鲤鱼幼鱼^[20]、团头鲂(Megalobrama amblycephala)幼鱼^[21]、黄姑鱼(Nibea albiflora)幼鱼^[22]、大黄鱼(Pseudosciaena crocea R.)幼鱼^[23]、台湾泥鳅(Paramisgumus dabryanus ssp)幼鱼^[24]、尼罗罗非鱼(Nile tilapia)幼鱼和奥尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)幼鱼^[25]以及鲈形目的大口黑鲈(Micropterus salmoides)^[26]、斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)^[27]和卵形鲳鲹^[28]饲料蛋白质适宜水平的研究中。上述研究中，生长指标侧重鱼生长性能的最大化，生理生化指标侧重鱼体生命活动的健康状态，生长指标得出的饲料蛋白质适宜水平均高于生理生化指标得出的饲料蛋白质适宜水平。肖温温^[26]研究发现，饲料蛋白质水平对大口黑鲈的生长、饲料利用、体组成、免疫力和血液学指标的影响程度不同，这与本试验的结果完全一致，其余研究报道的结果^[20-28]也符合这一规律，这些试验中的鱼种涵盖了鲤形目和鲈形目的不同科、属、种。

上述试验的周期都在8周左右，在这一试验周期内从生长指标得出的饲料蛋白质适宜水平均能得到很好的生长性能，但在同一试验中采用生理生化指标得出的饲料蛋白质适宜水平均相对低于生长指标得出的饲料蛋白质适宜水平，且在生长性能最好时的饲料蛋白质水平处，在生理生化指标上来看却表现出对其健康状态不利的影响，开始表现出过高蛋白质水平所造成损伤的现象，如果采用生长指标得出的饲料蛋白质水平，将养殖周期延长到生产实践养殖周期中，那么拉萨裸裂尻鱼从第8周就处于相对高蛋白质水平饲料损伤的状态中，8周以后到养殖结束这一阶段，都将处于高蛋白质水平饲料损伤过程中，在这一养殖过程中鱼的健康状态是没有处于最佳状态的，再考虑上时间的累积作用，这种损伤将被放大，鱼的抗逆性降低是必然趋势。长期养殖条件下，为保证鱼体健康，又能维持正常的生长性能，建议采用生理生化评价指标下的饲料蛋白质水平。在育肥上市阶段的8周左右时间内建议采用生长性能下的饲料蛋白质水平，以便得到最大的生长性能，也在鱼的耐受期内。

4 结论

本试验结果表明，适宜的饲料蛋白水平对拉萨裸裂尻鱼幼鱼的免疫及抗氧化能力均有一定的促进作用。综合考虑各项生化指标，采用多项式回归分析得出，(22.42±0.56) g的拉萨裸裂尻鱼幼鱼人工配合饲料适宜蛋白质水平为30.43%~33.88%。