猪在消化过程中将蛋白质分解为氨基酸,利用氨基酸来合成机体蛋白质,因此饲粮蛋白质的有效性取决于其氨基酸组成,猪真正需要的是氨基酸,而不是蛋白质本身[1]。除宿主对氨基酸的代谢利用外,肠道微生物也能代谢利用氨基酸[2-5]。肠道微生物可降解氨基酸生成氨,氨在肠道中的浓度主要取决于微生物对氨利用和合成的净差[6-7]。研究发现,添加抗生素能降低空肠和回肠中的微生物数量,减少微生物对氨基酸的代谢利用,使更多的氨基酸进入血液;也能增加进入大肠的氨基酸数量,大肠微生物分解氨基酸产生大量有害物质,进而影响大肠健康[8-9]。肠道微生物利用脱羧酶对谷氨酸脱羧产生代谢产物,如神经活性调节物质γ-氨基丁酸[2, 5-6, 9-10]。肠道微生物在肠道氨基酸代谢中十分重要。猪饲粮不同分子结构蛋白质饲料氮源因营养代谢存在差异,进而改变猪的肠道微生物多样性[10],使得肠道微生物各类代谢相关酶的活性和氨基酸的消失率产生差异,最终改变氮的排放量及饲料的有效利用率。印遇龙[11]认为,可以在体外通过模拟动物的生理过程来预测机体的氨基酸消失量,氨基酸消失量与机体的代谢体重成恒定比例,消化道损失量与饲料干物质摄入量呈线性相关,并受肠腔内饲粮蛋白质结构的影响[12]。本试验通过分离猪肠道微生物体外研究猪肠道微生物对不同分子结构蛋白质饲料源(大豆蛋白质、大豆肽、单体氨基酸)氨基酸消失率的差异性响应规律。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验动物为30 kg左右的健康杜×长×大三元杂交猪。谷草转氨酶(glutamic-oxalacetic transaminase, GOT)、谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase, GPT)、腺苷脱氨酶(adenosine deaminase, ADA)生化试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。常规生化试剂购于上海生工生物工程股份有限公司。
厌氧基础培养基组分[13]:每升溶液含有0.6 g KCl,0.6 g NaCl,0.2 g CaCl2·2H2O,0.5 g MgSO4·7H2O,1 mL刃天青溶液,10 mL微量矿物质溶液,10 mL氯化血红素溶液,10 mL脂肪酸溶液,50 mL碳酸氢盐溶液,4 g葡萄糖,0.1 g NH4Cl,1.46 g KH2PO4,3.55 g Na2HPO4。各溶液配方如下(除碳酸氢盐溶液外,所有储备溶液均储存于4 ℃,各溶液均用蒸馏水配制)。
刃天青溶液:将100 mg刃天青溶解在100 mL水中。
微量矿物质溶液:依次添加25 mg MnCl2·4H2O、20 mg FeSO4·7H2O、25 mg ZnCl2、25 mg CuCl2·2H2O、50 mg CoCl2·6H2O、50 mg SeO2、250 mg NiCl2·6H2O、250 mg Na2MoO4·2H2O、31.4 mg NaVO3、250 mg H3BO3至20 mL 0.02 mol/L盐酸溶液中,然后加入水定容到1 L。
氯化血红素溶液:将100 mg氯化血红素溶解在5 mL 0.05 mol/L NaOH溶液中,然后加入沸水(连续用CO2充气)制备氯化血红素溶液,加入水定容到1 L。
脂肪酸溶液:将6.85 mL乙酸、3.00 mL丙酸、1.84 mL丁酸、0.55 mL戊酸加入到0.2 mol/L NaOH溶液中,加入水定容到1 L。
碳酸氢盐溶液:现配现用,将8.2 g Na2CO3(无水)溶解在100 mL沸水(连续用CO2充气)中。
维生素/磷酸盐溶液:将20.4 mg生物素、20.5 mg叶酸、164 mg D-泛酸钙、164.0 mg烟酰胺、164.0 mg核黄素、164.0 mg硫胺-HCl、164.0 mg吡哆醇-HCl、20.4 mg对氨基苯甲酸、20.5 mg氰钴胺素(维生素B12)加入到1 L含有54.7 g KH2PO4的溶液中。使用前,过滤灭菌(通过0.22 μm过滤器)到无菌螺帽管中。
还原剂溶液:将20.5 g Na2S·9H2O溶解在1 L沸水(用CO2连续充气)中,使用前高压灭菌。
1.2 试验方法选取3头30 kg左右的健康杜×长×大三元杂交生长猪,屠宰后将其放置于手术台的无菌桌布上,用酒精消毒其皮肤表面,打开腹腔,找到空肠、回肠、盲肠位置,在空肠和回肠的中间部位选取20~30 cm长度,用无菌棉线将所需肠段两端打结,盲肠与回肠连接处打结,然后剪断结扎处外侧(不需要的肠段一侧),将空肠、回肠、盲肠3段组织分别放置于无菌白瓷盘内,在超净工作台内用无菌手术剪剪破肠段开一个小口,双手固定肠段,使内容物直接流入(或轻轻挤压)无菌容器内得到样本。然后取50 mL空肠、回肠、盲肠内容物分别置于500 mL厌氧基础培养基中梯度离心得到相应微生物悬混液。在250 mL锥形瓶中加入50 mL厌氧基础培养基,先取5 mL空肠微生物悬混液接种于50 mL预热的培养基中,培养4 h后取5 mL培养液用于氨基酸含量和酶活性测定;再加入5 mL回肠微生物悬混液继续培养4 h后,取5 mL培养液用于氨基酸含量和酶活性测定;最后加入5 mL盲肠微生物悬混液继续培养4 h后,取5 mL培养液用于氨基酸含量和酶活性测定。试验分为3组,分别为大豆蛋白质(soybean protein,SPT)组(基础培养基+大豆蛋白质+微生物)、大豆肽(soybean peptide,SPP)组(基础培养基+大豆肽+微生物)、单体氨基酸(monomeric amino acid,MAA)组(基础培养基+单体氨基酸+微生物),另设1个负对照组(基础培养基+微生物),3个正对照组(基础培养基+大豆蛋白质、基础培养基+大豆肽、基础培养基+单体氨基酸),每组设3个重复。各组培养基的氨基酸含量见表 1,试验流程见图 1。
赖氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、组氨酸脱羧酶、甘氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶活性的测定参照唐志如等[14]和赖星等[15]的方法进行。根据南京建成生物工程研究所的试剂盒说明,用紫外分光光度计,采用比色法测定GOT、GPT、ADA活性。
1.4 氨基酸含量的测定 1.4.1 样品的前处理准确称取培养液样品100 mg于15 mm×150 mm试管中,向盛有样品的试管中加入10 mL 6 mol/L HCl,振荡混匀。用酒精喷灯把该试管口下1/3处拉细到4~6 mm,抽真空10 min后封管。处理过的试管置(110±1) ℃恒温烘箱中沙浴水解22 h,拿出冷却至室温,摇匀过滤,取1 mL滤液于50 mL烧杯中,用60 ℃恒温水浴蒸干滤液,加入0.02 mol/L HCl稀释6倍,用0.22 μm滤膜过滤上机分析。
1.4.2 分析条件采用日立L-8800型全自动氨基酸分析仪测定氨基酸含量。1个样品的分析周期为53 min,配有1)分离柱:4.6 mm×60 mm,洗脱液流速0.4 mL/min,柱温70 ℃,柱压12.627 MPa;2)反应柱:茚三酮及茚三酮缓冲液流速0.35 mL/min,柱温135 ℃,柱压1.078 MPa。
1.5 数据统计与分析采用SAS 9.0统计软件对测量数据进行单因素方差分析和显著性检验,试验结果用平均值和标准误(SE)表示,P < 0.05为差异显著,P < 0.01为差异极显著。氨基酸消失率(Dt)的计算公式[5]如下:
式中:Dt为t h游离氨基酸的消失率;AA0为0 h试验组游离氨基酸含量;AAt为t h试验组游离氨基酸含量;PC0为0 h正对照组游离氨基酸含量;PCt为t h正对照组游离氨基酸含量;NC0为0 h负对照组游离氨基酸含量;NCt为t h负对照组游离氨基酸含量。
2 结果与分析 2.1 不同分子结构蛋白质饲料源对猪肠道微生物酶活性的影响由表 2可知,接种空肠微生物培养4 h后,除GOT和GPT活性存在显著差异(P < 0.05)外,各组其他酶活性均存在极显著差异(P < 0.01)。单体氨基酸组的精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、酪氨酸脱羧酶和ADA活性均极显著高于大豆肽组和大豆蛋白质组(P < 0.01);大豆蛋白质组除组氨酸脱羧酶外其他酶活性均显著高于大豆肽组(P < 0.05)。因此空肠微生物氨基酸脱羧酶活性从高到低依次为:单体氨基酸组、大豆蛋白质组、大豆肽组。
接种回肠微生物培养4 h后,各组各种酶活性均存在极显著性差异(P < 0.01)。大豆肽组的组氨酸、甘氨酸、酪氨酸脱羧酶和GOT、GPT活性均极显著高于单体氨基酸组和大豆蛋白质组(P < 0.01);单体氨基酸组的组氨酸、甘氨酸脱羧酶和GOT、GPT、ADA活性均极显著高于大豆蛋白质组(P < 0.01)。因此回肠微生物氨基酸脱羧酶和转氨酶活性从高到低依次为:大豆肽组、单体氨基酸组、大豆蛋白质组。回肠微生物ADA活性从高到低依次为:单体氨基酸组、大豆肽组、大豆蛋白质组。
接种盲肠微生物培养4 h后,单体氨基酸组和大豆肽组的精氨酸脱羧酶和GOT活性均显著高于大豆蛋白质组(P < 0.05)。因此盲肠微生物部分酶活性从高到低依次为:单体氨基酸组、大豆肽组、大豆蛋白质组。
2.2 不同分子结构蛋白质饲料源对猪肠道氨基酸消失率的影响由表 3可知,接种空肠微生物培养4 h后,大豆蛋白质组氨基酸均出现消失,其中蛋氨酸、异亮氨酸、缬氨酸消失程度最大。除单体氨基酸组的脯氨酸外,单体氨基酸组和大豆肽组的其他氨基酸未出现消失。不同蛋白质饲料源氨基酸在空肠微生物作用下的消失率由高到低依次为:大豆蛋白质组、单体氨基酸组、大豆肽组。
接种回肠微生物培养4 h后,各组的氨基酸消失率均存在极显著差异(P < 0.01)。单体氨基酸组除谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸、组氨酸几种氨基酸的消失率极显著低于大豆肽组(P < 0.01)外,单体氨基酸组的其他几种氨基酸及总氨基酸消失率均极显著高于大豆肽组(P < 0.01),特别是酪氨酸消失率。与空肠各氨基酸消失率相比,在回肠中,大豆肽组的各氨基酸的消失率均有提高;大豆蛋白质组只有半胱氨酸表现出有所消失,但是消失率较低。不同蛋白质饲料源氨基酸在回肠微生物作用下的消失率由高到低依次为:单体氨基酸组、大豆肽组、大豆蛋白质组。
接种盲肠微生物培养4 h后,大豆肽组和单体氨基酸组大多数氨基酸及总氨基酸的消失率极显著低于大豆蛋白质组(P < 0.01)。不同蛋白质饲料源氨基酸在盲肠微生物作用下的消失率由高到低依次为:大豆蛋白质组、单体氨基酸组、大豆肽组。
综合空肠、回肠、盲肠中各氨基酸消失率可得出:大豆蛋白质组的氨基酸在空肠和盲肠均有消失,并且消失率都是最高,消失程度表现为空肠小于盲肠;大豆肽组的氨基酸除谷氨酸、半胱氨酸、赖氨酸外,其他氨基酸在回肠、盲肠中均是逐渐消失的;单体氨基酸组的氨基酸消失基本在回肠,在盲肠中也有消失,但是只是部分氨基酸。
由图 2可知,大豆蛋白质组的总氨基酸消失率在空肠和盲肠中都远远高于大豆肽组和单体氨基酸组,在盲肠中最高接近70%;而大豆肽组和单体氨基酸组的总氨基酸消失率最高也未达到30%,在盲肠中未达到10%。总体上大豆蛋白质组的总氨基酸消失率最高。
对比微生物脱羧酶、转氨酶、脱氨酶活性和氨基酸消失率结果,可以发现:在空肠中,大豆蛋白质组的各脱羧酶活性处于中等水平,GOT和GPT活性较高,但其氨基酸消失率却是最高,其他分子结构相对简单的2组几乎没有氨基酸消失;到回肠后,大豆肽组和单体氨基酸组的各种酶活性和氨基酸消失率同时上升,而大豆蛋白质组的酶活性低且几乎没有氨基酸消失;到盲肠后,大豆蛋白质组的酶活性又达到最高,氨基酸消失率也处于最高水平,其他2组酶活性低,但是也有部分氨基酸消失,其氨基酸消失率远远低于大豆蛋白质组。本试验中,各种酶活性大小与氨基酸消失率高低并不完全一致,原因可能是除脱羧酶、转氨酶的作用外,氨基酸消失还有其他途径,可能被微生物直接吸收,或是脱氨酶等的作用[16],微生物酶对氨基酸的代谢作用并非占主导地位,这一点还需要进一步研究[17]。赖星等[15]研究发现,饲粮粗蛋白质水平显著影响肠道微生物酶活性,这是肠道微生物对氨基酸差异性降解和动物对蛋白质利用率低的原因之一,可见微生物酶与饲粮蛋白质的利用存在很大关系[18],本试验中大豆蛋白质组的总氨基酸消失率最高。对比不同肠段可以发现,氨基酸消失率存在肠段特异性,这与戴兆来[19]的研究结果存在一致性。
结构较简单的两组氨基酸分解力度由高到低依次为:回肠、盲肠、空肠。环境中有氨基酸存在时微生物才会产生相应的酶来分解该氨基酸,在初期,大豆肽组中游离氨基酸很少,因此空肠微生物的氨基酸脱羧酶活性还不高,并且酶活性受pH影响,有研究表明饲料成分等因素影响培养环境的pH,且越到后肠道pH越高[9],所以在空肠中大豆肽组的氨基酸基本上没有消失;到了盲肠,微生物多样性不同于空肠[20],环境中的pH等影响酶发挥活性的因素也达到适合条件后,氨基酸才开始消失[21]。但是,本试验中大豆肽组的氨基酸消失率一直都很低,在动物肠道中蛋白质和肽段并不是只有分解为氨基酸后才能进行消化吸收,邓敦等[12]指出小肽的吸收具有速度快、耗能低及能避免与氨基酸竞争等特点,且可以直接通过转运系统吸收,因此对肽的吸收可能主要集中于转运系统而非微生物脱羧酶作用。对于单体氨基酸组,在各种氨基酸的刺激下,微生物快速产生大量氨基酸脱羧酶,在空肠时各种氨基酸脱羧酶的活性已经达到最大值,但是此时该处环境或许还未达到酶发挥活性的最佳条件,且受微生物多样性差异等的影响[20],在空肠时酶活性虽然高,但却没有太多氨基酸消失;到回肠时,pH、渗透压等影响酶发挥活性的因素都达到适合条件,氨基酸才开始大量消失。小肠末端吸收的氨基酸高达饲粮氨基酸摄入量的35%,本试验中单体氨基酸组氨基酸基本在回肠消失,结果与前人研究存在一致性[11, 22-23]。总体上,单体氨基酸组的总氨基酸消失率大于大豆肽组。
大豆蛋白质组的氨基酸分解力度由高到低依次为:盲肠、空肠、回肠。在空肠中,由于缺少游离氨基酸刺激微生物生成脱羧酶,大豆蛋白质组的氨基酸脱羧酶活性低,氨基酸消失率也不高,但均高于其他两组;到回肠时反而没有氨基酸消失,原因可能是由于微生物的作用,氨基酸的合成与分解同时进行,形成动态平衡,所以基本上不能检测到氨基酸消失;到了盲肠,微生物多样性更丰富[5],代谢更旺盛,氨基酸才开始大量分解[11]。Dai等[22]研究认为,小肠中的细菌氨基酸代谢是高度区室化的,在小肠细菌中以种类和肠道依赖性方式对氨基酸进行代谢,空肠混合细菌和回肠混合细菌的氨基酸代谢是不同的,而盲肠属于大肠,与空肠、回肠的区别应该会更大,这种多样性可能有助于肠道内的氨基酸稳态。张福哲[8]研究也发现,蛋氨酸和苯丙氨酸在盲肠的消失率要大于回肠,盲肠微生物代谢产生的短链脂肪酸量是最多的,说明盲肠微生物代谢的活跃,与本试验结果相似。
总体来说,从空肠、回肠到盲肠,越靠近后肠段微生物对各种氨基酸的代谢越高,这一结果与余凯凡等[24]对蛋氨酸的体外代谢研究结果一致。戴求仲等[25]认为,现行的猪回肠末端氨基酸真消化率可作为预测消化道氨基酸吸收的最佳方法,可见后肠道微生物对氨基酸代谢的重要性是公认的。刘颖[26]对梅山猪的研究发现,不同肠段微生物优势菌存在差异,这对氨基酸的消失率也会带来影响。大豆蛋白质组的总氨基酸消失率最高,其原因可能是肠道微生物在长期的进化过程中,传统的饲粮都是大豆蛋白质或其他蛋白质,并未直接饲喂单体氨基酸或者多肽。Lamendella等[27]对猪肠道微生物宏基因组研究发现,存在与抗生素和碳水化合物代谢抗性相关的基因,这表明猪肠道微生物组可以通过饲养方法形成,所以也存在肠道微生物的种类更适合对饲粮蛋白质进行代谢,而对单体氨基酸和多肽并不敏感。Isaacson等[20]也认为肠道微生物组的细菌成分随着动物的进展而紧密地进化,这样做有助于动物的整体发育和代谢需要。
4 结论① 体外培养条件下,结构较复杂的蛋白质在盲肠中的氨基酸消失率最大,结构较简单的大豆肽和单体氨基酸主要在回肠消失。
② 总体上,大豆蛋白质组的总氨基酸消失率最高,肠道内微生物对蛋白质形式的大豆蛋白质分解代谢更旺盛。
③ 与前肠段相比,后肠段微生物对不同分子结构蛋白质饲料源的分解更旺盛。
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