2. 河南普尼尔生物科技有限公司, 郑州 450003;
3. 河南省兽药饲料监察所, 郑州 450003
2. Henan Punier Biotechnology Co., Ltd., Zhengzhou 450003, China;
3. Henan Veterinary Drug Feed Inspection Institute, Zhengzhou 450003, China
仔猪断奶后，由于受到食物、环境温度改变，重新分栏等各种因素的影响，容易出现断奶应激，导致腹泻、抑制生长，甚至死亡[1-2]。在仔猪饲粮中添加抗生素，能有效降低腹泻率和死亡率，促进仔猪生长。然而，长期滥用抗生素使细菌产生耐药性，畜产品和环境药物残留已引起人们的广泛关注。因此，寻找高效的绿色添加剂成为动物营养学研究的重点。肠道营养保健剂的主要成分是壳寡糖、L-抗坏血酸和乳酸等，其具有抗氧化[3-4]、调节免疫功能[5]、改善肠道菌群[6]，提高抗应激能力[7]、饲料利用率[8-9]、母猪繁殖性能[10]等生理作用。本试验通过在母猪和仔猪饲粮中添加肠道营养保健剂2种处理方法及其交互作用来研究肠道营养保健剂对断奶仔猪生长性能、血清生化指标和粪便微生物区系的影响，为肠道营养保健剂在养猪生产中的应用提供试验依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验用母猪肠道营养保健剂和仔猪肠道营养保健剂由河南普尼尔生物制药有限公司提供。母猪肠道营养保健剂主要成分：壳寡糖(≥0.1%)、L-抗坏血酸(≥6.0%)、乳酸(≥5.0%)等；仔猪肠道营养保健剂主要成分：壳寡糖(≥0.02%)、L-抗坏血酸(≥10.0%)、乳酸(≥3.0%)等。
1.2 试验设计与试验动物本试验在南阳东嘉农牧开发有限公司某猪场进行。
母猪饲养试验：选择2胎、体况相似、健康的长白×大白妊娠母猪40头，单栏饲养，并随机分为2组，每组20个重复，每个重复1头猪，从产前7天开始，添加组(n=20)母猪饲喂基础饲粮+母猪肠道营养保健剂，非添加组(n=20)母猪仅饲喂基础饲粮，直至母猪分娩后21天。母猪基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 母猪基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet for sows (air-dry basis) |
哺乳仔猪饲养试验：从母猪饲养试验中的添加组和非添加组中各选取20窝仔猪，按照2×2双因子试验设计，分为对照组(母仔猪非添加组)、仔猪添加组、母猪添加组和母仔猪添加组，每组10窝仔猪。试验设计如表 2所示。从7日龄开始，母仔猪添加组(n=10)和仔猪添加组(n=10)的仔猪开始补喂仔猪肠道营养保健剂稀释液，母猪添加组和对照组仔猪则不补喂仔猪肠道营养保健剂稀释液，直至仔猪21日龄断奶。
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表 2 试验设计 Table 2 Experimental design |
断奶仔猪饲养试验：仔猪断奶后，从相应每个哺乳仔猪试验组的10窝仔猪中挑选90头断奶仔猪，在组内随机重新分为6个重复(栏)，每个重复(栏)15头。母仔猪添加组(n=6)和仔猪添加组(n=6)断奶仔猪饲喂基础饲粮+仔猪肠道营养保健剂，母猪添加组(n=6)和对照组(n=6)断奶仔猪则仅饲喂基础饲粮，直至70日龄试验结束。断奶仔猪基础饲粮组成及营养水平见表 3。
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表 3 断奶仔猪基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 3 Composition and nutrient levels of the basal diet for weaned piglets (air-dry basis) |
饲养方法：所有饲喂及饲养管理方式均按照试验猪场日常饲养管理条例进行。
哺乳阶段：从产前7天开始在添加组母猪饲粮中添加4 g/kg母猪肠道营养保健剂，直至仔猪21日龄断奶哺乳结束当天，喂料量按常规添加，按水料比2.5 : 1.0加水喂粥料；从仔猪7日龄开始，将仔猪肠道营养保健剂与水按1 : 70的比例进行稀释，每天在仔猪活动明显时把仔猪肠道营养保健剂稀释液缓缓倒入补料槽中。开始时每窝每次加50 mL，每天加4次，随着日龄的增加，肠道营养保健剂稀释液补喂量逐渐增加，每天每次增加5 mL，直到仔猪21日龄断奶。
断奶仔猪阶段：每天投料5~6次，以每个重复为单位记录试验期内的投料量。断奶仔猪在22~28日龄的饲粮中添加1.0%仔猪肠道营养保健剂，在29~70日龄的饲粮中添加0.3%仔猪肠道营养保健剂，全程饲喂干料直到仔猪70日龄。整个试验期内仔猪自由采食，自由饮水。
1.4 样品采集与处理于断奶仔猪28、35和70日龄以每个重复为单位采集新鲜粪样，每次采集的样品于-20 ℃保存备用。
所有断奶仔猪禁食12 h后，于试验70日龄早上，分别从每个组随机抽取中等体况的猪6头(公母各3头)，前腔静脉采血5 mL，采集的血液置促凝管中，静置30 min，在4 ℃条件下以3 000 r/min离心10 min，取上清液即为血清，于-20 ℃下保存待用。
1.5 指标测定与方法 1.5.1 母猪平均日采食量(ADFI)和繁殖性能统计母猪不同阶段的采食量，计算ADFI；母猪分娩时记录总产仔数、初生个体重、产活仔数、健仔数、弱仔数、死胎与木乃伊数。
1.5.2 哺乳仔猪生长性能分别于出生及22日龄断奶时进行称重，分别为试验初重和试验末重，记录断奶仔猪数、断奶窝重，记录每天投料量，计算平均出生重、平均断奶重和平均日增重(ADG)。
1.5.3 断奶仔猪生长性能记录每天投料量，每周结料1次，于断奶仔猪22和70日龄早晨空腹称重，分别为试验初重和试验末重，计算ADG、ADFI和料重比(F/G)。
1.5.4 腹泻率以每窝仔猪为单位记录每天腹泻头数，计算腹泻率。
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以组为单位，记录仔猪死亡情况，计算死亡率。
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血清送至郑州颐和医院，检测生化指标。
1.5.7 养分表观消化率采用GB/T 6435—2014方法测定水分含量，然后通过计算得出干物质含量，采用凯氏定氮法测定粗蛋白质含量，采用索氏提取法测定粗脂肪含量采用氧弹式测热法测定总能，采用酸不溶灰分法测定养分表观消化率。养分表观消化率的计算方式如下：
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式中:a为饲粮中该养分含量; b为粪样中该养分含量; c为饲粮中酸不溶灰分含量; d为粪样中酸不溶灰分含量。
1.5.8 粪便微生物区系采用细菌16S rRNA荧光定量PCR法[11]测定粪样乳酸杆菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、肠球菌和拟杆菌的数量。
参照Zoetendal等[12]的方法，进行粪便细菌DNA的提取。根据NCBI发表的基因序列进行引物设计，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本试验所用5种细菌16S rRNA基因序列的上、下游引物及PCR反应参数如表 4所示。以从粪便提取的细菌DNA为模板，用目的基因的引物进行半定量PCR，鉴定引物的特异性。采用试剂盒(TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒)对PCR产物纯化制备标准品，具体步骤参考说明书；计算标准品拷贝数，公式如下：
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表 4 引物信息 Table 4 Primer information |
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使用实时荧光定量PCR仪(CFX96 Touch)进行定量分析，PCR反应体系为10 μL：2×Realtime PCR Master Mix 5 μL，上、下游引物各0.25 μL，DNA 1 μL，ddH2O 3.5 μL。PCR扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，52~70 ℃退火25 s；72 ℃延伸30 s，共39个循环；95 ℃变性10 s，65 ℃退火30 s，95 ℃延伸35 s。读取荧光定量Cq值。标准品的梯度稀释：以无菌去离子水10倍连续稀释标准品，将乳酸杆菌、肠球菌和拟杆菌稀释成108~103拷贝数/μL，将双歧杆菌和芽孢杆菌稀释成107~102拷贝数/μL，从而获得制备定量PCR标准曲线的模板。反应体系加入PCR八联排中进行定量PCR扩增，扩增结果用Excel 2016制作标准曲线，代入计算每个样品的每克湿便拷贝数的对数值。
1.6 数据处理与统计分析应用SPSS 18.0统计分析软件进行数据统计分析，哺乳仔猪和断奶仔猪的腹泻率和死亡率采用卡方检验分析；母猪ADFI、产活仔数、健仔数、弱仔数、死胎与木乃伊头数、初生个体重以及断奶仔猪初重和末重采用单因素方差分析，结合LSD法进行组间多重比较；断奶仔猪ADFI、ADG和F/G采用协方差分析，以双因素[母猪肠道营养保健剂(有、无)和仔猪肠道营养保健剂(有、无)]为变量，初重为协变量进行方差分析；哺乳仔猪平均初生重、平均断奶重、ADG以及断奶仔猪养分表观消化率、血清生化指标和粪便微生物区系采用双因素[母猪肠道营养保健剂(有、无)和仔猪肠道营养保健剂(有、无)]方差分析，结合Duncan氏法进行组间多重比较。结果表示为平均值±标准差，以P < 0.05作为差异显著标准，以P < 0.01作为差异极显著标准。
2 结果 2.1 肠道营养保健剂对母猪ADFI和繁殖性能以及哺乳仔猪生长性能、腹泻率和死亡率的影响由表 5可知，与非添加组相比，饲粮添加肠道营养保健剂对母猪ADFI、产活仔数、健仔数、弱仔猪、死胎与木乃伊头数和初生个体重无显著影响(P>0.05)。
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表 5 肠道营养保健剂对母猪ADFI和繁殖性能的影响 Table 5 Effects of enteral nutrition and health supplement on ADFI and reproductive performance of sows |
由表 6可知，添加母猪和仔猪肠道营养保健剂以及二者的交互作用对哺乳仔猪的平均初生重、平均断奶重以及ADG均无显著影响(P＞0.05)，但母仔猪添加组和仔猪添加组的ADG均比对照组提高约4%。
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表 6 肠道营养保健剂对哺乳仔猪生长性能的影响 Table 6 Effects of enteral nutrition and health supplement on growth performance of lactating piglets |
由图 1可知，添加肠道营养保健剂可不同程度地降低哺乳仔猪腹泻率和死亡率。与对照组相比，母仔猪添加组和母猪添加组腹泻率分别降低37.30%和40.42%(P < 0.01)；母仔猪添加组死亡率降低58.81%(P < 0.01)。
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数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P < 0.01)，相同或者无字母表示差异不显著(P>0.05)。图 2同。 Value columns with different small letters mean significant difference (P < 0.05), and with different uppercase letters mean significant extremely difference (P < 0.01), while with the same or no letters mean no significant difference (P > 0.05). The same as Fig. 2. 图 1 肠道营养保健剂对哺乳仔猪腹泻率和死亡率的影响 Fig. 1 Effects of enteral nutrition and health supplement on diarrhea rate and mortality of lactating piglets |
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图 2 肠道营养保健剂对断奶仔猪腹泻率和死亡率的影响 Fig. 2 Effects of enteral nutrition and health supplement on diarrhea rate and mortality of weaned piglets |
由表 7可知，添加母猪和仔猪肠道营养保健剂对断奶仔猪的初重、末重、ADG以及F/G均无显著影响(P>0.05)。添加母猪和仔猪肠道营养保健剂对断奶仔猪的ADG呈现出显著的交互作用(P=0.026)，母猪不添加肠道营养保健剂时，相对于不添加肠道营养保健剂的仔猪，添加肠道营养保健剂的仔猪的ADG得到显著提高(P < 0.05)。
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表 7 肠道营养保健剂对断奶仔猪生长性能的影响 Table 7 Effects of enteral nutrition and health supplement on growth performance of weaned piglets |
由图 2可知，与对照组相比，仔猪添加组，母猪添加组、母仔猪添加组断奶仔猪腹泻率均极显著降低(P < 0.01)，直接给仔猪添加肠道营养保健剂(仔猪添加组、母仔猪添加组)比仅给母猪添加肠道营养保健剂(母猪添加组)更能极显著降低腹泻率(P < 0.01)；断奶仔猪死亡率在各组间差异不显著(P>0.05)。
2.3 肠道营养保健剂对断奶仔猪血清生化指标的影响由表 8可知，添加母猪和仔猪添加肠道营养保健剂对断奶仔猪血清谷丙转氨酶活性呈现出显著的交互作用(P=0.016)，与母猪添加组相比，母仔猪添加组断奶仔猪的血清谷丙转氨酶活性降低了34.49%，差异显著(P < 0.05)；添加仔猪肠道营养保健剂对谷丙转氨酶/谷草转氨酶值呈现出显著的主效应(P=0.011)，母仔猪添加组血清谷丙转氨酶/谷草转氨酶值显著高于对照组和母猪添加组(P < 0.05)；添加母猪肠道营养保健剂对血清磷含量呈现出显著的主效应(P=0.007)，母猪添加组血清磷含量比对照组和仔猪添加组增加了14.35%，差异显著(P < 0.05)。
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表 8 肠道营养保健剂对断奶仔猪血清生化指标的影响 Table 8 Effects of enteral nutrition and health supplement on serum biochemical parameters of weaned piglets |
由表 9可知，添加仔猪添加肠道营养保健剂对断奶仔猪干物质、总能、粗蛋白质和粗脂肪的表观消化率均产生了极显著影响(P < 0.001)；此外，添加母猪和仔猪肠道营养保健剂对干物质(P=0.016)、总能(P=0.029)、粗蛋白质(P=0.017)和粗脂肪的表观消化率(P < 0.001)呈现出显著或极显著的交互作用。与对照组相比，无论添加母猪肠道营养保健剂与否，添加仔猪肠道营养保健剂均能显著改善断奶仔猪干物质、总能、粗蛋白质和粗脂肪的表观消化率(P < 0.05)。
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表 9 肠道营养保健剂对断奶仔猪养分表观消化率的影响 Table 9 Effects of enteral nutrition and health supplement on apparent digestibility of nutrients of weaned piglets |
由表 10可知，添加母猪和仔猪添加肠道营养保健剂对断奶仔猪70日龄粪便中双歧杆菌(P=0.032)和拟杆菌数量(P=0.021)呈现出显著的交互作用，添加仔猪肠道营养保健剂对断奶仔猪28日龄粪便中双歧杆菌(P=0.015)、芽孢杆菌(P=0.027)和拟杆菌(P=0.013)，35日龄粪便中乳酸杆菌(P=0.014)、双歧杆菌(P=0.008)和芽孢杆菌(P=0.002)，70日龄粪便中拟杆菌数量(P=0.043)呈现出显著或极显著的主效应。母仔猪添加组28日龄粪便中双歧杆菌和芽孢杆菌数量显著高于母猪添加组和对照组(P < 0.05)；母仔猪添加组和仔猪添加组35日龄粪便中双歧杆菌和芽孢杆菌数量显著高于对照组(P < 0.05)；仔猪添加组70日龄粪便中双歧杆菌数量显著高于对照组(P < 0.05)；母仔猪添加组70日龄粪便中拟杆菌数量显著低于其他3组(P < 0.05)。
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表 10 肠道营养保健剂对断奶仔猪粪便微生物区系的影响 Table 10 Effects of enteral nutrition and health supplement on fecal microflora of weaned piglets |
初生仔猪自身免疫能力低下，环境温度变化等造成初生仔猪腹泻；断奶会引起仔猪氧化应激，而且刚断奶仔猪胃肠道结构未发育完善，消化酶分泌不足，肠道乳酸分泌减少，不仅影响饲料养分的消化吸收，还会引起仔猪营养性腹泻[13]，免疫力、抗病力降低，影响生长，甚至死亡。Upadhaya等[9]和De Rodas等[4]研究显示，添加有机酸和维生素C能够明显提高断奶仔猪的ADG，降低F/G。本试验中，与对照组相比，母仔猪添加组、仔猪添加组哺乳仔猪的ADG分别提高了4.05%和3.75%，母仔猪添加组、母猪添加组和仔猪添加组断奶仔猪的ADG分别提高5.83%、11.72%和11.64%，但差异均不显著。哺乳仔猪ADG变化不显著可能是因为哺乳期间添加肠道营养保健剂是通过母猪饲喂和仔猪补水形式添加，被仔猪摄入的量有限。Zhou等[14]和吴秋玉等[15]研究发现，添加壳聚糖和有机酸能够明显改善断奶仔猪的腹泻情况；郭勇[16]研究显示，在母猪饲粮中添加500 mg/kg维生素C能够提高21日龄断奶仔猪的成活率。本试验结果显示，与对照组相比，母仔猪添加组和母猪添加组哺乳仔猪的腹泻率分别显著降低37.30%和40.42%，母仔猪添加组死亡率显著降低58.81%；仔猪添加组、母猪添加组和母仔猪添加组断奶仔猪腹泻率分别显著降低77.24%、36.18%和70.73%，死亡率分别降低15.42%、38.47%和11.53%；同时，仔猪添加组和母仔猪添加组断奶仔猪的腹泻率显著低于母猪添加组，说明断奶后饲粮中添加肠道营养保健剂比仅在哺乳阶段母猪饲粮中添加肠道营养保健剂更显著地改善仔猪腹泻。
3.2 肠道营养保健剂对断奶仔猪血清生化指标的影响血清尿素含量越低说明氮的利用率越高[17]。徐长跃[18]试验表明，饲粮中添加0.3%和0.4%短链酮酸的断奶仔猪血清中球蛋白和高密度脂蛋白含量升高，尿素氮含量降低。本次试验结果显示，与对照组相比，母仔猪添加组和仔猪添加组断奶仔猪血清中尿素含量分别降低21.02%和12.65%，说明可以通过在仔猪饲粮中添加肠道营养保健剂提高断奶仔猪机体对蛋白质的消化吸收，降低血清尿素含量，促进其生长。本试验中母仔猪添加组血清谷丙转氨酶活性比母猪添加组显著降低了34.49%，而血清谷丙转氨酶活性升高说明肝脏受到损伤[19]，因此可推断添加仔猪肠道营养保健剂能够对肝脏起到保护作用；母猪添加组、仔猪添加组和母仔猪添加组断奶仔猪血清中总胆固醇和甘油三酯含量均较对照组有所降低，说明添加肠道营养保健剂能够更好地改善脂类代谢。添加仔猪肠道营养保健剂对断奶仔猪血清钙含量有呈现主效应的趋势，能够增加血清钙的含量，钙离子(Ca2+)是血浆、细胞外和细胞内液体及骨形成等信号转导和调节必不可少的生理基础[20]，主要在小肠中吸收[21]，机体钙含量减少容易引起骨质疏松[22]，有上述结果可知添加仔猪肠道营养保健剂能够促进Ca2+的吸收，进而有利于促进仔猪骨骼的生长发育。
3.3 肠道营养保健剂对断奶仔猪养分表观消化率的影响养分的表观消化率可以直观地反映出机体消化系统的状况，间接地反映机体的生长发育情况。Seven[23]和Wang等[24]研究结果显示添加维生素C和壳聚糖能够提高干物质、有机物和粗蛋白质等养分的表观消化率。本试验结果显示，添加母猪和/或仔猪肠道营养保健剂均能够显著提高断奶仔猪饲粮中干物质、粗蛋白质、粗脂肪和总能的表观消化率，且添加母猪和仔猪肠道营养保健剂对各养分表观消化率存在极显著或显著的交互作用，表现为仔猪添加组显著高于母仔猪添加组，母猪添加组显著高于对照组。这可能是因为肠道营养保健剂中的壳寡糖、L-抗坏血酸、乳酸等能够在肠道中发挥各自功能，改善胃肠道环境，生成蛋白酶、淀粉酶等各种消化酶，以及生成各种营养物质，被机体吸收利用，从而提高干物质、蛋白质、脂肪、能量等养分的消化率。这与本试验中断奶仔猪ADG的增长趋势相一致。
3.4 肠道营养保健剂对断奶仔猪粪便微生物区系的影响作为肠道屏障的重要组成部分之一，微生物屏障对动物机体健康起着重要作用。饲粮的改变、环境温度的突然变化会造成仔猪应激，使肠道菌群失衡，引发肠道炎症，引起腹泻、采食量减少，影响动物的生长发育[25]。安胜英等[26]试验表明，饲粮中添加0.3%的维生素C能够极显著降低蛋雏鸡肠道大肠杆菌和沙门氏菌数量，显著增加双歧杆菌数量。Walsh等[27]研究发现，饲粮中添加5~10 ku和10~50 ku壳聚糖能够显著增加断奶仔猪盲肠乳酸杆菌数量，显著降低大肠杆菌数量。Upadhaya等[9]研究报道，饲粮中添加0.2%的有机酸能够显著增加粪便中乳酸杆菌数量。
本试验结果表明，添加母猪和仔猪肠道营养保健剂对断奶仔猪70日龄粪便中双歧杆菌数量存在显著的交互作用，仔猪添加组双歧杆菌数量显著高于对照组；并且，添加仔猪肠道营养保健剂对断奶仔猪28日龄粪便中双歧杆菌和芽孢杆菌，35日龄粪便中乳酸杆菌、双歧杆菌和芽孢杆菌数量呈现出显著或极显著的主效应，添加仔猪肠道营养保健剂均可提高这些微生物的数量；粪便肠球菌数量各组间差异均不显著；添加母猪和仔猪肠道保健剂对断奶仔猪70日龄粪便中拟杆菌数量存在显著的交互作用，母仔猪添加组显著低于其他3组。上述结果说明添加肠道营养保健剂能够有效抑制肠道中拟杆菌的繁殖，增加有益菌(如乳酸杆菌、双歧杆菌和芽孢杆菌)数量，改善微生物区系。
4 结论① 添加肠道营养保健剂可降低哺乳仔猪和断奶仔猪腹泻率和死亡率，改善健康状态，提高断奶仔猪ADG，显著改善养分表观消化率，降低F/G。
② 添加肠道营养保健剂可降低断奶仔猪血清谷丙转氨酶活性，对肝脏具有保护作用；可提高蛋白质消化吸收，降低血清尿素含量，促进生长；可降低血清中甘油三酯和总胆固醇含量，改善脂类代谢。
③ 添加肠道营养保健剂能够增加断奶仔猪肠道有益菌数量，从而改善微生物区系，降低腹泻率和死淘率，促进断奶仔猪健康生长，提高其生长性能。
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