2. 河南加旺生物科技有限公司, 郑州 450002
2. Henan Jiawang Biotechnology Co., Ltd., Zhengzhou 450002, China
抗生素的使用促进了动物生产性能的提高,降低了仔猪腹泻率[1]。但与此同时也导致微生物耐药性[2]、食品药物残留、环境污染[3]等问题。国家农业农村部先后禁止了洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星以及硫酸黏菌素在动物中的应用。目前国内在积极进行抗生素替代物的研究。
酿酒酵母培养物相比于抗生素具有安全无毒、无残留、无污染的特点,其成分复杂,含有丰富的营养物质,可以优化饲料营养价值,提高饲料养分消化率[4],具有提高动物生产性能、增强免疫力的功能。酿酒酵母培养物主要成分是酵母细胞及其代谢产物,其中含有大量寡糖、氨基酸、多肽、蛋白质、有机酸、维生素及酵母来源的酶。目前酿酒酵母培养物在仔猪上的研究已经取得一定的进展。有研究表明,在仔猪饲粮中添加酵母培养物可以显著提高断奶仔猪的生产性能[5-8],改善仔猪肠道环境,降低仔猪腹泻率,增加肠道有益菌的数量,降低肠道有害菌的数量[5],同时提高仔猪饲粮中粗蛋白质、粗脂肪、钙和磷的表观消化率,并确定了酿酒酵母培养物在仔猪中的最适添加量为5 kg/t[7]。但是目前国内对于酿酒酵母培养物替代抗生素在仔猪上的应用效果的研究较少。本文探究酿酒酵母培养物替代抗生素对断奶仔猪生长性能、养分消化率以及肠道微生物区系的影响,为酿酒酵母培养物替代抗生素在生产上的应用提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物与试验设计试验采用完全随机设计,选择体重相近的28日龄的断奶仔猪180头,随机分成3个组,每组4个重复,每个重复15头仔猪。对照组饲喂基础饲粮,基础饲粮为参照NRC(2012)猪(10~20 kg)营养需要配制的颗粒状配合饲料,其组成及营养水平见表 1;抗生素组在基础饲粮中添加75 g/t金霉素+50 g/t吉他霉素+10 g/t维吉尼亚霉素;酿酒酵母培养物组在基础饲粮的基础上添加5 kg/t的酿酒酵母培养物,酿酒酵母培养物由河南邑鸿善成生物技术有限公司提供。
试验开始前对空猪舍进行清扫消毒,仔猪在28日龄断奶后称重分组转到保育舍,试验正式开始,试验期38 d。饲喂采用自由采食的方式,每天08:30、14:00和18:00上料,上料量随仔猪日龄逐渐增加,保证料槽不空料。试验期间仔猪采用自动饮水器自由饮水。每周一、周四进行猪舍消毒,每周一、周四、周日进行卫生大清扫,每天09:00—16:00开窗通风换气,舍内装有地暖以及保温灯,将舍内温度控制在20 ℃以上。每天08:00观察仔猪粪便腹泻情况。其他日常管理按猪场常规要求进行。
1.3 测定指标与方法 1.3.1 生长性能饲养试验期间,于试验第1天和最后1天对每重复仔猪空腹16 h后称重,以重复为单位记录试验期间仔猪的总采食量,计算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。
腹泻率:每天08:00观察仔猪粪便情况,统计每天腹泻仔猪头数,计算腹泻率。
采用内源指示剂法,测定饲粮和粪中酸不溶灰分含量,以重复为单位,于试验第30天开始连续3 d采集新鲜无污染粪样以及饲粮样品,测定粗蛋白质、粗脂肪、钙和磷的表观消化率。
1.3.3 盲肠微生物区系于饲养试验结束的第2天每个重复随机挑选1头健康仔猪进行屠宰,取盲肠内容物于-80 ℃冰箱保存。采用DNA试剂盒提取样品总DNA后,根据保守区设计得到的引物,扩增16S rRNA基因V3~V4可变区,用Illumina HiSeq 2500进行测序。高通量测序得到的原始图像数据文件,经碱基识别分析转化为原始测序序列(sequenced reads)。使用FLASH软件,通过overlap对每个样品的reads进行拼接。使用Trimmomatic软件,对拼接得到的Raw Tags进行过滤。使用QIIME软件中的UCLUST对Tags在97%的相似度水平下进行聚类,获得操作分类单元(OTU),并基于Silva(细菌)和UNITE(真菌)分类学数据库对OTU进行分类学注释。将OTU的代表序列与微生物参考数据库进行比对可得到每个OTU对应的物种分类信息,进而在门和属水平统计各样品群落组成,绘制成物种组成柱状图。
1.4 数据统计及分析采用SPSS 17.0软件对试验数据进行统计分析,结果以平均值±标准差的形式表示。采用ANOVA程序对试验结果进行方差分析,采用Duncan氏法进行多重比较,P<0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 酿酒酵母培养物对断奶仔猪生长性能的影响由表 2可知,抗生素组平均日采食量最高,对照组平均日采食量最低,但是3组之间无显著性差异(P>0.05);抗生素组和酿酒酵母培养物组平均日增重均显著高于对照组(P<0.05),但这2组之间没有显著性差异(P>0.05);抗生素组和酿酒酵母培养物组料重比及腹泻率均显著低于对照组(P<0.05),但这2组之间没有显著性差异(P>0.05)。
由表 3可知,酿酒酵母培养物组和抗生素组之间粗蛋白质、粗脂肪和磷表观消化率差异均不显著(P>0.05),但均显著高于对照组(P<0.05);抗生素组钙表观消化率最高,显著高于对照组(P<0.05),但是与酿酒酵母培养物组之间差异不显著(P>0.05)。
由图 1可知,对照组Shannon指数最高,酿酒酵母培养物组Simpson指数最低,抗生素组Ace指数及Chao指数均最高,但是3组之间的OTU数、Shannon指数、Simpson指数、Ace指数及Chao指数差异均不显著(P>0.05)。
由图 2可知,3组在门水平上的优势菌群组成没有差异,3组的主菌群相同,依次是厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)这四大菌门。其中酿酒酵母培养物组在门水平的4种优势菌的总相对丰度最高,达到了99.60%,对照组的最低为97.51%;酿酒酵母培养物组的四大主菌群的总相对丰度显著高于对照组和抗生素组(P<0.05)。由图 3可知,3组中酿酒酵母培养物组的螺旋体门(Spirochaeates)相对丰度最低为0.18%,显著低于对照组(P<0.05),与抗生素组相比有降低的趋势(P=0.053)。对照组的螺旋体门相对丰度最高为1.37%,与抗生素组相比有升高的趋势(P=0.059)。抗生素组的衣原体门(Chlamydiae)和软壁菌门(Tenericutes)相对丰度在3组中最高,显著高于酿酒酵母培养物组和对照组(P<0.05)。抗生素组、对照组和酿酒酵母培养物组在门水平上的第一大优势菌是厚壁菌门,相对丰度分别为65.87%、65.05%和61.63%,但3组之间没有显著性差异(P>0.05);3组的第二大优势菌门是拟杆菌门,其中酿酒酵母培养物组相对丰度最大,达到24.16%,抗生素组和对照组的相对丰度分别是18.73%和19.13%,但3组之间没有显著性差异(P>0.05)。
由图 4和图 5可知,在属水平上优势菌发生了改变,对照组的第一优势菌为瘤胃球菌科UCG-005(Ruminococcaceae UCG-005),且其相对丰度显著高于抗生素组和酿酒酵母培养物组(P<0.05)。由图 5可知,与对照组相比,酿酒酵母培养物组和抗生素组克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae R-7 group)、大肠埃希菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)、密螺旋体属2(Treponema 2)的相对丰度均显著降低(P<0.05),且抗生素组与酿酒酵母培养物组之间没有显著性差异(P>0.05);与对照组相比,酿酒酵母培养物组普雷沃氏菌属2(Prevotella 2)(P=0.064)、普雷沃氏菌属7(Prevotella 7)(P=0.058)以及普雷沃氏菌属9(Prevotella 9)(P=0.072)的相对丰度有提高的趋势;与抗生素相比,酿酒酵母培养物组普雷沃氏菌属7相对丰度有提高的趋势(P=0.072)。
酿酒酵母培养物中含有丰富的营养物质,可以提高动物的生长性能。李晓[7]研究发现在断奶仔猪饲粮中添加0.5%的酿酒酵母培养物显著提高了断奶仔猪的平均日增重和平均日采食量。Van Der Peet-Schwering等[9]研究发现添加酿酒酵母培养物可以显著提高断奶仔猪的平均日增重,改善料重比。这与本研究结果基本一致。本研究发现饲粮添加酿酒酵母培养物显著提高了断奶仔猪的平均日增重,改善了料重比。酿酒酵母培养物对生长性能的影响可能与酿酒酵母培养物的营养成分有关,酿酒酵母培养物提供了氨基酸、多肽、蛋白质、维生素和有机酸等丰富的营养物质,优化了饲粮的营养价值,同时也提供了大量的消化酶,提高了饲粮的养分消化率,从而降低了料重比。Ignacio等[10]认为酿酒酵母培养物中含有的醇类和酯类等芳香类物质以及核苷酸、多肽等增味类物质,可以改善饲粮的适口性,从而增加动物的采食粮,有利用动物日增重的提高。同时本研究结果发现饲粮添加酿酒酵母培养物可以显著降低仔猪的腹泻率,这与郭小华等[6]、何若钢等[11]的研究结果一致。不仅如此,Magalhães等[12]给70日龄的荷斯坦犊牛饲粮添加酿酒酵母培养物,结果改善了犊牛的腹泻指数。酿酒酵母培养物可以降低腹泻率,这可能与酿酒酵母培养物中的成分有关,酿酒酵母培养物中的有效成分包括酵母壁多糖,酵母壁多糖的主要成分是β-葡聚糖和甘露寡糖。Spring等[13]认为酿酒酵母细胞壁成分中的甘露聚糖能够刺激肠道中富含D-甘露糖的接收器,该接收器能黏附具有伞状菌毛的革兰氏阴性菌如沙门氏菌;White等[14]认为酵母细胞壁多糖能够增强断奶仔猪在感染大肠杆菌和沙门氏菌后的抵抗能力;而大肠杆菌和沙门氏菌是导致动物腹泻的主要致病性微生物[15]。
养分消化率体现的是动物对营养物质消化吸收的能力,动物养分消化率的提高可以改善动物的料重比。目前对于酵母培养物提高动物养分消化率的研究结果不一致。刘学文等[16]在断奶羔羊饲粮中添加酵母培养物显著提高了断奶羔羊饲粮中粗蛋白质消化率;王卫正等[17]在濑兔饲粮中添加酵母培养物,结果显著提高了断奶濑兔饲粮中粗蛋白质的表观消化率;张嘉琦等[19]在蛋鸡饲粮中添加0.6%的酵母培养物,结果显著提高了蛋鸡饲粮中粗蛋白质的表观消化率;刘观忠等[19]在蛋雏鸡饲粮中添加酵母培养物,结果提高了蛋雏鸡饲粮中粗蛋白质、粗脂肪和磷的表观消化率;杜泓明[20]研究发现添加酵母培养物显著提高了断奶仔猪饲粮中干物质、粗蛋白质和粗纤维的表观消化率;而吴徐俊[21]研究发现酵母培养物对断奶仔猪饲粮中能量和粗蛋白质表观消化率没有影响;张丽[22]研究发现酵母培养物显著降低了断奶仔猪饲粮中粗蛋白质、粗纤维、钙和磷的表观消化率。之所以出现这样的情况,可能与生产酵母培养物时选用的菌株不同及生产工艺不同有关。本研究结果显示饲粮添加酿酒酵母培养物可以显著提高断奶仔猪饲粮中粗蛋白质、粗脂肪和磷的表观消化率。酿酒酵母培养物提高养分消化率可能由于酿酒酵母培养物中含有丰富的消化酶,这些消化酶可以补充断奶仔猪刚断奶时自身消化酶的不足,帮助仔猪对营养物质的消化分解;并且酿酒酵母培养物中还含有大量的营养物质,杨敏等[23]认为酿酒酵母培养物中的葡萄糖、植酸酶等成分可以提高磷的表观消化率。
Chao指数和Ace指数用于衡量物种丰度即物种数量的多少;Shannon指数和Simpson指数用于衡量物种多样性,受样品群落中物种丰度和物种均匀度的影响。相同物种丰度的情况下,群落中各物种具有越大的均匀度,则认为群落具有越大的多样性,Shannon指数值越大,Simpson指数值越小,说明样品的物种多样性越高[24],本试验结果显示饲粮添加酿酒酵母培养物和抗生素对盲肠微生物的多样性没有显著性影响。这与杜泓明[20]的研究结果不一致,可能是由于酵母菌株以及饲养环境的不同导致的。本研究结果显示酿酒酵母培养物组、对照组和抗生素组3组之间在门水平上的优势菌组成没有差异,但是盲肠微生物优势菌群的菌群丰度有影响,饲粮添加酿酒酵母培养物显著降低了断奶仔猪盲肠中螺旋体门的相对丰度。螺旋体门多为致病菌或条件致病菌,对仔猪腹泻具有潜在的诱导作用[25]。研究发现,添加酿酒酵母培养物有提高普雷沃氏菌属相对丰度的趋势。张丽萍等[26]研究发现普雷沃氏菌属与猪的脂肪率和背膘厚度呈现正相关。普雷沃氏菌属可以分解纤维素产生脂肪酸,有利于仔猪对营养物质的消化吸收,降低料重比。本研究还发现饲粮添加酿酒酵母培养物显著降低了大肠埃希菌-志贺菌属和密螺旋体属2等肠道致病菌的相对丰度,而大肠埃希菌-志贺菌属是仔猪肠道内的潜在致病菌,能引起仔猪的腹泻。酿酒酵母培养物能抑制有害菌的生长,这可能与酿酒酵母培养物中的酵母壁多糖成分有关。酵母壁多糖中的甘露寡糖[13]和β-葡聚糖[27]可以抑制有害菌生长,甘露寡糖具有和动物肠道黏膜上皮细胞特异性的寡糖受体相似的结构,可以与致病菌的外源凝集素结合,将病原菌排出体外,从而阻止致病菌与肠道细胞的结合,保护断奶仔猪肠道的健康,降低仔猪因为肠道致病菌感染导致的腹泻。
4 结论① 酿酒酵母培养物提高了断奶仔猪的生长性能和养分消化率,降低了断奶仔猪的腹泻率,达到了和抗生素相似的促生长效果。
② 酿酒酵母培养物对断奶仔猪盲肠微生物菌群的多样性没有影响,但是调节了断奶仔猪盲肠微生物的菌群丰度,降低了肠道致病菌的丰度。
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