肉鸡的蛋白质代谢受品种、营养和环境等多种因素的影响,蛋白质代谢备受研究者关注,尤其关注通过营养学手段来调节肉鸡的蛋白质代谢进而改善肉品质。棉籽粕是一种优质的蛋白质饲料,其粗蛋白质(CP)含量高达40%以上,因其含有毒物质游离棉酚及多种抗营养因子,导致棉籽粕在畜禽饲粮中的利用效率低下[1],而通过微生物发酵可以有效解决这一问题。因此,近年来围绕棉籽粕的微生物发酵开展了大量研究,且发酵棉籽粕已被广泛应用于家禽生产中。研究表明,棉籽粕经微生物发酵后可提高其营养成分,消除抗营养因子[2-3],进而提高畜禽对其的利用率。研究也表明,饲喂发酵棉籽粕可以提高肉鸡的生长性能、屠宰性能和免疫功能,改善肠道微生物区系[4-6],降低腹部的脂肪沉积[7]。目前对于棉籽粕的研究主要集中在菌种筛选、发酵工艺优化、发酵产物鉴定及发酵棉籽粕对肉鸡脂质代谢的影响等方面,而有关发酵棉籽粕对肉鸡蛋白质代谢的研究鲜有报道。鉴于此,本试验选用对棉酚降解效果较好的热带假丝酵母ZD-3(Candida tropicalis ZD-3)为发酵菌种,研究饲粮中添加不同水平发酵棉籽粕对白羽肉鸡蛋白质代谢的影响,这对缓解蛋白质饲料资源紧缺、降低养殖成本和生产绿色健康畜产品具有重要的现实意义。
1 材料与方法 1.1 试验材料发酵底物:试验所用的棉籽粕、玉米、麸皮购自新疆泰昆饲料科技有限公司。发酵菌种:热带假丝酵母ZD-3由浙江大学饲料所选育提供。培养基采用酵母膏胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基,YPD液体培养基的配制按照酵母膏:蛋白胨=1 : 2,即每100 mL加1 g酵母浸粉、2 g蛋白胨;YPD固体培养基的配制是在液体培养基的基础上添加2%的琼脂,葡萄糖溶液用无菌滤器过滤后单独加入,每100 mL培养基加10 mL葡萄糖溶液。
1.2 发酵棉籽粕的制备发酵底物按照棉籽粕:玉米:麸皮=90 : 5 : 5的比例混合均匀,底物:水=1.0 : 0.8。发酵棉籽粕制备的具体过程参照聂存喜等[5]的方法。用接种环挑取1环热带假丝酵母ZD-3接入YPD平面培养基中,30 ℃静止培养12 h;待长出单个菌落后挑取一个菌落接入5 mL YPD液体培养基中,在恒温摇床中30 ℃、170 r/min培养24 h(一级菌种);随后将摇好的5 mL一级菌种接入100 mL YPD液体培养基中,30 ℃、170 r/min培养20 h(二级菌种)。发酵底物的制备是按照上述比例称100 g饲料置于500 mL的锥形瓶中,加水搅拌均匀后高压灭菌;随后将摇好的二级菌种取8 mL(菌液浓度为2.97×109 CFU/mL)接入100 g发酵底物中,30 ℃恒温发酵48 h;在发酵过程中晃动1~2次,使其与氧气充分接触;发酵结束后在烘箱中45 ℃烘干,粉碎过60目筛保存待用。
1.3 试验设计选取1日龄科宝肉鸡公鸡480只(鸡苗购自河南省许昌市腾飞禽业有限公司),随机分成4个组,每组6个重复,每个重复20只鸡。对照组饲喂不添加发酵棉籽粕的基础饲粮,试验组分别饲喂在基础饲粮中添加3%、6%、9%发酵棉籽粕替代豆粕的试验饲粮。饲粮参照NRC(1994)肉鸡营养需要标准配制,管理方法参考聂存喜等[5]的方法,试验鸡按照重复分栏笼养,自由采食,自由饮水,按正常免疫程序进行免疫接种。试验分生长前期(1~21日龄)和生长后期(22~42日龄)2个阶段进行。试验饲粮组成及营养水平见表 1。
分别于试验第1、21和42天,每个重复抽取2只鸡,用于测定胴体和羽毛的粗蛋白质沉积量。所选试验鸡空腹称重后,颈椎错位致死,于70 ℃左右的热水中将羽毛拔下,将全部羽毛收集到布袋中,然后在65 ℃烘箱内烘干,制成风干样并称重,将风干的所有羽毛粉碎后测定粗蛋白质含量。试验鸡拔毛称重后剖开腹腔,除去消化道内容物,然后将整鸡剪成块,在65 ℃下烘干制成风干样,测定其干物质(DM)和粗蛋白质含量,并按席鹏彬等[8]的方法计算1~21日龄和22~42日龄试验鸡胴体和羽毛的粗蛋白质沉积量。
1.4.2 粪样的采集分别于试验第19~21天和第40~42天时,每天08:00按照重复收集所有粪便,混匀后每个重复采集100 g,加5 mL 10%的浓硫酸固氮,采样结束后,将3 d所采集的粪样按照重复混合,65 ℃烘48 h,粉碎过40目筛,-20 ℃保存待测。
1.4.3 组织样的采集分别于试验第21和42天08:00,每重复随机抽取2只鸡,空腹12 h,静脉放血后迅速采集部分胸肌、腿肌、肝脏于冻存管中,放入携带的液氮中速冻,带回实验室后将其放入-80 ℃冰箱保存待测。
1.5 测定指标 1.5.1 胴体和羽毛粗蛋白质沉积量的计算养分表观消化率采用内源指示剂法测定,即4 mol/L的盐酸不溶灰分(AIA),参考De Coca-Sinova等[9]的方法进行。饲料和粪样中干物质含量的测定参照AOAC(2005;方法930.15),粗蛋白质含量的测定参照AOAC(2000;方法976.05)。采用氧弹测热仪测定饲料和粪样的总能。
式中:a为饲料中某营养成分的含量(%);b为粪样中某营养成分的含量(%);c为饲料中盐酸不溶灰分的含量(%);d为粪样中盐酸不溶灰分的含量(%)。
1.5.3 肌肉、肝脏中酶活性的测定测定胸肌、腿肌和肝脏中碱性磷酸酶(AKP)、谷丙转氨酶(GPT)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(GOT)的活性,AKP、LDH和GOT活性测定采用微板法,GPT活性测定采用赖氏法,均按照试剂盒方法进行,所用试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.5.4 肌肉、肝脏中激素含量的测定测定胸肌、腿肌和肝脏中蛋白质代谢相关激素甲状腺素(T4)、生长激素(GH)和胰岛素(INS)含量,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定,所用试剂盒购自卡麦舒(上海)生物科技有限公司。
1.6 数据分析采用SPSS 17.0统计软件对试验数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA),各组采用LSD法进行多重比较,结果用“平均值±标准差”表示,P<0.05表示差异显著,P≥0.05表示差异不显著。
2 结果 2.1 热带假丝酵母发酵棉籽粕对白羽肉鸡粗蛋白质沉积的影响由表 2可知,第21天时,6%发酵棉籽粕添加组白羽肉鸡的胴体粗蛋白质沉积量显著高于其他组(P < 0.05);与对照组相比,3%、6%、9%发酵棉籽粕添加组的胴体粗蛋白质含量分别显著提高18.5%、23.6%、21.4%(P < 0.05),胴体干物质含量分别显著提高5.52%、5.39%、5.89%(P < 0.05);3%、6%发酵棉籽粕添加组的羽毛粗蛋白质含量分别显著提高0.93%、3.63%(P < 0.05)。第42天时,6%、9%发酵棉籽粕添加组的胴体粗蛋白质沉积量显著高于对照组和3%发酵棉籽粕添加组(P < 0.05),3%、6%、9%发酵棉籽粕添加组的羽毛粗蛋白质含量显著低于对照组(P < 0.05)。
由表 3可知,第21天时,与对照组相比,3%、6%、9%发酵棉籽粕添加组白羽肉鸡的粗蛋白质表观消化率分别显著提高1.84%、2.92%、0.82%(P < 0.05),干物质表观消化率分别显著提高2.55%、4.79%、3.29%(P < 0.05),表观代谢能分别显著提高6.91%、9.27%、6.49%(P < 0.05);其中6%发酵棉籽粕添加组的干物质和粗蛋白质表观消化率显著高于3%和9%发酵棉籽粕添加组(P < 0.05)。第42天时,3%、6%发酵棉籽粕添加组的粗蛋白质表观消化率较对照组分别显著提高0.75%、1.95%(P < 0.05)。
由表 4可知,第21天时,6%发酵棉籽粕添加组白羽肉鸡腿肌中的LDH和AKP活性较对照组分别显著提高66.85%、67.44%(P < 5),且显著高于3%和9%发酵棉籽粕添加组(P < 0.05);与对照组相比,3%、6%发酵棉籽粕添加组胸肌中的LDH活性分别显著提高5.16%、8.85%(P < 0.05),胸肌中的AKP活性分别显著提高6.14%、15.24%(P < 0.05);6%发酵棉籽粕添加组肝脏中的LDH活性显著高于其他组(P < 0.05),3%、6%、9%发酵棉籽粕添加组肝脏中的GOT和GPT活性显著高于对照组(P < 0.05)。第42天时,6%和9%发酵棉籽粕添加组肝脏中的LDH活性较对照组分别显著提高20.29%、11.89%(P < 0.05);与对照组相比,3%、6%、9%发酵棉籽粕添加组肝脏中的AKP活性分别显著提高1.12%、25.94%、21.32%(P < 0.05),肝脏中的GOT活性分别显著提高10.34%、14.44%、15.01%(P < 0.05)。
由表 5可知,第21天时,与对照组相比,6%发酵棉籽粕添加组白羽肉鸡胸肌、腿肌、肝脏中的T4含量分别显著提高33.78%、26.86%、93.23%(P < 0.05),GH含量分别显著提高21.47%、28.06%、44.86%(P < 0.05);9%发酵棉籽粕添加组胸肌和肝脏中的GH含量分别显著提高33.01%、67.44%(P < 0.05);6%、9%发酵棉籽粕添加组肝脏中的INS含量分别显著提高81.00%、64.32%(P < 0.05)。第42天时,与对照组相比,3%、6%、9%发酵棉籽粕添加组胸肌、腿肌、肝脏中的T4含量均显著提高(P < 0.05),其中6%发酵棉籽粕添加组胸肌、腿肌、肝脏中的T4含量分别显著提高56.80%、44.95%、98.35%(P < 0.05);6%、9%发酵棉籽粕添加组胸肌、腿肌、肝脏中的GH含量显著提高(P < 0.05),且随着发酵棉籽粕添加水平的增加,GH含量显著提高(P < 0.05);3%、6%、9%发酵棉籽粕添加组肝脏中的INS含量分别显著提高49.60%、101.03%、92.93%(P < 0.05)。
目前,发酵饲料对胴体蛋白质沉积的影响尚未见报道。本试验结果显示,饲粮中添加发酵棉籽粕,白羽肉鸡胴体的干物质含量和粗蛋白质沉积量均高于对照组,说明添加适量发酵棉籽粕有利于提高白羽肉鸡的蛋白质沉积量。本试验中,饲粮中添加发酵棉籽粕可提高养分消化率,增加蛋白质代谢相关酶活性和激素含量,这表明发酵棉籽粕可通过提高养分消化利用和增加蛋白质代谢相关酶活性和激素含量而促进蛋白质沉积。随着发酵棉籽粕添加水平的增加,白羽肉鸡胴体蛋白质沉积量以及蛋白质代谢相关酶活性和激素含量均呈先升高后降低的趋势,综合考虑,6%发酵棉籽粕添加水平效果最佳,且生长前期效果优于生长后期,与魏莲清等[6]的研究结果一致。此外,棉籽粕经微生物发酵后可增加小肽和氨基酸含量[1]。报道显示,饲粮中添加色氨酸可显著提高肉鸡胴体和羽毛中的蛋白质沉积量[8]。因此,发酵棉籽粕提高蛋白质沉积量可能与发酵底物中氨基酸的增加有关,具体原因有待进一步研究。
3.2 热带假丝酵母发酵棉籽粕对白羽肉鸡养分表观消化率的影响棉籽粕是一种优质的蛋白质饲料,其粗蛋白质含量高达40%以上,因其含有毒物质棉酚,极大地限制了其在饲料中的应用,而棉籽粕经微生物发酵后,游离棉酚的降解率可达94.6%[1-2]。魏金涛等[10]给断奶仔猪饲喂发酵饲料,结果发现发酵饲料可提高养分的表观消化率,这与本试验在肉鸡饲粮中添加发酵棉籽粕增加干物质、粗蛋白质等养分表观消化率的结果一致。此外,发酵棉籽粕显著提高肉鸡的表观代谢能是因为发酵饲料中含有易消化吸收的小分子肽,且适口性良好、活菌含量高,有利于动物对各种养分的消化和吸收,进而提高代谢能[11]。发酵棉籽粕底物中含有的活菌和消化酶也是提高其表观消化率的原因之一。本试验中的棉籽粕发酵后活菌数可达2.12×106 CFU/g。本课题组前期研究结果表明,热带假丝酵母发酵棉籽粕产物中含有丰富的淀粉酶和蛋白酶[12]。益生菌进入机体,可通过维持消化道的微生态平衡来增加饲料的消化吸收[13-14]。肠道菌群在消化和吸收养分以及控制病原体方面发挥着重要的作用[15]。研究报道,发酵棉籽粕部分替代豆粕可增加肉仔鸡盲肠中的乳酸菌和总厌氧菌数量,提高胃肠道的健康和消化能力[16-17]。本试验结果表明,饲粮中添加发酵棉籽粕可提高白羽肉鸡的养分表观消化率,进而促进机体的蛋白质沉积。
3.3 热带假丝酵母发酵棉籽粕对白羽肉鸡蛋白质代谢相关酶活性的影响一般而言,动物体中蛋白质消化酶和代谢酶的活性越高,其对养分的消化吸收能力也越强,从而提高其生长发育速度[18]。本试验中,随着发酵棉籽粕添加水平的增加,白羽肉鸡肌肉和肝脏蛋白质代谢相关酶活性呈先升高后降低的趋势,表明体内的蛋白酶活性与摄食饲粮成分有关。王桂芹等[18]证实了饲粮成分的改变也可以影响机体蛋白质代谢相关酶活性。本试验所用饲粮配制虽考虑了粗蛋白质、能量及其他氨基酸等营养素的均衡,鉴于发酵底物的复杂性,无法保证所有养分均一致,这也提示后期研究发酵饲料组分与蛋白质代谢的必要性。Shabani等[19]研究表明,发酵饲料能够刺激胃肠道胰蛋白酶和糜蛋白酶等消化酶的产生,机体对蛋白质的消化代谢是一个整体反应,消化能力增加,其代谢能力也随之增加,从而发酵棉籽粕可促进蛋白质的代谢、利用乃至沉积。AKP参与机体营养物质的消化和吸收过程,饲粮中的蛋白质降解成氨基酸后主要通过转氨基和脱氨基进一步在体内代谢和转化。氨基酸代谢过程中,LDH是糖代谢的一个关键酶,主要作用是催化乳酸氧化为丙酸,将氢转移给氧化性辅酶一(NAD)成为还原性辅酶一(NADH),为机体的蛋白质及脂质代谢提供能量,因此其活性反映了氨基酸代谢强度的大小[20]。此外,GOT和GPT活性的高低可反映机体能量供应及碳架胺合成氨基酸强度的大小[21]。本试验结果表明,饲粮中添加发酵棉籽粕,白羽肉鸡肌肉和肝脏中的AKP、LDH、GOT和GPT活性都有所增加,且6%添加水平效果最优。因此,饲粮中添加适宜水平的发酵棉籽粕能够提高蛋白质代谢酶的活性,促进蛋白质代谢,增加机体蛋白质的沉积量。
3.4 热带假丝酵母发酵棉籽粕对白羽肉鸡蛋白质代谢相关激素含量的影响激素含量可以反映机体的代谢状态,GH是调节机体代谢的重要激素之一。研究发现,GH促进动物肌肉组织的合成,加强蛋白质周转代谢[22],增加肌肉蛋白质的沉积量和瘦肉率[23]。本试验中,饲粮中添加发酵棉籽粕,白羽肉鸡肌肉和肝脏中的GH含量提高,说明发酵棉籽粕可能通过影响机体GH含量促进蛋白质的合成代谢,这可能与GH影响氨基酸沉积有关,但需进一步研究。研究表明,GH处理可以增加猪胴体中氨基酸的沉积量,从而为机体蛋白质合成提供原料[24]。此外,INS可通过促进细胞氨基酸的摄取调控动物组织蛋白质的合成。T4主要负责机体的能量代谢[25],能量代谢的参数变化可以反映机体的总体代谢状态[26]。T4可调节蛋白质、糖类、脂质等的代谢[27],促进机体的基础代谢,具有诱导特殊酶系和新的蛋白质合成的作用[28]。本试验中,发酵棉籽粕可增加白羽肉鸡肌肉和肝脏中的T4和INS含量,且生长前期高于生长后期,6%添加水平高于3%和9%添加水平。这表明发酵棉籽粕可以通过调节机体激素含量促进肉鸡的蛋白质代谢,且与肉鸡的生长阶段和发酵棉籽粕的添加水平密切相关。
4 结论白羽肉鸡饲粮中添加发酵棉籽粕,可以通过提高其养分表观消化率和表观代谢能,增加蛋白质代谢相关酶活性和激素含量,进而促进机体的蛋白质沉积,且6%添加水平效果优于3%、9%添加水平,生长前期优于生长后期。
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