葡多酚是葡萄中的一种活性物质,主要分布在葡萄籽和葡萄皮中,由酚酸类、黄烷醇类、花色苷类、黄酮醇类和聚合单宁组成,在提取、加工过程中葡多酚的不同成分会发生相互转化。原花青素是葡多酚的主要成分,占总酚的90%以上,具有很强的抗氧化活性,可以有效去除机体内多余的自由基[1],抑制脂质过氧化反应,保护机体大分子免受自由基的损伤。此外,葡多酚还具有抗辐射、抗应激、抗炎、抗菌等生物学作用。目前,有关葡多酚在单胃动物和反刍动物生产中的应用研究均有报道,但其在反刍动物生产中的应用研究主要集中在奶牛生产性能及瘤胃发酵方面,针对羊瘤胃发酵方面的研究报道较少,且研究结果不一致,有必要进一步深入研究。
目前,通过添加植物多酚类化合物改善家畜生产性能和畜产品品质具有广阔的应用前景。大量研究表明葡多酚可以提高断奶仔猪的生长性能、肠道健康、抗氧化能力和免疫力[2-5]。另有研究表明葡多酚可以替代维生素E改善肉鸡的生长性能和肉品质[6-7]。Gessner等[8]研究表明,葡萄籽粕可以替代奶牛饲粮中等比例的苜蓿干草,且提高了产奶量和乳脂率,改善了乳房的健康状况。金雅倩等[9]研究报道,在绵羊饲粮中添加适量酿酒葡萄皮渣可以提高绵羊的日增重,促进肝脏、肾脏及部分消化器官的发育,增加血清高密度脂蛋白胆固醇含量,提高血清抗氧化能力,但对绵羊瘤胃液pH、总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度、总蛋白含量没有显著影响。而杨德莲等[10]研究发现,添加不同水平的葡萄籽原花青素均可提高发酵液pH,其中200 mg/kg组显著降低甲烷产量。
关于葡多酚在反刍动物瘤胃发酵调控方面的研究较少,特别是对绵羊瘤胃微生物区系的影响尚未见报道。本试验采用体外人工瘤胃法研究葡多酚对绵羊瘤胃发酵参数和微生物区系的影响,旨在为葡多酚作为功能性绿色添加剂应用于羊生产实践中提供理论依据和基本参数。
1 材料与方法 1.1 试验材料发酵底物:精粗比为50 : 50的全混合日粮(TMR),粗蛋白质(CP)含量12.5%,中性洗涤纤维(NDF)含量47.2%,粉碎后过40目筛。发酵底物组成及营养水平见表 1。
葡多酚:购自南京泽郎生物科技有限公司,其主要成分为原花青素(96.400%)、儿茶素(0.533%)、表儿茶素(0.239%)、儿茶素没食子酸酯(0.225%)和表儿茶素没食子酸酯(0.171%)。
发酵液由人工唾液和瘤胃液以2 : 1(体积比)的比例混合。人工唾液参照Menke等[11]的方法配制,并在人工唾液中持续通入CO2至无色,预热至39 ℃备用。选3只健康的安装有永久瘤胃瘘管的绵羊作为瘤胃液供体动物,试验开始前10天给瘘管羊饲喂与发酵底物相同配方的饲粮。于晨饲前分别取3只羊的瘤胃内容物,混合后经4层纱布过滤,在39 ℃条件下迅速与人工唾液混合,并持续通入CO2。
1.2 试验设计采用单因素试验设计,准确称取0.2 g发酵底物于100 mL发酵管(注射器)中,葡多酚的添加量分别为0(对照组)、200、400、600、800 mg/kg,每个添加量设置6个平行。每个发酵管中抽入均匀混合、CO2饱和的发酵液30 mL,立即密闭发酵管,于39 ℃水浴中振荡培养48 h。
1.3 样品采集与指标测定 1.3.1 发酵底物营养成分含量测定发酵底物的干物质(DM)、CP、粗脂肪(EE)、粗灰分(Ash)含量参照AOAC(2000)进行测定,NDF和酸性洗涤纤维(ADF)含量采用范氏法,在半自动Aknom 220纤维分析仪(美国ANKOM公司)上测定,非纤维性碳水化合物(NFC)含量通过公式计算得出:
NFC含量(%)=100-NDF含量(%)-CP含量(%)-EE含量(%)-Ash含量(%)。
1.3.2 体外发酵产气量和甲烷产量发酵48 h后,立即将发酵管取出放入冰水中终止发酵,读取发酵管刻度,记录产气量。之后将注射器头插入真空集气袋口,排入气体后迅速关闭袋口,利用日本岛津GC-200气相色谱仪测定甲烷产量,色谱条件参照文献[10]设定。
1.3.3 体外发酵液pH、挥发性脂肪酸(VFA)组成以及氨态氮(NH3-N)、微生物蛋白(MCP)浓度发酵48 h后,将发酵液转移至50 mL离心管中,立即测定pH,然后3 000 r/min条件下离心15 min,上清液用于测定各VFA、NH3-N、MCP浓度,测定步骤参考郝小燕等[12]的方法。根据各VFA浓度计算TVFA浓度、各VFA比例以及乙酸/丙酸值。
1.3.4 体外发酵液微生物区系体外发酵液微生物总DNA的提取采用珠磨-十六烷基三甲基溴化铵法[13],利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术测定微生物的数量,引物由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列见表 2。
试验数据采用SAS 9.2软件中的one-way ANOVA程序进行方差分析,再采用Duncan法进行多重比较。P < 0.05和0.05≤P < 0.10分别定义为差异显著和有显著趋势。
2 结果与分析 2.1 葡多酚对体外发酵液pH与NH3-N和MCP浓度以及产气量和甲烷产量的影响由表 3可知,添加400、600 mg/kg葡多酚组发酵液pH与对照组相比显著升高(P < 0.05),添加200、800 mg/kg葡多酚组发酵液pH与对照组差异不显著(P>0.05)。发酵液NH3-N和MCP浓度随着葡多酚添加量的增加有线性下降的趋势(P=0.052、P=0.050),但各组间差异不显著(P>0.05)。与对照组相比,各添加葡多酚组甲烷产量均显著降低(P < 0.05),葡多酚添加量达到400 mg/kg及以上时产气量显著降低(P < 0.05)。
由表 4可知,添加不同水平葡多酚对TVFA浓度没有显著影响(P>0.05),但与对照组相比,添加200 mg/kg葡多酚有提高乙酸比例的趋势(P=0.053),添加400 mg/kg葡多酚显著提高异丁酸比例(P < 0.05),其他葡多酚添加组与对照组无显著差异(P>0.05)。各添加葡多酚组丁酸比例均较对照组显著降低(P < 0.05)。此外,丙酸、戊酸和异戊酸比例以及乙酸/丙酸值各组间无显著差异(P>0.05)。
由表 5可知,与对照组相比,添加200 mg/kg葡多酚组黄色瘤胃球菌数量显著提高(P < 0.05),添加800 mg/kg葡多酚组黄色瘤胃球菌数量显著降低(P < 0.05)。添加不同水平葡多酚对白色瘤胃球菌数量没有显著影响(P < 0.05),但线性降低了产琥珀酸丝状杆菌和溶纤维丁酸弧菌的数量(P < 0.001、P=0.041),添加200 mg/kg葡多酚组与对照组间差异不显著(P>0.05)。添加200和400 mg/kg葡多酚组真菌数量显著高于对照组、添加600和800 mg/kg葡多酚组(P < 0.05)。添加600和800 mg/kg葡多酚组嗜淀粉瘤胃杆菌数量显著低于对照组和添加200 mg/kg葡多酚组(P < 0.05)。与对照组相比,添加不同水平葡多酚均可以显著降低原虫和甲烷菌数量(P < 0.05)。
pH是反映瘤胃内环境的重要指标,pH的高低直接影响瘤胃微生物的生长代谢[14]。瘤胃中纤维分解菌对pH变化比较敏感,最适宜的pH范围为6.2~6.8,pH低于6.2将抑制纤维分解菌的活性,降低纤维素的降解率[15]。本试验中适量添加葡多酚提高了发酵液pH,但均处于正常范围内,说明发酵环境有利于微生物生长和代谢。NH3-N是蛋白质降解的重要产物,也是大部分微生物生长繁殖的原料。本试验中添加葡多酚后体外发酵液NH3-N浓度有降低趋势,这与杨德莲等[10]、米热古丽·伊马木等[16]报道的葡萄籽原花青素和葡萄籽精油降低体外发酵液NH3-N浓度的结果相一致。李成云等[17]研究表明饲粮中添加富含缩合单宁的物质可以降低反刍动物蛋白质瘤胃降解率,提高过瘤胃蛋白质比例。缩合单宁可以与蛋白质通过酚羟基和芳香环基团与氨基和羧基以氢键的形式多位点结合,形成不易被降解的复合物,从而抑制蛋白质的降解,提高蛋白质利用率。瘤胃中NH3-N浓度与MCP浓度密切相关,NH3-N浓度过低可能会抑制MCP的合成。缩合单宁会降低体外发酵液MCP浓度[18],且饲粮中单宁含量越高,对MCP合成的抑制作用越强[19]。Ahnert等[20]报道单宁类物质可以降低碳水化合物在瘤胃中的降解,导致供给瘤胃微生物的能量降低,十二指肠MCP流量相应减少。李晓鹏[21]报道,单宁类物质可以破坏瘤胃细菌的膜,使细菌不能正常繁殖,降低MCP浓度的同时抑制瘤胃发酵,降低产气量。研究表明饲粮中单宁含量与瘤胃发酵产气量呈负相关[22],本试验中体外瘤胃发酵产气量随着葡多酚添加量的增加而降低,这与前人的研究结果一致。Bueno等[23]研究发现单宁可以通过抑制整个发酵过程来降低甲烷产量,且单宁的分子质量越大,抑制作用越强。这种抑制作用与原虫数量的减少密切相关,因为原虫与甲烷菌是互利共生关系,附着在原虫表面的甲烷菌随原虫数量的降低而降低,因此甲烷产量显著降低。此外,有研究表明原虫是NH3-N的净产生者,因为原虫不能利用NH3-N合成自身蛋白质,而本身代谢又不断地产生NH3-N[24],这进一步解释了添加葡多酚降低体外发酵液NH3-N浓度的原因。
饲粮中碳水化合物经瘤胃微生物发酵产生的VFA是宿主动物的主要能量来源,其中乙酸、丙酸和丁酸占总挥发性脂肪酸的95%以上。VFA的组成和浓度除受饲粮结构(非纤维性碳水化合物和中性洗涤纤维)、品质的影响外,瘤胃微生物活性和微生物区系也会影响VFA的生成。同时,碳水化合物发酵产生VFA的过程中释放的能量供微生物生长繁殖利用。本研究中添加200 mg/kg葡多酚组与对照组相比乙酸比例有上升的趋势,说明添加200 mg/kg葡多酚后粗纤维的降解率有所提高,原因可能是200 mg/kg葡多酚提高了纤维分解菌(如黄色瘤胃球菌)的数量。不同添加水平的葡多酚对TVFA浓度、丙酸比例、乙酸/丙酸值没有显著影响,这一结果与杨德莲等[10]报道的结果一致。本试验结果表明,添加葡多酚在一定程度上降低了体外发酵液中丁酸的比例。前人研究也表明,单宁类物质对瘤胃中丁酸的产生具有一定的抑制作用[25]。瘤胃中溶纤维丁酸弧菌的代谢产物丰富多样,其中乙酸和丁酸是其主要的代谢物,它同时可以吸收乙酸转化成丁酸。本研究中,添加葡多酚后降低了体外发酵液中溶纤维丁酸弧菌的数量,因而丁酸比例有所下降。大量研究证明多酚类物质对瘤胃发酵模式的改变主要归因于其对瘤胃微生物的影响[26-28]。
瘤胃微生物包括细菌、原虫和厌氧真菌三大类,它们与宿主间存在着牢固的共生关系,调控瘤胃微生物区系是反刍动物营养调控的重点和难点。本研究结果表明葡多酚对绵羊体外发酵液微生物区系有显著影响,适宜添加量的葡多酚可以提高黄色瘤胃球菌的数量,有利于纤维类物质的消化,高添加量(800 mg/kg)的葡多酚降低了黄色瘤胃球菌数量,这与李大彪等[29]的研究结果一致。但杨德莲等[10]研究表明葡萄籽原花青素对体外发酵液黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌的数量均无显著影响,这可能是由于添加量的差异导致试验结果不同。袁英良[30]通过体外试验发现饲粮中添加缩合单宁可增加纤维降解菌的数量,降低蛋白质分解菌的数量。但植物次生代谢物(如酚类物质、异黄酮、黄芪多糖、黄芪甲苷等)会抑制产琥珀酸丝状杆菌的生长,原因是多酚类物质会抑制产琥珀酸丝状杆菌胞内和胞外酶的活性[31]。溶纤维丁酸弧菌除具有降解纤维素的作用外,亦是一种主要的蛋白质分解菌。本试验中葡多酚的添加降低了溶纤维丁酸弧菌的数量,可能是由于多酚与饲粮中蛋白质形成了复合的抗性蛋白,抑制了溶纤维丁酸弧菌的生长繁殖。嗜淀粉瘤胃杆菌在瘤胃中数量很少,可以通过胞内酶降解淀粉,同时也具有很强的蛋白质降解能力。在本试验中,嗜淀粉瘤胃杆菌数量在葡多酚添加量达到600 mg/kg时显著降低,这一方面可能是因为底物蛋白质降解率降低,另一方面可能是因为发酵液中该菌生长繁殖所必需的氨浓度下降所致。与大部分研究结果类似,本试验中添加适量葡多酚提高了厌氧真菌的数量,降低了原虫和甲烷菌的数量。原虫代谢产生的氢是甲烷菌合成甲烷的原料,甲烷菌和原虫属于共生关系。但有关植物多酚对原虫数量的抑制机制尚不确定,可能是其破坏了原虫细胞膜的完整性,或改变了细胞膜的通透性,造成细胞溶解死亡,进而降低原虫数量。
4 结论① 葡多酚可以提高体外发酵液pH,降低丁酸比例、产气量和甲烷产量,对TVFA浓度、丙酸比例、乙酸/丙酸值无显著影响,但添加200 mg/kg时乙酸比例有升高趋势。
② 葡多酚可以降低体外发酵液溶纤维丁酸弧菌、产琥珀酸丝状杆菌、嗜淀粉瘤胃球菌、原虫和甲烷菌的数量,且添加200 mg/kg时黄色瘤胃球菌数量显著增加。
③ 葡多酚对绵羊体外瘤胃发酵具有调控作用,本试验条件下适宜添加量为200 mg/kg。
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