动物营养学报    2020, Vol. 32 Issue (1): 321-333    PDF    
白藜芦醇对不同类型底物体外产气和发酵参数的影响及其代谢产物的研究
吴万成1,2 , 马涛2 , 李文娟2 , 刘娜1,2 , 陈国顺1 , 刁其玉2     
1. 甘肃农业大学动物科学技术学院, 兰州 730070;
2. 中国农业科学院饲料研究所, 农业农村部饲料生物技术重点实验室, 北京 100081
摘要: 本试验旨在探索2种类型底物下添加不同水平白藜芦醇(RES)对体外产气和发酵参数的影响,为合理应用天然植物提取物调控反刍动物瘤胃发酵提供依据。选取3只体况良好的安装有永久性瘤胃瘘管的杜寒杂交肉用公羊作为瘤胃液供体。采用单因素试验设计,在2种类型底物[精粗比分别为68:32(高精料)和28:72(高粗料)]中分别添加0、7.7%、14.3%和25.0%(干物质基础)的RES进行体外产气试验。分别在体外发酵0、2、4、8、12、16、24 h时记录产气量,计算产气参数;在发酵24 h后测定发酵液pH和挥发性脂肪酸(VFA)浓度。在2种类型底物[精粗比分别为68:32(高精料)和28:72(高粗料)]条件下添加14.3%的RES进行RES体外降解试验,分别在发酵0、12和24 h时检测发酵残余物中RES及其代谢产物浓度。结果显示:1)随着发酵时间的延长,2种底物的产气量均增加。高精料条件下,随RES添加水平的升高,24 h产气量、产气速率均呈线性降低(P < 0.05),但各产气参数在高粗料的各RES添加组间无显著差异(P>0.05)。2)高粗料条件下,随着RES添加水平的升高,发酵液pH无显著变化(P>0.05);各RES添加组发酵液中乙酸摩尔比例以及总VFA浓度和乙酸/丙酸在发酵12和24 h时均显著低于未添加RES组(P < 0.05),丙酸摩尔比例显著高于未添加RES组(P < 0.05);发酵液中丁酸摩尔比例在发酵12 h时表现为14.3%和25.0% RES组显著低于未添加RES组(P < 0.05),在发酵24 h时表现为各RES添加组显著低于未添加RES组(P < 0.05)。高精料条件下,随着RES添加水平的升高,在发酵12 h时,14.3%和25.0% RES组发酵液pH均显著高于未添加RES组(P < 0.05);在发酵24 h时,各RES添加组发酵液pH均显著高于未添加RES组(P < 0.05);各RES添加组发酵液乙酸摩尔比例在发酵12 h时均显著低于未添加RES组(P < 0.05),在发酵24 h时14.3%和25.0% RES组显著低于未添加RES组(P < 0.05);各RES添加组发酵液丙酸摩尔比例在2个发酵时间点均显著高于未添加RES组(P < 0.05);各RES添加组发酵液丁酸摩尔比例以及总VFA浓度和乙酸/丙酸在2个发酵时间点均显著低于未添加RES组(P < 0.05)。3)RES在2种类型底物条件下均发生了降解,且在高精料条件下表现出了更强的降解特性,主要降解产物为二氢白藜芦醇(DH-RES)。由本试验结果发现,底物精粗比会影响RES调控体外产气和发酵的效果,高添加水平的RES对体外瘤胃发酵具有一定抑制作用;RES可以在瘤胃环境中降解代谢,且RES及其代谢产物DH-RES在高精料条件下显示出更强的降解特性。
关键词: 白藜芦醇    体外发酵    挥发性脂肪酸    二氢白藜芦醇    
Effects of Resveratrol on in Vitro Gas Production and Fermentation Parameters of Different Types of Substrates and Its Metabolites Research
WU Wancheng1,2 , MA Tao2 , LI Wenjuan2 , LIU Na1,2 , CHEN Guoshun1 , DIAO Qiyu2     
1. College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;
2. Key Laboratory of Feed Biotechnology of Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: This experiment explored the effects of different supplemental levels of resveratrol (RES) on in vitro gas production and fermentation parameters under two types of substrates, with an aim to rationally apply natural plant extracts to regulate rumen fermentation of ruminants. Three rams were used as rumen fluid donors with rumen fistula. Rumen fluid was collected from three adult Dorper×thin-tailed Han crossbred male lambs fitted with permanent rumen cannulation. Using a single factor test design, 0, 7.7%, 14.3%, and 25.0% RES (dry matter basis) were added to the two substrates[forage to concentrate ratio was 28:72 (high forge) or 68:32 (high concentrate)], respectively, to carry out in vitro gas production test. At 0, 2, 4, 8, 12, 16 and 24 h of in vitro fermentation, the gas production was recorded and the gas production parameters were calculated, respectively; the fermentation liquid pH and volatile fatty acid (VFA) concentrations were determined at 24 h of fermentation. Under the conditions of two types of substrates[forage to concentrate ratio was 28:72 (high forge) or 68:32 (high concentrate)], 14.3% of RES was added for RES in vitro degradation test, and the concentrations of RES and its metabolites were detected in fermentation residues at 0, 12 and 24 h of fermentation, respectively. The results showed as follows:1) as the fermentation time prolonged, the gas production of both substrates increased. Under the high concentrate condition, the 24 h gas production and gas production rate decreased linearly with the RES supplemental level increasing (P < 0.05). However, the gas production parameters were not significantly different among the adding RES groups under high forage condition (P>0.05). 2) Under the high forage condition, with the RES supplemental level increasing, there was no significant change in pH (P>0.05); the molar proportion of acetate, total VFA concentration and acetate/propionate in fermentation broth of each RES addition group were significantly lower than those of the unadded RES group at 12 and 24 h of fermentation (P < 0.05), while the molar proportion of propionate was significantly higher than that of the unadded RES group (P < 0.05); the molar proportion of butyrate in fermentation broth of the 14.3% and 25.0% RES groups was significantly lower than that of the unadded RES group at 12 h of fermentation (P < 0.05), and it in each RES addition group was significantly lower than that of the unadded RES group at 24 h of fermentation (P < 0.05). Under the high concentrate condition, with the RES supplemental level increasing, the fermentation broth pH of 14.3% and 25.0% RES groups was significantly higher than that of the unadded RES group at 12 h of fermentation (P < 0.05), and it of each RES addition group was significantly higher than that of the RES group at 24 h of fermentation (P < 0.05); the molar proportion of acetic acid in fermentation broth of each RES addition group was significantly lower than that of the unadded RES group at 12 h of fermentation (P < 0.05), and it of 14.3% and 25.0% RES groups were significantly lower than that of the unadded RES group at 24 h of fermentation (P < 0.05); the molar proportion of propionic acid in fermentation of each RES addition group was significantly higher than that of the unadded RES group at the two fermentation time points (P < 0.05); the molar proportion of butyric acid, the total VFA concentration and acetic acid/propionic acid in fermentation of each RES addition group were significantly lower than those of the unadded RES group at the two fermentation time points (P < 0.05). 3) RES was degraded in both two types of substrate conditions and more degradable in high concentrate condition. Its main metabolite was dihydro-resveratrol (DH-RES). The above results indicate that the forage to concentrate ratio of substrate affects the regulation effect of RES on gas production and fermentation, and high supplemental level of RES has an inhibitory effect on rumen fermentation. RES can be degraded and metabolized in the rumen environment, and RES and its metabolite DH-RES show stronger degradation characteristics under the high concentrate condition.
Key words: resveratrol    in vitro fermentation    volatile fatty acid    dihydro-resveratrol    

瘤胃是迄今已知降解纤维物质能力最强的天然厌氧发酵罐,对反刍动物摄入饲粮的降解具有重要意义。饲粮中的粗纤维可在瘤胃微生物的作用下,由结构复杂的碳水化合物降解为短链的挥发性脂肪酸(VFA)以及由氢气(H2)、二氧化碳(CO2)、甲烷(CH4)等组成的混合气体。VFA通过瘤胃壁吸收进入血液,最终转运至各组织器官被动物机体利用,是反刍动物机体主要能量来源。反刍动物以VFA形式吸收的能量占总吸收能量的70%~80%[1]。因此,研究调控瘤胃内环境的措施、改善瘤胃发酵对提高反刍动物的生产性能具有重要意义。在反刍动物饲粮中添加饲料添加剂是生产中常用的调控瘤胃发酵的方式之一,饲料添加剂主要包括脂肪或脂肪酸、化学制剂、微生物及其代谢产物和植物提取物等,其中植物提取物具有低毒副作用、天然性、营养性和动物产品中基本无残留等多种优势[2-3]。已有研究表明,部分植物提取物(如皂苷、单宁和精油)具有减少甲烷排放和改变瘤胃发酵模式等功能,进而影响瘤胃发酵,提高动物生产性能[4-5]

植物中的活性物质又称次生代谢产物,按结构分主要包括多酚类、烯萜类化合物和含氮有机物三大类[6]。白藜芦醇(resveratrol, RES)是一种生物活性很强的天然非黄酮多酚类物质,主要来源于花生、葡萄(果皮和籽中含量较高)、桑椹和虎杖等植物[7]。RES及其衍生物由于抗氧化、神经保护和心脏保护等功能,在膳食、保健和医药等领域得到广泛应用[8]。本团队陈丹丹[9]和Ma等[10]研究表明,在饲粮中添加RES可以在不影响瘤胃整体发酵水平的情况下,促使瘤胃发酵由乙酸发酵模式向丙酸发酵模式转变并促进动物生长,但上述研究中使用的饲粮以粗料为主(约占70%)。李岩等[11]、曾燕霞等[12]研究表明饲粮组成和营养结构会对添加剂的效果产生不同影响,高精料条件下RES的作用效果是否与高粗料条件下一致并不明确。此外,对人和其他单胃动物的研究表明,RES会被胃肠道中的微生物分解生成不同的代谢产物[13-14],而其在反刍动物瘤胃中的代谢情况还未见报道。明确RES在瘤胃中的代谢产物,对于研究其在反刍动物体内的作用机制具有重要意义。因此,本试验通过研究高精/粗料底物条件下RES添加水平对体外产气参数、发酵参数的影响,为实际生产中合理利用植物提取物提供依据;同时,通过研究RES在瘤胃环境下的降解和其代谢产物,为研究天然植物提取物在瘤胃中的代谢和作用机制提供参考。

1 材料与方法 1.1 试验地点与时间

本试验于2018年8—11月在中国农业科学院南口中试基地进行。

1.2 试验材料

试验用RES来自湖南省长沙世唯生物科技有限公司,纯度≥98%。2种类型底物按照精粗比分别为68 : 32(高精料)和28 : 72(低精料)进行配制,其组成及营养水平见表 1

表 1 2种类型底物组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of 2 types of substrates (DM basis)  
1.3 瘤胃液供体动物及其饲养管理

选择3只体况良好、平均体重(50.0±2.3) kg、安装有永久性瘤胃瘘管的杜泊()×小尾寒羊(♀)F1代杂交公羊作为瘤胃液供体。试验羊单栏栓系饲养,试验饲粮为全混合颗粒饲料,精粗比为40 : 60,精料以玉米、小麦麸、大豆粕为主,粗料为羊草。每天08:00和16:00各饲喂1次,每只羊日饲喂量按维持需要确定,自由饮水,栏舍每周进行1次消毒和粪便清理。试验羊预饲15 d,在第16天开始采集瘤胃液进行试验。

1.4 瘤胃体外发酵试验

体外瘤胃发酵采用Menke等[15]的体外产气法进行。晨饲前2 h采集3只羊的新鲜瘤胃液等量混合,经4层纱布过滤至保温瓶(CO2环境,提前预热至39 ℃)中带回实验室。参照文献[15]配制瘤胃缓冲液,将瘤胃缓冲液与瘤胃液以2 : 1体积比混合均匀制成体外瘤胃培养液,并持续通入CO2 2 min维持厌氧环境。瘤胃培养管(D-89173,Haberle Labortechnik,德国)规格:长200 mm,内径32 mm,最大量程100 mL。采用单因素试验设计,分别称取2种底物[精粗比分别为68 : 32(高精料)和28 : 72(低精料)]300 mg(精确到0.000 1 g)于培养管中,并分别添加0(对照)、7.7%、14.3%和25.0%(干物质基础)的RES,同时设置空白(培养管内仅加体外瘤胃培养液)以减少系统误差,每个处理设置5个重复。利用定量移液器从培养管前端加入30 mL体外瘤胃培养液,再将培养管迅速转移入水温为39 ℃的水浴恒温振荡器(DSHZ-300A,北京成萌伟业科技有限公司),开始试验并计时。待培养12和24 h后,分2批取出所有培养管放入冰水浴中,终止发酵。随后,收集培养管中的发酵液用于pH和VFA浓度检测。

1.5 RES体外降解试验

RES体外降解试验利用体外模拟培养箱(ANKOM-Daisy Ⅱ,瑶恩国际有限公司)进行。人工瘤胃发酵液的配制参照韩璐璐[16]的方法。称取6 g(精确到0.000 1 g)精粗比分别为68 : 32(高精料)和28 : 72(低精料)的2种类型底物和RES(添加水平为14.3%)至F510滤袋中,分别发酵0、12和24 h,其中以发酵0 h时作为对照(培养瓶中不加入人工瘤胃发酵液)。在2种类型底物条件下的3个发酵时间均设置4个重复。所有滤袋用封口机封口,随后将需发酵24 h的滤袋先放入盛有人工瘤胃发酵液(2 000 mL)的培养瓶中,持续通入CO2 2 min维持厌氧环境,再移至培养箱(39 ℃)振荡培养;过12 h后再将需要发酵12 h的滤袋重复上述操作。待发酵完毕,统一取出滤袋,将不同发酵时间的滤袋一起放入清水中轻揉漂洗至水澄清,不同处理的滤袋漂洗次数保持一致。随后将滤袋放入烘箱,在65 ℃烘48 h至恒重,最后分析发酵不同时间发酵残余物中RES及其代谢产物浓度。

1.6 测定指标与方法 1.6.1 体外产气参数

体外瘤胃发酵试验开始后,分别在0、2、4、8、12、16、24 h时记录产气量。根据France等[17]提出的产气模型:Y=b×[1-e-(t-L)][式中:Y为发酵底物在t时间点的产气量(mL);b为潜在产气量(mL);c为发酵底物产气速度(mL/h);t为培养时间(h);L为产气延滞时间(h)],调用SPSS 23.0统计软件中非线性(nonlinear)回归程序进行产气参数估算。

1.6.2 体外发酵参数

终止发酵后,立即用pH测定仪(Testo-205,上海康纳环境技术有限公司)测定发酵液的pH。

收集发酵后的发酵液,使用气相色谱仪(GC128,上海仪电分析仪器有限公司)以2-乙基丁酸(2EB)为内标,分析样品中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸浓度。仪器条件为:火焰离子化检测器(FID),毛细管色谱柱(FFAP,50 m×0.32 mm×0.5 μm),柱温120 ℃,检测器和进样器温度220 ℃,氮气(N2)=65 mL/min,空气=300 mL/min,氢气=30 mL/min,灵敏度1×1010

1.6.3 发酵残余物中RES及其代谢产物浓度

取发酵残余物烘干样品,使用超高效液相-三重四极杆质谱联用仪(Agilent 1290-6495,苏州莱顿科学仪器有限公司)对样品中RES、二氢藜芦醇(DH-RES)、半月苔素(lunularin)和3, 4-二羟基-反式二苯乙烯进行定性、定量分析。

1.6.3.1 色谱条件

色谱柱:Atlantis T3(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱温:40 ℃;流动相:乙腈和0.05%氨水;流速:0.4 mL/min;洗脱时间:6 min;进样量:2 μL。

1.6.3.2 质谱条件

电离方式:电喷雾电离,负离子模式;离子喷雾电压:3.5 kV;雾化气和干燥气均为氮气,雾化气40 psi;干燥气7 L/min,温度350 ℃;鞘流气12 L/min,温度350 ℃;碰撞气为氮气,压力为0.2 MPa。

1.7 数据统计分析

所有数据用Excel 2016进行初步整理后,再用SPSS 23.0统计软件做进一步统计分析。首先,采用GLM程序分别对2种底物条件下不同RES添加水平处理进行单因素方差分析,并采用Duncan氏法进行多重比较;然后,用线性估计(curve estimation)程序进行线性(linear)和二次函数(quadratic)显著性检验。以P < 0.05代表差异显著性判断标准,结果用平均值表示,变异程度用均值标准误(SEM)表示。

2 结果与分析 2.1 24 h产气量

不同RES添加水平下,2种类型底物在不同发酵时间点的动态产气曲线见图 1。随着发酵时间的延长,2种类型底物的产气量均呈上升趋势,在0~12 h时曲线斜率较大,说明在此时间段内产气速率快;随后曲线趋于平缓,说明产气速率逐渐减小,底物发酵产气向最大产气量趋近。在相同RES添加水平下,2种类型底物中各发酵时间点的产气量在高精料条件下更高。与未添加RES相比,在高精料条件下,添加不同水平RES后产气量在各发酵时间点均显著降低(P < 0.05);在高粗料条件下,添加不同水平RES后产气量在发酵2、4 h时无显著变化(P>0.05),在发酵8 h及以后的各时间点均显著降低(P < 0.05)。

数据点标注*表示各白藜芦醇添加组均与未添加白藜芦醇组差异显著(P < 0.05)。 Date points with * mean significant difference between unadded RES group and each RES addition group (P < 0.05). 图 1 白藜芦醇对2种类型底物体外发酵24 h产气量的影响 Fig. 1 Effects of resveratrol on 24 h gas production of in vitro fermentation of 2 types of substrates
2.2 体外产气参数

表 2可知,在2种类型底物条件下添加RES后,各产气参数均发生了显著变化(P < 0.05)。当底物为高精料时,随RES添加水平的增加,产气速率呈线性降低(P < 0.05),产气延滞时间呈线性升高(P < 0.05)。当底物为高粗料时,随RES添加水平的增加,产气延滞时间和产气速率的变化趋势与底物为高精料时相似,但各RES添加组之间差异不显著(P>0.05)。上述结果说明,添加RES抑制体外发酵产气,且在高精料底物中存在剂量效应,此结果与图 1具有一定相似性。

表 2 白藜芦醇对2种类型底物体外产气参数的影响 Table 2 Effects of RES on in vitro gas production parameters of 2 types of substrates
2.3 体外发酵参数

分析RES对高粗料底物瘤胃体外发酵参数的影响(表 3)可知,随着发酵时间的延长,各组发酵液中除乙酸摩尔比例、乙酸/丙酸和总VFA浓度增加,pH和其他VFA摩尔比例均降低。在2个发酵时间点,丙酸摩尔比例随RES添加水平的增加线性或二次曲线升高(P < 0.05);乙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸摩尔比例以及乙酸/丙酸和总VFA浓度均呈线性或二次曲线降低(P < 0.05)。各组pH在2个发酵时间点均无显著差异(P>0.05)。各RES添加组乙酸、戊酸摩尔比例以及乙酸/丙酸和总VFA浓度在2个发酵时间点均显著低于未添加RES组(P < 0.05),丙酸摩尔比例均显著高于未添加RES组(P < 0.05)。25.0%RES组的异丁酸摩尔比例在2个发酵时间点均显著低于未添加RES组(P < 0.05)。对于丁酸摩尔比例,14.3%和25.0%RES组在发酵12 h时显著低于未添加RES组(P < 0.05);各RES添加组在发酵24 h时均显著低于未添加RES组(P < 0.05)。异戊酸摩尔比例,在发酵12 h时表现为各RES添加组与未添加RES组无显著差异(P>0.05);在发酵24 h时表现为各RES添加组显著低于未添加RES组(P < 0.05)。

表 3 白藜芦醇对高粗料底物瘤胃体外发酵参数的影响 Table 3 Effects of RES on in vitro rumen fermentation parameters of high forage substrate

分析RES对高精料底物瘤胃体外发酵参数的影响(表 4)可知,随着发酵时间的延长,各组发酵液中除pH、丙酸摩尔比例降低,乙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸摩尔比例以及总VFA浓度和乙酸/丙酸均增加。在2个发酵时间点,pH和丙酸摩尔比例随RES添加水平的增加均线性或二次曲线升高(P < 0.05),其他指标均线性或二次曲线降低(P < 0.05)。与未添加RES组相比,在发酵12 h时,14.3%和25.0%RES组pH均显著上升(P < 0.05);在发酵24 h时,各RES添加组pH均显著升高(P < 0.05)。各RES添加组乙酸摩尔比例在发酵12 h时较未添加RES组显著降低(P < 0.05),在发酵24 h时14.3%和25.0%RES组较未添加RES组显著降低(P < 0.05)。各RES添加组丙酸摩尔比例在2个发酵时间点均较未添加RES组显著升高(P < 0.05)。与未添加RES组相比,在发酵12 h时14.3%和25.0%RES组异丁酸摩尔比例显著升高(P < 0.05),在发酵24 h时各RES添加组异丁酸摩尔比例均显著降低(P < 0.05)。各RES添加组丁酸、异戊酸、戊酸摩尔比例以及总VFA浓度和乙酸/丙酸在2个发酵时间点均较未添加RES组显著降低(P < 0.05)。

表 4 白藜芦醇对高精料底物瘤胃体外发酵参数的影响 Table 4 Effects of RES on in vitro rumen fermentation parameters of high concentrate substrate
2.4 RES的降解和代谢情况 2.4.1 定性分析

在负离子模式下,根据4种化合物核质比(RES,227 m/z;DH-RES,229 m/z;lunularin,213 m/z;3, 4-二羟基反式二苯乙烯,211 m/z)检测样品中的碎片离子,通过质谱图分析样品中4种化合物的存在情况。结果发现,2种类型底物条件下,在各时间点的发酵残余物中均有RES和DH-RES存在,lunularin和3, 4-二羟基反式二苯乙烯均未检出。

2.4.2 定量分析

取RES和DH-RES标准品,制浓度从低到高的标准品溶液进行色谱分析。对上述2种化合物标准品在不同浓度(x)下得到的峰谱面积(y)进行线性回归,得到标准曲线方程:RES,y=-966.424x2+41 340.2x+1 279.1(R2=0.999 85);DH-RES,y=-937.02x2+49 623.7x+684.797(R2=0.999 88)。

图 2可知,2种类型底物条件下,在发酵0、12和24 h时发酵残余物中均有RES存在;且随着发酵时间的延长,发酵残余物中RES浓度呈递减趋势。在同一发酵时间点,高粗料发酵残余物中RES浓度均高于高精料。以上结果说明,发酵液中RES随发酵时间的延长发生了降解,且在高精料底物条件下表现出了更强的降解特性。

RT:保留时间retention time;Area:峰面积peak area;C:浓度concentration (μg/mL)。下图同The same as below。 图 2 发酵残余物中白藜芦醇检测色谱图 Fig. 2 Chromatograms of RES determination in residual substrate

图 3可知,2种类型底物条件下,在发酵0、12和24 h时发酵残余物中均有DH-RES存在;且随着发酵时间的延长,发酵残余物中DH-RES浓度呈先降低后升高的趋势。在同一发酵时间点,高粗料发酵残余物中DH-RES浓度均高于高精料。以上结果说明,在进行体外发酵之前,试验药品中除RES外还存在少量DH-RES;在发酵的前12 h发生了DH-RES分解代谢,在发酵后12 h通过某种代谢途径生成了大量的DH-RES;而且,在高粗料条件下,RES通过该代谢途径产生了更多的DH-RES。

图 3 发酵残余物中二氢白藜芦醇检测色谱图 Fig. 3 Chromatogram of DH-RES determination in residual substrate
3 讨论 3.1 底物类型对体外产气和发酵参数的影响

发酵24 h动态产气量结果表明,各组体外产气量总的变化趋势均历经缓慢增加、快速增加、趋于平缓3个过程,此过程与李文娟等[18]的产气趋势相似。一方面,可能是随着发酵时间的延长,大量底物被瘤胃微生物降解,可分解的底物越来越少;另一方面,发酵液中累积的VFA和氨态氮随着发酵时间的延长逐渐增加,发酵环境发生改变,一定程度上抑制了瘤胃微生物的活性,因此在后期产气量变化趋于平缓[19]

体外发酵产气量、发酵液pH的变化主要与底物干物质有效降解率有关,降解率又受到底物来源、精粗比和处理方式等的影响[20-21]。本试验中,在相同RES添加水平下,随发酵时间的延长,高精料条件下各组产气量、产气速率和发酵液总VFA浓度均高于高粗料条件下。陈光吉等[22]研究了5种非纤维性碳水化合物(NFC)/中性洗涤纤维(NDF)下黑山羊体外产气和发酵参数的影响,结果表明,随NFC/NDF比例的升高,24 h产气量、产气速率和发酵液总VFA浓度呈上升趋势,发酵液pH显著降低。王志敬等[23]研究了以精料与皇竹草(粗料)为底物对雷州山羊体外瘤胃发酵的影响,结果表明,随底物精粗比的增加和发酵时间的延长,产气量显著增加,发酵液pH显著下降。以上研究结果均与本试验结果相似。这是因为累积发酵产物主要与瘤胃中的微生物活性有关,当饲粮中的精料比例较高时,易于降解的非结构性碳水化合物(如淀粉、蔗糖等)含量增加,更有利于微生物的利用和繁殖,从而使不同精粗比底物的发酵产生了差异。另外,在纤维素表面有一层结构域、糖苷键等复杂结构的纤维素晶体,需要纤维素分解菌产生的纤维素酶降解才能被动物利用,随粗料比例的升高,纤维素结晶面积变大[24],从而抑制了底物的发酵。

3.2 RES添加水平对体外产气和发酵参数的影响

瘤胃环境中的发酵除了底物因素,还受到外源添加剂的影响。张然等[25]在底物(精粗比为30 : 70)中添加牛至油(主要活性成分为香芹酚和百里酚),结果显示,随牛至油添加水平的上升,累积产气量和发酵液总VFA浓度均呈线性降低,这可能是因为牛至油抑制了瘤胃原虫、细菌和主要纤维素分解菌的生长[26]。Becker等[27]的体外试验表明,在底物中添加RES后显著降低了发酵液总VFA浓度,并指出这是由于RES对瘤胃微生物生长具有抑制作用所致。本试验中,2种类型底物条件中,随着RES添加水平的上升,产气量、产气速率和发酵液总VFA浓度均呈降低趋势。然而,Ma等[10]和张卫兵等[28]的研究发现,RES的添加并未对动物瘤胃内总VFA浓度产生显著影响。而且,Ma等[10]的研究还表明,RES的添加对乙酸生成无显著影响,使瘤胃内丙酸浓度升高,丁酸浓度降低。在本试验的2种类型底物条件下,随着RES添加水平的升高,发酵液乙酸、丁酸摩尔比例均降低,丙酸摩尔比例升高。造成结果差异的原因,一方面可能与本试验中RES的添加水平较高有关,Patra等[29]指出多种甲烷抑制剂在高添加水平下会对瘤胃发酵造成负面影响,而低添加水平下可以维持甚至促进瘤胃发酵;另一方面可能是因为体外试验中VFA的量均为一定时间段的累积结果,与动物试验中瘤胃内动态代谢所产生的结果会有一定差异性。此外,本试验的2种类型底物条件下添加RES后发酵液乙酸/丙酸均呈线性下降,此结果与张卫兵等[28]、Ma等[10]的结果一致。Ma等[10]的结果中RES显著降低了瘤胃中原生动物的数量,这可能是导致乙酸/丙酸降低的一个原因。瘤胃内原虫不仅与粗纤维降解有关,而且原虫还会吞噬降解NFC的产丙酸菌[30],因此原虫数量降低会减少产丙酸菌被吞噬,有利于丙酸产量的增加。Vasta等[31]也指出,多酚类植物提取物可以抑制降解纤维的革兰氏阳性纤维分解菌和纤毛虫,这一结果直接降低乙酸产量,从而导致乙酸/丙酸降低。基于上述结果,RES可在一定程度上改变瘤胃发酵模式,此过程有利于饲粮中能量利用效率的提高[32]

本试验还发现RES对高精料底物条件下产气参数的影响呈剂量效应。有报道指出,酚类化合物可以与饲粮中的蛋白质形成结构复杂的蛋白质复合物,甚至可以影响参与生命活动的酶,从而降低瘤胃微生物活性[33]。由此推测,高添加水平的RES主要通过抑制蛋白质的降解和酶活性,从而使其在2种类型底物中的作用效果产生了差异。

3.3 RES在不同类型底物条件下的降解和代谢

由于RES化学键的特殊性,其代谢产物主要通过自由基(酚羟基和不饱和双键)氧化产生,一般包括DH-RES、3, 4-二羟基-反式二苯乙烯、lunularin、单硫酸RES、单硫酸DH-RES等[34]。目前RES的应用和代谢产物的研究大多集中在人类和大鼠上,在反刍动物上还未见报道。在人类的研究中发现,口服RES后,胃肠道中均检测出了DH-RES和lunularin[13-14, 35];并且,Jung等[14]在人类粪便中分离出了2种分解DH-RES的细菌:迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)和单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)。DH-RES和RES均为有益于动物健康的抗氧化剂,但DH-RES抗氧化能力弱于RES;同时,DH-RES可以调节钾离子通道、抑制DNA合成,对人类前列腺癌细胞具有抗增殖作用[36]。在本研究中,随着发酵时间的延长,发酵液中RES浓度降低,而DH-RES浓度升高,说明在瘤胃微生物的作用下,RES可能利用瘤胃环境中的氢还原双键产生DH-RES。本试验中RES在高精料条件下显示出了更高的降解率,可能是由于饲粮的精粗比影响了瘤胃环境中微生物种群的丰富度和多样性[37],从而使RES在2种类型底物中的代谢产生了差异。

另外,本试验在发酵后的残余物中并没有检测出lunularin和3, 4-二羟基-反式二苯乙烯。这可能是因为不同物种胃肠道内降解RES的微生物存在差异造成的,在Bode等[13]的研究中也只是在部分人的粪便样品中检测到了lunularin,并且结果显示样本间菌群差异也会对lunularin产生造成影响。Alfaras等[38]在大鼠上的研究也表明,口服RES后DH-RES是结肠中最丰富的代谢产物,而其他代谢产物的产量均较少。虽然目前利用高效液相色谱、质谱以及气相色谱-质谱联用等技术对RES及其代谢产物的研究已经有了较全面的认识,但是大多数代谢产物在动物体内产生的生理影响及其作用机制还不明确,需要开展深入研究。

4 结论

本试验结果表明,高添加水平的RES抑制了体外发酵,同时添加效果受到底物类型的影响,在高精料条件下RES对产气参数的影响呈剂量效应;RES可以有效调控瘤胃发酵方式,使其由乙酸型发酵向丙酸型发酵转变,从而提高能量的有效利用;此外,RES可以在瘤胃环境中降解代谢,且RES及其代谢产物DH-RES在高精料条件下显示出更强的降解特性。

参考文献
[1]
栗明月, 方洛云, 苏汉书, 等. 竹叶提取物对奶牛瘤胃体外发酵参数及产气量的影响[J]. 动物营养学报, 2019, 31(4): 1816-1822.
[2]
MENDEL M, MAGDALENA CHŁOPECKA, DZIEKAN N, et al. Phytogenic feed additives as potential gut contractility modifiers-a review[J]. Animal Feed Science and Technology, 2017, 230.
[3]
张华, 童津津, 孙铭维, 等. 植物提取物对反刍动物瘤胃发酵、生产性能及甲烷产量的调控作用及其机制[J]. 动物营养学报, 2018, 30(6): 2027-2035. DOI:10.3969/j.issn.1006-267x.2018.06.002
[4]
BELANCHE A, PINLOCHE E, PRESKETT D, et al. Effects and mode of action of chitosan and ivy fruit saponins on the microbiome, fermentation and methanogenesis in the rumen simulation technique[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2016, 92(1): fiv160.
[5]
KHIAOSA-ARD R, ZEBELI Q. Meta-analysis of the effects of essential oils and their bioactive compounds on rumen fermentation characteristics and feed efficiency in ruminants[J]. Journal of Animal Science, 2013, 91(4): 1819-1830. DOI:10.2527/jas.2012-5691
[6]
董瑞阳, 孙凯佳, 高腾云. 植物次生代谢产物调控反刍动物瘤胃发酵及甲烷产生的研究进展[J]. 家畜生态学报, 2013, 34(10): 1-5. DOI:10.3969/j.issn.1673-1182.2013.10.001
[7]
JANG M, CAI L N, UDEANI G O, et al. Cancer chemopreventive activity of resveratrol, a natural product derived from grapes[J]. Science, 1997, 275(5297): 218-220. DOI:10.1126/science.275.5297.218
[8]
BUSQUET M, CALSAMIGLIA S, FERRE A, et al. Plant extracts affect in vitro rumen microbial fermentation[J]. Journal of Dairy Science, 2006, 89(2): 761-771. DOI:10.3168/jds.S0022-0302(06)72137-3
[9]
陈丹丹.四种植物提取物对肉羊甲烷排放、物质代谢及瘤胃微生物区系的影响[D].硕士学位论文.乌鲁木齐: 新疆农业大学, 2014. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10758-1015548182.htm
[10]
MA T, CHEN D D, TU Y, et al. Effect of dietary supplementation with resveratrol on nutrient digestibility, methanogenesis and ruminal microbial flora in sheep[J]. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 2015, 99(4): 676-683. DOI:10.1111/jpn.12264
[11]
李岩, 丁耿芝, 姚倩倩, 等. 活性酵母添加对饲喂不同精粗比日粮肉牛血浆代谢组的影响[J]. 中国畜牧兽医, 2019, 46(1): 89-100.
[12]
曾燕霞, 陈志龙, 王林, 等. 不同精粗比日粮中添加甘露寡糖对绵羊体外发酵的影响[J]. 中国畜牧兽医, 2016, 43(1): 68-75.
[13]
BODE L M, BUNZEL D, HUCH M, et al. In vivo and in vitro metabolism of trans-resveratrol by human gut microbiota[J]. The American Journal of Clinical Nutrition, 2013, 97(2): 295-309. DOI:10.3945/ajcn.112.049379
[14]
JUNG C M, HEINZE T M, SCHNACKENBERG L K, et al. Interaction of dietary resveratrol with animal-associated bacteria[J]. FEMS Microbiology Letters, 2009, 297(2): 266-273. DOI:10.1111/j.1574-6968.2009.01691.x
[15]
MENKE K H, RAAB L, SALEWSKI A, et al. The estimation of the digestibility and metabolizable energy content of ruminant feedingstuffs from the gas production when they are incubated with rumen liquor in vitro[J]. Journal of Agricultural Science, 1979, 93(1): 217-222. DOI:10.1017/S0021859600086305
[16]
韩璐璐.体外模拟环境下日粮粗蛋白水平对绵羊瘤胃发酵和养分降解的影响[D].硕士学位论文.沈阳: 沈阳农业大学, 2016. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10157-1016149216.htm
[17]
FRANCE J, DIJKSTRA J, DHANOA M S, et al. Estimating the extent of degradation of ruminant feeds from a description of their gas production profiles observed in vitro:derivation of models and other mathematical considerations[J]. British Journal of Nutrition, 2000, 83(2): 143-150.
[18]
李文娟, 王世琴, 马涛, 等. 体外产气法评定甘蔗副产物作为草食动物饲料的营养价值[J]. 饲料研究, 2016(18): 16-22.
[19]
周汉林, 李茂, 白昌军, 等. 应用体外产气法研究柱花草的饲用价值[J]. 热带作物学报, 2010, 31(10): 1696-1701. DOI:10.3969/j.issn.1000-2561.2010.10.008
[20]
马绍楠, 许贵善, 李娜, 等. 新疆南疆养羊常用粗饲料体外产气量与有效降解率的相关性分析[J]. 饲料工业, 2018, 39(5): 33-39.
[21]
LEI Y G, LI X Y, WANG Y Y, et al. Determination of ruminal dry matter and crude protein degradability and degradation kinetics of several concentrate feed ingredients in cashmere goat[J]. Journal of Applied Animal Research, 2018, 46(1): 134-140. DOI:10.1080/09712119.2016.1276916
[22]
陈光吉, 宋善丹, 彭忠利, 等. 体外产气法研究不同NFC/NDF底物条件下外源纤维素酶的适宜添加水平[J]. 草业学报, 2017, 26(7): 116-127.
[23]
王志敬, 吴征敏, 庄桂锋, 等. 不同精粗比日粮对雷州山羊体外瘤胃发酵的影响[J]. 中国畜牧兽医, 2017, 44(8): 2303-2310.
[24]
KLYOSOV A A. Trends in biochemistry and enzymology of cellulose degradation[J]. Biochemistry, 1990, 29(47): 10577-10585. DOI:10.1021/bi00499a001
[25]
张然, 郑琛, 闫晓刚, 等. 体外产气法研究牛至油对绵羊瘤胃发酵特性和甲烷产量的影响[J]. 动物营养学报, 2018, 30(8): 3168-3175. DOI:10.3969/j.issn.1006-267x.2018.08.035
[26]
PATRA A K, YU Z T. Essential oils affect populations of some rumen bacteria in vitro as revealed by microarray (RumenBactArray) analysis[J]. Frontiers in Microbiology, 2015, 6: 297.
[27]
BECKER P M, VAN WIKSELAAR P G. Effects of plant antioxidants and natural vicinal diketones on methane production, studied in vitro with rumen fluid and a polylactate as maintenance substrate[J]. Animal Feed Science and Technology, 2011, 170(3/4): 201-208.
[28]
张卫兵, 张蓉, 刁其玉, 等. 白藜芦醇和血根碱对2月龄以内犊牛生长性能、血清指标及腹泻状况的影响[J]. 动物营养学报, 2018, 30(6): 2411-2420. DOI:10.3969/j.issn.1006-267x.2018.06.047
[29]
PATRA A K, YU Z. Effects of garlic oil, nitrate, saponin and their combinations supplemented to different substrates on in vitro fermentation, ruminal methanogenesis, and abundance and diversity of microbial populations[J]. Journal of Applied Microbiology, 2015, 119(1): 127-138. DOI:10.1111/jam.12819
[30]
冯仰廉. 反刍动物营养学[M]. 南京: 科学出版社, 2004: 16-17.
[31]
VASTA V, DAGHIO M, CAPPUCCI A, et al. Invited review:plant polyphenols and rumen microbiota responsible for fatty acid biohydrogenation, fiber digestion, and methane emission:experimental evidence and methodological approaches[J]. Journal of Dairy Science, 2019, 102(5): 3781-3804. DOI:10.3168/jds.2018-14985
[32]
金舒文, 王佳堃. 瘤胃产甲烷菌与其他微生物间的氢传递及其调控研究进展[J]. 中国畜牧杂志, 2019, 55(2): 1-6.
[33]
HIERHOLZER A, CHATELLARD L, KIERANS M, et al. The impact and mode of action of phenolic compounds extracted from brown seaweed on mixed anaerobic microbial cultures[J]. Journal of Applied Microbiology, 2013, 114(4): 964-973. DOI:10.1111/jam.12114
[34]
LIU W T, SHIUE Y L, LIN Y R, et al. A derivative method with free radical oxidation to predict resveratrol metabolites by tandem mass spectrometry[J]. Current Analytical Chemistry, 2015, 11(4): 300-306. DOI:10.2174/1573411011666150515233817
[35]
ROTCHES-RIBALTA M, URPI-SARDA M, LLORACH R, et al. Gut and microbial resveratrol metabolite profiling after moderate long-term consumption of red wine versus dealcoholized red wine in humans by an optimized ultra-high-pressure liquid chromatography tandem mass spectrometry method[J]. Journal of Chromatography A, 2012, 1265: 105-113. DOI:10.1016/j.chroma.2012.09.093
[36]
XIE C F, YUAN H Q, QU J B, et al. Biocatalytic production of acyclic bis[bibenzyls] from dihydroresveratrol by crude Momordica charantia peroxidase[J]. Chemistry & Biodiversity, 2009, 6(8): 1193-1201.
[37]
李岚捷, 成述儒, 刁其玉, 等. 不同NFC/NDF水平饲粮对犊牛瘤胃发酵参数和微生物区系多样性的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(12): 2347-2357. DOI:10.11843/j.issn.0366-6964.2017.12.014
[38]
ALFARAS I, JUAN M E, PLANAS J M. Trans, resveratrol reduces precancerous colonic lesions in dimethylhydrazine-treated rats[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(13): 8104-8110. DOI:10.1021/jf100702x