动物营养学报    2020, Vol. 32 Issue (1): 372-381    PDF    
复合法制备嗜酸乳杆菌-双歧杆菌益生菌微胶囊饲料工艺及体外消化特性研究
吴小嫚 , 胡乐琴     
上海海洋大学水产与生命学院, 水产科学国家级实验教学示范中心, 农业部淡水水产种质资源重点实验室, 农业部鱼类营养与环境生态研究中心, 上海 201306
摘要: 本文采用锐孔凝固浴法和复凝聚法复合法,以海藻酸钠和壳聚糖为壁材,将嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和饲料包埋起来制备成益生菌微胶囊饲料,并对其制备工艺条件进行了研究。本试验将包埋率作为评价益生菌微胶囊饲料的主要指标,同时测定其粒径大小、悬浮率和溶解率,通过单因素试验和正交试验,研究了不同因素对这些理化性质的影响。结果表明:最佳制备工艺条件为海藻酸钠浓度1.25%,菌胶比例1:10,氯化钙浓度1.5%,固化时间15 min,壳聚糖浓度1.5%。在这个工艺条件下,制备的益生菌微胶囊饲料粒径大小均匀,在1.60~2.00 mm;包埋率达到96.68%;而且在水中浸泡12 h后,悬浮率为77.96%,溶解率为13.04%;在模拟人工胃液中处理120 min后,仍然有5.2 lg(CFU/mL)的活菌数;在模拟人工肠液中处理120 min后,所包埋的活菌可全部释放出来,具备较好的漂浮性、水稳定性、耐酸性以及肠溶性。
关键词: 嗜酸乳杆菌    双歧杆菌    锐孔凝固浴法    复凝聚法    益生菌微胶囊饲料    
Study on Preparation and in Vitro Digestive Characteristics of Lactobacillus acidophilus-Bifidobacterium Probiotics Microcapsules Feed by Composite Method
WU Xiaoman , HU Yueqin     
National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources, Ministry of Agriculture, Centre for Research on Environmental Ecology and Fish Nutrition of the Ministry of Agriculture, College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
Abstract: In this paper, sodium alginate and chitosan were used as shell-materials, the Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium and feed were coated to preparing probiotic microcapsules feed by perforation-curing with complex coacervation composite method, and the preparation conditions were studied. In this experiment, the encapsulation rate was used as the main index to evaluate the probiotic microcapsule feed, and its particle size, suspension rate and solubility rate were also determined, and the effects of different factors on these physical and chemical properties were studied by single factor test and orthogonal test. The results showed that the optimum preparation process conditions were determined as:the sodium alginate concentration 1.25%, the proportion of probiotics and sodium alginate 1:10, calcium chloride concentration 1.5%, curing time 15 min, and chitosan concentration 1.5%. Under these conditions, the particle size of probiotic microcapsule feed is uniform, ranging from 1.60 to 2.00 mm; and the encapsulation rate is reached 96.68%. Moreover, the suspension rate is 77.96% and the solubility is 13.04% after soaking in water for 12 h; and still have a survival rate of 5.2 lg(CFU/mL) after 120 min in simulated artificial gastric juice; and the embedded live bacteria can be completely released after 120 min in simulated artificial intestinal fluid, which has good floatability, water stability, acid resistance and enteric solubility.
Key words: Lactobacillus acidophilus    Bifidobacterium    perforation-curing method    complex coacervation method    probiotic microcapsules feed    

嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)是2类常见的动物胃肠道益生菌群,能够产生多种抗菌物质,与病原菌发生拮抗作用,调节肠道微生态平衡,提高动物抗病能力[1-7]。益生菌虽然具有广泛的生理功能,但对外界环境因素高度敏感[8-12],还会受到胃酸、胆汁以及消化酶的影响,因此,只有少量益生菌能够定植于肠道后发挥作用[13-15]

在实际生产中,将乳酸菌包埋成微胶囊,是提高其存活率的一种常用手段[16-18]。微胶囊化是利用一些高分子材料,将固体、液体或气体包埋起来,形成直径为几微米到几毫米的微球,从而保护内部物质免受各种环境因素的影响,它的尺寸、结构和形状与所采用的壁材和微胶囊化方法有关[19-21]。其中,锐孔凝固浴法是一种将芯材与壁材混合,通过锐孔装置滴加到凝固浴中,聚合物迅速固化形成微胶囊的技术[22-23],具有生产成本低、设备简单、粒径大小均匀且可以控制等优点。复凝聚法是以2种带相反电荷的物质作为壁材,芯材分散其中后会改变体系的一些理化性质,2种壁材发生相互作用,从而析出微胶囊[24]。复凝聚法制备条件温和,可控制芯材释放,提高包埋率。

在我国畜禽水产养殖业中,常将饲料加工成微胶囊,这样能够提高其水稳定性与漂浮性,便于残留饲料清除,降低了水体富营养化。此外,饲料还可以作为一种诱食剂,与其他物质混合制成微胶囊,提高各种动物对微胶囊制品的摄食率。

目前,制备微胶囊很少采用2种或2种以上微胶囊化技术,而且关于将益生菌和饲料混合起来作为芯材的工艺研究也不多。因此,本文采用锐孔凝固浴法和复凝聚法复合法,以海藻酸钠和壳聚糖为壁材,将嗜酸乳杆菌、双歧杆菌以及饲料包裹起来制备成益生菌微胶囊饲料,找出其最佳制备工艺条件,从而为益生菌微胶囊饲料实际生产提供一定的技术支持。

1 材料与方法 1.1 试验材料和试剂

嗜酸乳杆菌和双歧杆菌购自广东微生物菌种保藏中心。

主要试验试剂:海藻酸钠、壳聚糖、碳酸氢钠、二水氯化钙、乙酸、盐酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠、胰蛋白酶(活性≥50 000 U/g)购于国药集团化学试剂有限公司,胃蛋白酶(活性≥3 000 U/g)购于南京都莱生物技术有限公司。

1.2 试验仪器和设备

主要仪器和设备:SQ-510C立式压力蒸汽灭菌器,XW-80A漩涡混合器,MS-400磁力搅拌器,Bante-210 Ph/mV计,GZX-DH400-BS电热恒温干燥箱,SW-CJ-IFD可调式垂直单向洁净工作台。

1.3 试验设计及方法 1.3.1 嗜酸乳杆菌和双歧杆菌的菌悬液制备

将活化至第3代的嗜酸乳杆菌和双歧杆菌菌液分别在4 000 r/min下离心15 min,弃上清液,用无菌生理盐水配制成一定浓度的菌悬液,保存。

1.3.2 主要溶液的配制

参照李宁[25]的方法,分别配制100 mL模拟人工肠液和模拟人工胃液。

1.3.3 微胶囊制备工艺流程

锐孔凝固浴法制备海藻酸钠益生菌微胶囊饲料:将1 g饲料粉末、0.42 g碳酸氢钠和混合菌悬液(体积比1 : 1)加入到装有20 mL海藻酸钠溶液的烧杯中,搅拌混匀后,用1 mL注射器(去针头)将其匀速滴入氯化钙溶液(含有2%乙酸)中,固化10 min后过滤,灭菌水洗涤2次,用滤纸吸干表面水分,备用。此时,形成的海藻酸钠膜带负电荷。

复凝聚法制备海藻酸钠-壳聚糖益生菌微胶囊饲料:将海藻酸钠益生菌微胶囊饲料放入壳聚糖溶液(含有1%乙酸)中,于120 r/min摇床中振荡10 min后过滤。用灭菌水洗涤2次,放入40 ℃恒温干燥箱中烘干至恒重后,收集起来。由于海藻酸钠带负电荷,壳聚糖带正电荷,两者相互反应,会再形成一层壳聚糖膜。

1.3.4 微胶囊包埋率测定

向9 mL磷酸盐缓冲液中加入1 g微胶囊,于37 ℃、200 r/min摇床内振荡1 h后,取样进行活菌计数。包埋率计算公式如下:

1.3.5 微胶囊粒径测定

取5 g微胶囊,分别用8、10、12、14目(孔径分别为3.00、2.00、1.60、1.43 mm)的筛网进行筛分,测定通过筛网的微胶囊质量,计算其占样品总质量的百分数。

1.3.6 微胶囊悬浮率、溶解率测定

取0.5 g微胶囊于烧杯中,加入100 mL蒸馏水,静置12 h后,分别将悬浮于水中的饲料和沉入水底的饲料收集起来,置于40 ℃恒温干燥箱中烘干至恒重后,测定其质量,悬浮率和溶解率计算公式如下。

式中:a为悬浮的饲料质量;b为沉淀的饲料质量。

1.3.7 微胶囊包埋工艺单因素试验

通过单因素试验,比较海藻酸钠浓度(0.50%、0.75%、1.00%、1.25%和1.50%)、菌胶比例(1 : 2、1 : 4、1 : 6、1 : 8和1 : 10)、氯化钙浓度(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%)、固化时间(10、15、20、25和30 min)以及壳聚糖浓度(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%)对微胶囊包埋率、粒径、悬浮率和溶解率的影响。

1.3.8 微胶囊包埋工艺优化

在单因素试验结果的基础上,选出几个因素设计正交试验,确定最佳工艺条件,并测定该条件下微胶囊的粒径范围、悬浮率及溶解率。以普通饲料作为对照组。

1.3.9 微胶囊在模拟人工胃液中耐酸特性研究

取1 g最佳工艺条件下制备的微胶囊到烧杯中,加入9 mL人工胃液,于37 ℃、200 r/min摇床内振荡0、30、60、90、120 min后过滤收集起来,用灭菌水洗涤1次,加入9 mL磷酸盐缓冲液进行破囊,分别取样,进行平板计数。以1 mL混合菌悬液作为对照组。

1.3.10 微胶囊在模拟人工肠液中崩解特性研究

取1 g最佳工艺条件下制备的微胶囊到烧杯中,加入9 mL人工肠液,于37 ℃、200 r/min摇床内振荡0、30、60、90、120、150 min后,分别取样,进行平板计数。

1.4 数据统计与分析

试验数据以“平均值±标准差”表示,采用Excel 2016绘制表格和柱状图。运用SPSS 22.0软件中的ANOVA过程对单因素试验结果进行方差分析,P < 0.05表示差异显著,P>0.05表示差异不显著。最后用Duncan氏法对差异显著的数据进行多重比较。

2 结果与分析 2.1 不同因素对微胶囊包埋率的影响 2.1.1 海藻酸钠浓度对微胶囊包埋率的影响

表 1可知,当其他条件不变时,随着海藻酸钠浓度的增大,包埋率先显著增大后显著减小(P < 0.05)。海藻酸钠浓度为1.25%时包埋率最大,为95.06%。海藻酸钠浓度过低时,形成的海藻酸钠膜很薄,出现破损;海藻酸钠浓度过高时,微胶囊出现拖尾现象,成型效果不佳。所以,海藻酸钠浓度控制在0.75%~1.25%为宜。

表 1 不同因素对微胶囊包埋率的影响 Table 1 Effects of different factors on encapsulation rate of microcapsules  
2.1.2 菌胶比例对微胶囊包埋率的影响

表 1可知,当其他条件不变时,随着菌胶比例的增大,包埋率无显著变化(P>0.05);但形成的海藻酸钠膜逐渐变厚,成型效果变好。所以,菌胶比例选择1 : 10最佳。

2.1.3 氯化钙浓度对微胶囊包埋率的影响

表 1可知,当其他条件不变时,随着氯化钙浓度的增大,包埋率先显著增大后显著减小(P < 0.05)。氯化钙浓度为1.5%时包埋率最大,为92.79%。氯化钙浓度过低或过高时,形成的海藻酸钠膜均出现破损。所以,氯化钙浓度选择在1%~2%为宜。

2.1.4 固化时间对微胶囊包埋率的影响

表 1可知,当其他条件不变时,随着固化时间的延长,包埋率无显著变化(P>0.05)。固化时间为15 min时,成型效果较好,包埋率最大,为90.69%。

2.1.5 壳聚糖浓度对微胶囊包埋率的影响

表 1可知,当其他条件不变时,随着壳聚糖浓度的增大,包埋率先增大后减小。当浓度为1.0%时,包埋率最大,为93.33%,显著高于除1.5%以外的其他浓度(P < 0.05)。壳聚糖浓度过大时,微胶囊出现破损。所以,壳聚糖浓度选择在0.5%~1.5%为宜。

2.2 不同因素对微胶囊粒径的影响 2.2.1 海藻酸钠浓度对微胶囊粒径的影响

表 2可知,当海藻酸钠浓度分别为0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%时,粒径均小于3.00 mm;分别有0、0、5.33%、14.60%、25.00%的粒径在2.00~3.00 mm;分别有80.00%、80.75%、87.53%、72.07%、75.00%的粒径在1.60~2.00 mm;分别有17.64%、15.96%、7.14%、13.33%、0的粒径在1.43~1.60 mm;分别有2.36%、3.29%、0、0、0的粒径小于1.43 mm。

表 2 不同因素对微胶囊粒径的影响 Table 2 Effects of different factors on particle size of microcapsules  
2.2.2 菌胶比例对微胶囊粒径的影响

表 2可知,当菌胶比例分别为1 : 2、1 : 4、1 : 6、1 : 8、1 : 10时,粒径均小于3.00 mm;分别有0、0、8.33%、28.57%、43.75%的粒径在2.00~3.00 mm;分别有77.14%、84.62%、74.53%、71.43%、56.25%的粒径在1.60~2.00 mm;分别有14.03%、7.96%、17.14%、0、0的粒径在1.43~1.60 mm;分别有8.83%、7.42%、0、0、0的粒径小于1.43 mm。

2.2.3 氯化钙浓度对微胶囊粒径的影响

表 2可知,当氯化钙浓度分别为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%时,粒径均小于3.00 mm,大于1.43 mm;分别有15.44%、11.31%、9.36%、0、0的粒径在2.00~3.00 mm;分别有84.56%、88.69%、73.50%、83.57%、89.18%的粒径在1.60~2.00 mm;分别有0、0、17.14%、16.43%、10.82%的粒径在1.43~1.60 mm。

2.2.4 固化时间对微胶囊粒径的影响

表 2可知,当固化时间分别为10、15、20、25、30 min时,粒径均小于3.00 mm,大于1.43 mm;分别有12.50%、12.36%、16.42%、14.34%、15.00%的粒径在2.00~3.00 mm;分别有77.00%、73.89%、70.74%、70.99%、72.55%的粒径在1.60~2.00 mm;分别有10.50%、13.75%、12.84%、14.67%、12.45%的粒径在1.43~1.60 mm。

2.2.5 壳聚糖浓度对微胶囊粒径的影响

表 2可知,当壳聚糖浓度分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%时,粒径均小于3.00 mm,大于1.43 mm;分别有0、3.52%、10.54%、26.44%、63.16%的粒径在2.00~3.00 mm;分别有47.06%、79.81%、72.19%、52.51%、36.84%的粒径在1.60~2.00 mm;分别有52.94%、16.67%、17.27%、21.05%、0的粒径在1.43~1.60 mm。

2.3 不同因素对微胶囊悬浮率和溶解率的影响 2.3.1 海藻酸钠浓度对微胶囊悬浮率和溶解率的影响

图 1-A可知,当其他条件不变时,不同海藻酸钠浓度下的悬浮率均具有显著差异(P < 0.05);海藻酸钠浓度0.75%、1.00%、1.25%时,溶解率无显著差异(P>0.05),但与海藻酸钠浓度0.50%和1.50%时有显著差异(P < 0.05)。随着海藻酸钠浓度的增大,悬浮率先增大后减小,溶解率先减小后增大。海藻酸钠浓度为1.25%时悬浮率最大,溶解率最小,分别为69.43%和15.76%。

数据柱标注相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。 Value columns with the same small letters mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P < 0.05). 图 1 不同因素对微胶囊悬浮率和溶解率的影响 Fig. 1 Effects of different factors on suspension rate and solubility of microcapsules
2.3.2 菌胶比例对微胶囊悬浮率和溶解率的影响

图 1-B可知,当其他条件不变时,不同菌胶比例下的悬浮率均具有显著差异(P < 0.05);菌胶比例为1 : 4和1 : 6时,溶解率无显著差异(P>0.05),但与菌胶比例为1 : 2、1 : 8、1 : 10时有显著差异(P < 0.05)。随着菌胶比例的增大,悬浮率逐渐增大,溶解率先减小后增大。菌胶比例为1 : 10时悬浮率最大,为75.21%;菌胶比例为1 : 8时溶解率最小,为13.45%。

2.3.3 氯化钙浓度对微胶囊悬浮率和溶解率的影响

图 1-C可知,当其他条件不变时,氯化钙浓度为1.0%和2.5%时,悬浮率无显著差异(P>0.05),但与氯化钙浓度为1.5%、2.0%、3.0%时有显著差异(P < 0.05);氯化钙浓度为2.0%和2.5%时,溶解率无显著差异(P>0.05),但与氯化钙浓度为1.0%、1.5%、3.0%时有显著差异(P < 0.05)。随着氯化钙浓度的增大,悬浮率先增大后减小,溶解率先减小后增大。当氯化钙浓度为1.5%时悬浮率最大,溶解率最小,分别为79.09%和12.03%。

2.3.4 固化时间对微胶囊悬浮率和溶解率的影响

图 1-D可知,当其他条件不变时,不同固化时间下的悬浮率均有显著差异(P < 0.05);固化时间为10、15 min时,溶解率无显著差异(P>0.05),但与固化时间为20、25、30 min时有显著差异(P < 0.05)。随着固化时间的延长,悬浮率逐渐增大,溶解率先增大后减小。固化时间为30 min时,悬浮率最大,为69.23%。固化时间为10 min时,溶解率最小,为11.24%。

2.3.5 壳聚糖浓度对微胶囊悬浮率和溶解率的影响

图 1-E可知,当其他条件不变时,不同壳聚糖浓度下的悬浮率和溶解率均具有显著差异(P < 0.05)。随着壳聚糖浓度的增大,悬浮率先增大后减小,溶解率逐渐减小。壳聚糖浓度为2.0%时悬浮率最大,为86.19%。壳聚糖浓度为2.5%时,溶解率最小,为5.52%。

2.4 微胶囊包埋工艺优化

为找出制备微胶囊的最佳工艺参数,本试验选择壳聚糖浓度、海藻酸钠浓度和氯化钙浓度来设计正交试验,L9(34)正交试验设计表和正交试验结果如表 3表 4所示。

表 3 L9(34)正交试验设计表 Table 3 L9(34) orthogonal test design table
表 4 正交试验结果 Table 4 Orthogonal test results

表 4可知,极差(R)的大小顺序为A>B>C,即表明壳聚糖浓度对包埋率的影响最大,海藻酸钠浓度次之,氯化钙浓度最小。通过比较每个因素k值大小,发现因素A为A3、B为B3、C为C2时,所对应的3个k值均为每组中最大的,所以最佳组合为A3B3C2。因为A3B3C2在9组试验之列,而且包埋率也最高,所以不需要作进一步验证。

表 5可知,将粒径大小基本相同的普通饲料和益生菌微胶囊饲料置于水中12 h后,普通饲料全部沉入水底,有25.15%发生溶解。而益生菌微胶囊饲料仍有77.96%悬浮于水中,仅有13.04%发生溶解。对比发现,益生菌微胶囊饲料具有更好的悬浮性和水稳定性。

表 5 益生菌微胶囊饲料和普通饲料理化性质比较 Table 5 Comparison of physicochemical properties of probiotic microcapsule feed and common feed
2.5 微胶囊在模拟人工胃液中耐酸特性研究

图 2可知,当处理60 min时,对照组活菌数从7.35 lg(CFU/mL)下降到4.61 lg(CFU/mL),试验组活菌数从6.53 lg(CFU/mL)下降到6.42 lg(CFU/mL)。当处理90 min时,对照组菌体全部失活,试验组活菌数仅从6.53 lg(CFU/mL)下降到6.08 lg(CFU/mL)。当处理120 min时,试验组活菌数从6.53 lg(CFU/mL)下降到5.20 lg(CFU/mL),仍然具有较大的存活率。结果表明,微胶囊化之后能明显增强益生菌在酸性环境中的存活率。

图 2 菌悬液和微胶囊在人工胃液中的活菌数变化 Fig. 2 Changes in viable count of bacterial suspension and microcapsules in artificial gastric juice
2.6 微胶囊在模拟人工肠液中崩解特性研究

图 3可知,体系中活菌数随着处理时间的延长先增大后趋于稳定。当处理120 min后,活菌数基本不变,保持在6.53 lg(CFU/mL),说明包埋的菌体在120 min时便可以全都释放出来。

图 3 微胶囊在人工肠液中的活菌数变化 Fig. 3 Changes in viable count of microcapsules in artificial intestinal fluid
3 讨论

在锐孔凝固浴法制备海藻酸钠益生菌微胶囊饲料的过程中:1)海藻酸钠浓度过低会导致形成的海藻酸钠膜太薄,容易破损,不能有效地包裹益生菌和气体,所以包埋率和悬浮率都较低。当海藻酸钠浓度过高时,不仅会使反应体系比较黏稠,菌悬液分散不均匀,而且形成的海藻酸钠膜太厚,使得乙酸与碳酸氢钠不能充分反应,产生的气体较少,因此包埋率和悬浮率反而降低。2)随着菌胶比例的增大,形成的海藻酸钠膜逐渐变厚,可有效地包裹气体,所以悬浮率逐渐增大。3)随着参与反应的氯化钙逐渐增多,形成的海藻酸钠膜变厚,可以更有效地包裹益生菌和气体,因此包埋率和悬浮率逐渐增大。但当海藻酸钠结合位点达到饱和之后,残留的钙离子(Ca2+)会与体系中的碳酸氢钠反应生成不溶性钙盐,导致溶液密度增加,使得形成的海藻酸钠膜出现破损,此时包埋率反而变小;而且,氯化钙浓度过高还会导致海藻酸钠与Ca2+迅速反应形成致密的海藻酸钠膜结构,不利于氢离子(H+)进入微胶囊内部,导致产生的气体减少,因此悬浮率降低。4)随着固化时间的延长,海藻酸钠与Ca2+、H+与碳酸氢钠之间可充分反应,能够形成稳定的海藻酸钠膜结构,产生更多的气体,所以悬浮率逐渐增大。

在复凝聚法制备海藻酸钠-壳聚糖益生菌微胶囊饲料的过程中,随着壳聚糖浓度的增大,壳聚糖与海藻酸钠之间作用增强,形成的壳聚糖膜变厚,可以有效地包裹益生菌和气体,所以包埋率和悬浮率逐渐增大。但当壳聚糖浓度过高时,它与海藻酸钠之间的作用力太强,形成的壳聚糖膜会将微胶囊内部的气体挤出,出现破损,因此包埋率和悬浮率反而减小。

4 结论

锐孔凝固浴法和复凝聚法复合法制备嗜酸乳杆菌-双歧杆菌复合菌微胶囊饲料的最佳制备工艺条件为:海藻酸钠浓度为1.25%,菌胶比例为1 : 10,氯化钙浓度为1.5%,固化时间为15 min,壳聚糖浓度为1.5%。制备的微胶囊粒径大小比较均匀,在1.60~2.00 mm,包埋率能达到96.68%,具有较好的耐酸性、肠溶性、悬浮性和水稳定性。

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