动物营养学报    2020, Vol. 32 Issue (1): 405-416    PDF    
鹅油甘油二酯的体外抑菌效果及其对葡聚糖硫酸钠诱导大鼠盲肠微生物菌群结构的影响
谢玉娥1 , 王宝维1,2 , 葛文华2 , 张名爱1,2 , 岳斌2 , 刘国栋1 , 刘亚楠1     
1. 青岛农业大学食品科学与工程学院, 青岛 266109;
2. 国家水禽产业技术体系营养与饲料功能研究室, 青岛 266109
摘要: 本试验旨在通过体外抑菌试验和大鼠体内试验,评定鹅油甘油二酯(GDG)的体外抑菌效果及其对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导大鼠盲肠微生物菌群结构的影响。试验1(体外抑菌试验):选取大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌4种细菌,采用打孔法评定GDG抗菌活性,紫外分光光度计法测定GDG的抑菌率和4种细菌的生长曲线,并利用扫描电子显微镜观察GDG对4种细菌形态的影响。试验2(大鼠体内试验):选用84只7周龄雄性SD大鼠,随机分为6组,每组7个重复,每个重复2只。正常对照组自由饮用蒸馏水;其余5组均进行DSS诱导,分为DSS模型组、GDG低剂量组、GDG中剂量组、GDG高剂量组和恩诺沙星(ENR)组。各组大鼠自由采食,正常对照组饮用蒸馏水;试验第1~7天,除正常对照组外,其他5组均饮用5% DSS水溶液;试验第8~14天,DSS模型组大鼠用灌胃针给予10 mL/kg BW蒸馏水灌胃处理,3个GDG组分别用灌胃针给予1、2和3 g/kg BW GDG灌胃处理,ENR组用灌胃针给予10 mL/kg BW ENR(5 μg/mL)灌胃处理。试验结束后,采用16S rRNA高通量测序技术对大鼠盲肠微生物菌群组成进行测定分析。结果表明:1)不同浓度的GDG对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生长有显著抑制作用(P < 0.05),且最小抑菌浓度(MIC)分别为0.030、0.040、0.050和0.050 g/mL。2)扫描电子显微镜图像分析显示,GDG能够改变细菌细胞表面形态,通过破坏细菌细胞整体结构来抑制细菌生长繁殖。3)GDG能增加大鼠盲肠微生物的物种丰富度,优化盲肠微生物的菌群结构,具有调整肠道微生态失调的作用。由此可见,GDG对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌均具有显著抑菌作用,并有助于DSS诱导大鼠的盲肠菌群结构趋于恢复正常。
关键词: 甘油二酯    抗菌    DSS    大鼠    盲肠菌群结构    
Antibacterial Effects of Goose Oil Diglyceride in Vitro and Its Effects on Cecal Microflora Structure by Dextran Sulfate Sodium Induced Rats
XIE Yu'e1 , WANG Baowei1,2 , GE Wenhua2 , ZHANG Ming'ai1,2 , YUE Bin2 , LIU Guodong1 , LIU Ya'nan1     
1. Food Science and Engineering of Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China;
2. National Waterfowl Industrial Technology System Nutrition and Feed Function Laboratory, Qingdao 266109, China
Abstract: The aim of this study was to evaluate the bacteriostatic effects of goose oil diglyceride (GDG) in vitro and its effects on cecal microflora structure by dextran sulfate sodium (DSS) induced rats through bacteriostasis test in vitro and in vivo test in rats. Test 1 (bacteriostasis test in vitro):four kinds of bacteria of Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis were selected, the antibacterial activity of GDG was tested by perforating method, the antibacterial rate and growth curve of four kinds of bacteria were measured by ultraviolet spectrophotometer, and the morphological changes of GDG on four kinds of bacteria were observed by scanning electron microscope. Test 2 (in vivo test in rats):eighty-four 7-week-old male SD rats were randomly divided into 6 groups with 7 replicates per group and 2 rats perreplicate. Rats in the normal control group were free drank distilled water; the other 5 groups were drank 5% DSS aqueous solution, and they were divided into DSS model group, GDG low dose group, GDG medium dose group, GDG high dose group and enrofloxacin (ENR) group. Rats in each group were ad libitum and rats in the control group were free drank distilled water; during days 1 to 7 of the experiment, all the other 5 groups drank 5% DSS aqueous solution except the normal control group; during days 8 to 14 of the experiment, rats in DSS model group were given 10 mL/kg BW distilled water by gavage, rats in 3 GDG groups were given 1, 2 and 3 g/kg BW GDG by gavage, respectively, and rats in ENR group were given 10 mL/kg BW ENR (5 μg/mL) by gavage. After the end of the experiment, 16S rRNA high-throughput sequencing technology was used to determine the composition of cecal microflora of rats. The results showed as follows:1) different concentrations of GDG had significant inhibitory effects on growth of Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis (P < 0.05), and the minimum inhibitory concentration (MIC) were 0.030, 0.040, 0.050 and 0.050 g/mL, respectively. 2) Scanning electron microscope image analysis showed that GDG could change the surface morphology of bacteria, destroy the overall structure of bacterial cells to inhibit the growth and reproduction of bacteria. 3) GDG could increase the species richness of cecal microflora in rats, optimized the flora structure of caecal microflora, and played a role in regulating intestinal microecological imbalance. It is concluded that GDG has significant antibacterial effects on Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis, and helpe DSS induce the structure of cecum flora in rats to return to normal.
Key words: diglyceride    antibacterial    DSS    rats    caecal flora structure    

大肠杆菌存在于人体大肠中,经常导致严重的腹泻甚至败血症;一旦它侵入人体组织或器官就会引起感染,如腹膜炎、胆囊炎和膀胱炎[1]。沙门氏菌是食物中毒中最常见的致病菌,在我国占食物中毒的第1位,且经常导致以肠炎沙门氏菌引起的食物中毒[2]。葡萄球菌是一种最常见的致病菌,可引起感染性痤疮,是皮肤的主要问题之一[3-5]。溃疡性结肠炎(UC)是消化系统常见的疾病,其发病率在逐渐升高[6],但人们对其可能引起的并发症了解的并不是很多,因此在疾病早期积极治疗并预防非常的重要[7]。甘油二酯(diglyceride,DG)是一种天然脂质,已通过美国食品药品监督管理局认证为“公认的安全(GRAS)”食品成分,特别是作为食品乳化剂[8]。饮食中甘油二酯的摄入已被发现具有降低人体内脏脂肪、减少体重增加和血脂的作用[9-10]。此外,初步研究表明,甘油二酯有抑菌性,可影响细菌细胞完整性致使其破裂死亡[11]。郭夏丽等[12]研究表明,樟树籽油甘油二酯对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和单增李斯特菌具有较强的抑菌性。Kabara等[13]研究发现,含有12个碳原子的甘油二酯对于革兰氏阳性(G+)细菌的抑菌活性较强。Okayasu等[14]于1990年成功建立了葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的UC小鼠模型,在诸多研究UC的动物模型中,DSS以其造模方法简便、症状表现与人体近似等诸多优势脱颖而出。

目前,国内外对甘油二酯的抑菌功能的研究还刚刚起步,仅有植物油制备甘油二酯在体外抑菌功能的较少报道,而利用鹅油制备的鹅油甘油二酯(goose oil diglyceride,GDG)在体外抑菌功能的研究还处于空白。深入开展甘油二酯在体外的抑菌功能及其对DSS诱导大鼠盲肠菌群结构的影响研究,对开发甘油二酯新产品具有重要意义。因此,本研究通过体外抑菌试验评定GDG对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的体外抑菌效果,并通过大鼠体内试验研究GDG对DSS诱导大鼠的盲肠菌群结构的影响,旨在评价GDG的抑菌功能,为GDG产品的深度开发提供技术支撑。

1 材料与方法 1.1 体外抑菌试验 1.1.1 试验材料

GDG由青岛农业大学国家水禽产业技术体系营养与饲料研究室自行制备,纯度≥92.57%,其余部分为甘油三酯、游离脂肪酸、单甘酯等;大豆油、恩诺沙星(enrofloxacin,ENR)、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌由青岛农业大学国家水禽产业技术体系营养与饲料研究室提供;表皮葡萄球菌(CICC 10294)购自中国微生物物种保护中心。

主要仪器包括紫外可见分光光度计(南京肯凡电子科技有限公司)、QUANTA200扫描电子显微镜(美国FEI公司)、溅射仪(JFC-1600,日本电子光学试验室有限公司)等。

1.1.2 试验设计与方法 1.1.2.1 GDG抗菌活性的测定

用平板打孔法[15]测定GDG对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的体外抗菌活性。4种细菌于(36±1) ℃条件下,在Luria-Bertani(LB)肉汤培养基中活化24 h。分别吸取浓度均为1×108 CFU/mL的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的悬浮液20 μL放于无菌平板中,倒入40 ℃的LB营养琼脂,使其快速与菌液混合均匀。在凝固好的LB琼脂培养基表面用打孔器均匀的打7个孔(直径7 mm)。将GDG用甲醇溶剂稀释至50、100、200和1 000 mg/mL,分别吸取40 μL该稀释样品和100% GDG样品滴入平板上的抑菌孔。以甲醇为空白对照,大豆油(40 μL)为阴性对照,ENR(5 μg/mL)为阳性对照。将接种后的平板放在(36±1) ℃的恒温培养箱中培养24 h。用游标卡尺测量抑菌圈直径。试验重复3次。

1.1.2.2 抑菌率测定

使用分光光度法测定大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)[16]。选取菌液浓度均为1×108 CFU/mL的4种细菌为试验对象,每种细菌选取7个无菌试管,向第1试管中加入LB营养肉汤作为空白,其余试管加入相同体积的LB营养肉汤和GDG混合溶液,该混合溶液中GDG的浓度分别为0.005、0.010、0.020、0.030、0.040和0.050 g/mL。将菌液浓度为1×108 CFU/mL的细菌悬液按0.1%的接种量加入试管中,在(36±1) ℃下培养24 h,每1 h振荡摇匀1次。使用紫外分光光度计在600 nm波长下测定菌悬液的吸光度(OD)值,试验重复3次。抑菌率计算公式如下:

式中:A样品为加入样品溶液后的OD值;A空白为空白对照液的OD值。

在此基础上,确定被测样品(GDG、ENR)的MIC,抑菌率大于99%的确定为MIC。

1.1.2.3 生长曲线测定

在含GDG的LB肉汤培养基中测定每种细菌的生长曲线[17-18]。将100 μL浓度为1×108 CFU/mL的细菌悬浮液加入含GDG的LB肉汤培养基(100 mL)的250 mL锥形瓶中,最终GDG浓度分别为0、0.005、0.010、0.020、0.030、0.040和0.050 g/mL,并在(36±1) ℃、转速120 r/min的恒温震荡培养箱中培养24 h。每隔2 h吸取菌悬液2 mL放到比色皿中,用无菌LB肉汤作为参比溶液,用紫外分光光度计在600 nm波长下测定并记录OD值。用测得的OD值制作细菌的生长曲线[19]。试验重复3次。

1.1.2.4 扫描电子显微镜分析

用扫描电子显微镜观察GDG、ENR和大豆油对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌形态的影响。分别取上述试验组与对照组的菌悬液各2 mL于离心管中,4 000 r/min下离心5 min收集菌体。用4%戊二醛溶液固定菌体细胞4 h,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤残留的戊二醛,用50%、70%、90%、100%的乙醇溶液分别脱水15 min。将脱水后的菌体涂布于干净的铜台上,自然风干后,用溅射仪对菌体进行表面镀金,将样品放入电镜室后,对样品室进行放气,抽到高真空1.0×10-3 Pa后,扫描电子显微镜观察菌体表面形态[20]

1.2 大鼠体外试验(GDG对DSS诱导大鼠盲肠菌群结构的影响) 1.2.1 试验设计

选取购自青岛药检所的84只7周龄、体重140~150 g的SD雄性大鼠,适应性饲养5 d。将大鼠随机分为6组,每组7个重复,每个重复2只。各组大鼠均饲喂相同饲粮,大鼠饲粮购自中国南通特罗菲饲料科技有限公司。各组大鼠自由饮水、采食。在第1~7天,正常对照组(Ⅰ组)自由饮用蒸馏水,其他各组大鼠均自由饮用5% DSS水溶液[21]。造模结束后,正常对照组和DSS模型组(Ⅱ组)各抽取7只大鼠,禁食12 h,取血清及各器官,并检测生长性能指标和血清生化指标,验证模型建立是否成功。在第8~14天,全部组均自由饮用蒸馏水,同时按照体重(BW)用灌胃针灌胃相应GDG样品,GDG样品的剂量以体积确定,DSS模型组大鼠每日灌胃10 mL/kg BW蒸馏水,GDG低剂量组(Ⅲ组)、GDG中剂量组(Ⅳ组)、GDG高剂量组(Ⅴ组)分别每日灌胃1、2和3 g/kg BW GDG,ENR组(Ⅵ组)每日灌胃10 mL/kg BW ENR (5 μg/mL)。试验设计如表 1所示。

表 1 试验设计 Table 1 Experimental design
1.2.3 盲肠菌群结构测定

盲肠样品的采集:在试验期第14天,各组随机抽取5只大鼠,处死后立即打开腹腔,无菌操作取出盲肠,迅速收集盲肠内容物到冻存管中液氮保存,然后转移到-80 ℃冰箱保存待测。

PCR扩增和测序:微生物DNA提取,使用美国Mobio土壤微生物DNA强力提取试剂盒提取出盲肠细菌总DNA。总DNA含量用DNA定量仪进行测定,DNA纯度用OD260/OD280进行表述,同时用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段大小。扩增引物:按照细菌16S rRNA(V3+V4)区域合成引物,上游引物,5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′;下游引物,5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。微生物多样性建库:目标区域PCR及纯化,Solexa PCR,定量,混样,切胶回收。样品检测时PCR程序如下:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,共25个循环。

1.3 数据统计分析

试验数据用SPSS 17.0软件对7种体外处理和6种大鼠盲肠样品处理的各项检测指标用方差分析(ANOVA)和LSD法进行差异显著性分析,DSS模型组和正常对照组组间差异采用Student-t检验分析。试验数据用平均值表示,P>0.05为差异不显著,P < 0.05为差异显著,P < 0.01为差异极显著。将优化序列进行聚类,划分操作分类单位(OTU),基于OTU分析结果,对样品在各个分类水平上进行分类学分析,获得各样品在门、纲、属分类学水平上的菌群结构等。

2 结果与分析 2.1 GDG对4种致病菌的抗菌活性影响

表 2图 1可知,与甲醇(空白对照)相比,大豆油无抗菌活性(P>0.05);不同浓度的GDG对大肠杆菌、沙门氏菌、表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径差异显著(P < 0.05),且呈现剂量效应;但不同浓度的GDG未达到ENR对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抑菌圈直径,且差异显著(P < 0.05)。以上结果表明,GDG对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌具有较好抑菌效果。

表 2 GDG对4种致病菌的抑菌圈直径 Table 2 Inhibition zone diameter of GDG against four pathogenic bacteria (n=3) 
A:大肠杆菌Escherichia coli;B:沙门氏菌Salmonella;C:金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus;D:表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis;Soybean oil:大豆油;Methanol:甲醇;GDG:鹅油甘油二酯goose oil diglyceride;ENR:恩诺沙星enrofloxacin。 图 1 GDG对4种致病菌的抗菌活性影响 Fig. 1 Effects of GDG on antibacterial activity of four pathogenic bacteria
2.2 GDG对4种致病菌抑菌率的影响

表 3可知,不同浓度的GDG对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌抑菌率的影响不同,大肠杆菌的MIC为0.030 g/mL,沙门氏菌的MIC为0.040 g/mL,金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的MIC均为0.050 g/mL。以上结果表明,0.030~0.050 g/mL GDG对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌具有较好的抑菌效果。

表 3 不同浓度GDG对4种致病菌抑菌率的影响 Table 3 Effects of different concentrations of GDG on bacteriostatic rate of four pathogenic bacteria (n=3)
2.3 GDG对4种致病菌生长曲线的影响

图 2可知,大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌种在不同GDG浓度的生长曲线不同。GDG浓度为0.030 g/mL时,大肠杆菌的生长受到明显抑制;GDG浓度分别为0.040、0.005和0.050 g/mL时,可完全抑制沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生长。以上结果表明,GDG对4种致病菌的抗菌活性呈剂量效应。

图 2 不同浓度的GDG对4种致病菌生长曲线的影响 Fig. 2 Effects of different concentrations of GDG on growth curves of four pathogenic bacteria
2.4 GDG对4种致病菌形态的影响

图 3可知,未经处理的细菌细胞(图 3-A)和大豆油处理的细菌细胞(图 3-B)显示了典型的大肠杆菌形态,具有完整性的短棒状形状,边缘整齐。GDG和ENR处理明显破坏了细菌细胞的表面结构和形态(图 3-C图 3-D);处理后的细菌细胞形态缩小,细胞完整性丧失。以上结果表明,GDG对大肠杆菌整体形态结构有损伤作用。

A:空白对照组blank control group;B:大豆油组soybean oil group;C:GDG组GDG group;D:ENR组ENR group。下图同The same as below。 图 3 大豆油、GDG和ENR对大肠杆菌形态的影响 Fig. 3 Effects of soybean oil, GDG and ENR on morphology of Escherichia coli (15 000×)

图 4可知,未经处理的细菌细胞(图 4-A)和大豆油处理的细菌细胞(图 4-B)表现出典型的沙门氏菌形态,长杆状,形态完整,质地光滑。相反,GDG和ENR处理明显破坏了细菌细胞和形状的表面结构(图 4-C图 4-D):处理后的细菌细胞形态平坦,细胞完整性丧失。以上结果表明,GDG对沙门氏菌整体形态结构有损伤作用。

图 4 大豆油、GDG和ENR对沙门氏菌形态的影响 Fig. 4 Effects of soybean oil, GDG and ENR on morphology of Salmonella (15 000×)

图 5可知,未经处理的细菌细胞(图 5-A)和大豆油处理的细菌细胞(图 5-B)均表现出典型的金黄色葡萄球菌形态,呈球形,形态完整,质地光滑。与之相反,GDG和ENR处理明显破坏了细菌细胞的表面结构和形态(图 5-C图 5-D);处理后的细菌细胞形状缩小,细胞完整性丧失。以上结果表明,GDG对金黄色葡萄球菌整体形态结构有损伤作用。

图 5 大豆油、GDG和ENR对金黄色葡萄球菌形态的影响 Fig. 5 Effects of soybean oil, GDG and ENR on morphology of Staphylococcus aureus (15 000×)

图 6可知,未经处理的细菌细胞(图 6-A)和大豆油处理的细菌细胞(图 6-B)呈现典型的表皮葡萄球菌形态,圆柱形,形态完整,纹理光滑;与之相反,GDG和ENR处理明显破坏了细菌细胞的表面结构和形态(图 6-C图 6-D);处理后的细菌细胞形状缩小,细胞完整性丧失。以上结果表明,GDG对表皮葡萄球菌整体形态结构有损伤作用。

图 6 大豆油、GDG和ENR对表皮葡萄球菌形态的影响 Fig. 6 Effects of soybean oil, GDG and ENR on morphology of Staphylococcus epidermis (15 000×)
2.5 DSS诱导大鼠UC模型的建立

表 4可知,Ⅰ组和Ⅱ组初始体重差异不显著(P>0.05);饲喂DSS后,与Ⅰ组相比,Ⅱ组终末体重极显著降低(P<0.01),结肠长度显著降低(P<0.05),血清D-乳酸含量显著升高(P<0.05),血清分泌性免疫球蛋白A(slgA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量均极显著升高(P<0.01)。以上结果表明,DSS诱导UC模型建立成功。

表 4 DSS对大鼠造模的影响 Table 4 Effects of DSS on molding of rats (n=7)
2.6 GDG对DSS诱导大鼠盲肠菌群α多样性结果分析

表 5可知,Ⅰ组的OTU、Ace指数、Chao1指数最高,显著高于其他各组(P < 0.05),表明Ⅰ组盲肠微生物的物种丰度高于其他各组。Ⅱ组的OTU、Ace指数、Chao1指数最低,显著低于其他各组(P < 0.05),表明Ⅱ组盲肠微生物的物种丰度低于其他各组。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组的OTU、Ace指数和Chao1指数介于Ⅰ、Ⅱ组之间,物种丰富度由大到小依次为Ⅵ组>Ⅴ组>Ⅳ组>Ⅲ组。各组的Simpson指数和Shannon指数差异无显着差异(P>0.05)。以上结果表明,DSS的干预能减少大鼠盲肠微生物菌群的物种丰富度,灌胃ENR或GDG可一定程度上增加大鼠盲肠微生物的物种丰富度,优化盲肠微生物的菌群结构。

表 5 α多样性指数 Table 5 α diversity indices (n=5)
2.7 GDG对DSS诱导大鼠盲肠菌群相似性结果分析

基于β多样性分析得到的4种距离矩阵,使用R语言工具分别绘制主坐标分析(PCoA)图,由图 7可知,Ⅰ组和Ⅵ组距离最近,其次与Ⅰ组由近到远依次为Ⅴ组<Ⅳ组<Ⅲ组<Ⅱ组,说明Ⅰ组与Ⅵ组盲肠菌群组成相似性最高,Ⅰ组与Ⅱ组盲肠菌群组成相似性最低。以上结果表明,ENR或GDG能够有助于DSS诱导大鼠的盲肠菌群结构趋于恢复正常。

D1:Ⅰ组group Ⅰ;D2:Ⅱ组group Ⅱ;D3:Ⅲ组group Ⅲ;D4:Ⅳ组group Ⅳ;D5:Ⅴ组group Ⅴ;D6:Ⅵ组group Ⅵ。 图 7 PCoA图 Fig. 7 PCoA chart (n=5)
2.8 GDG对大鼠盲肠门、纲和属水平上的菌群结构优势分析

表 6可知,与Ⅰ组相对比,Ⅱ组厚壁菌门数量显著减少(P < 0.05),拟杆菌门和变形菌门数量显著升高(P < 0.05),表现为肠道菌群失调。DSS诱导的大鼠灌胃GDG或ENR后,厚壁菌门数量增加,拟杆菌门和变形杆菌数量减少,且呈剂量依赖性,表明GDG或ENR均能一定程度上优化了UC大鼠肠道微生物菌群结构,且ENR的作用强于GDG。

表 6 大鼠盲肠微生物菌群门水平结构变化 Table 6 Structural changes of cecal microflora of rats on phylum level (n=5) 

表 7可知,在Ⅰ组中,梭状芽孢杆菌纲占主导地位,其次是拟杆菌纲,而δ-变形菌纲仅占2%左右。与Ⅰ组相比,Ⅱ组的梭状芽孢杆菌纲数量显著减少(P < 0.05),而拟杆菌纲和δ-变形菌纲数量显著升高(P < 0.05)。DSS诱导的大鼠灌胃GDG或ENR后,拟杆菌纲和δ-变形菌纲数量减少,梭状芽孢杆菌纲数量增加。Ⅴ组的Negativicutes数量显著高于比其他各组(P < 0.05)。以上结果表明,GDG或ENR均能一定程度上优化UC大鼠的肠道微生物形态,3 g/kg BW GDG可修复肠道的微生物平衡。

表 7 大鼠盲肠微生物菌群纲水平结构变化 Table 7 Structural changes of cecal microflora of rats on class level (n=5)  

表 8可知,与Ⅰ组相比,Ⅱ组粪杆菌真核菌群属、普雷沃菌-9属和脱硫弧菌属数量显著增加(P < 0.05),肠道菌群失调。DSS诱导的大鼠灌胃GDG后,普雷沃菌-9属和脱硫弧菌属数量减少,且呈剂量依赖性。Ⅴ组的毛螺菌科NK4A136属数量显著高于其他各组(P < 0.05)。以上结果表明,GDG或ENR均能一定程度上优化UC大鼠肠道微生物菌群结构,3 g/kg BW GDG可修复肠道的微生物平衡。

表 8 大鼠盲肠微生物菌群属水平结构变化 Table 8 Structural changes of cecal microflora of rats on genus level (n=5)  
3 讨论 3.1 GDG体外对致病菌的抑制作用

本试验发现,GDG对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生长有抑制作用,其作用与剂量有关,说明GDG具有抑菌作用。同时也有研究表明从樟脑籽油中提取的甘油二酯对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用也呈剂量依赖性[22]。周星[23]研究表明,中碳链脂肪酸聚甘油酯抑菌机理是通过使指示菌膜的通透性不同程度的增加,同时蛋白质和核酸类物质均有不同程度的泄漏。Desbois等[24]研究发现,脂肪酸的主要抑菌作用位点位于细菌的细胞膜,通过破坏细胞膜上的电子传递系统和氧化磷酸化达到抑菌效果。Bergsson等[11]研究发现,用单癸酸甘油酯作用后的幽门杆菌和用单月桂酸甘油酯作用后的白色念球菌,细菌的细胞膜毁坏,认为甘油酯的作用位点为细胞膜。本试验中使用的GDG中含有92.57%的甘油二酯,通过电子显微镜图像分析表明,GDG的抑菌作用可能是因为破坏细胞膜结构,从而抑制细菌生长或杀死细菌。

在抑菌活性方面,GDG对G+菌(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌)和革兰氏阴性(G-)菌(大肠杆菌、沙门氏菌)均有抑制作用,对G-菌的抑制作用大于对G+菌的抑制作用,这可能与GDG提取物的pH有关。郝盼龙[25]研究发现,在酸应激条件下,乳酸菌球菌的细胞壁厚壁会逐渐减小。宋飞[26]在单月桂酸甘油酯在冷鲜肉保鲜中的应用研究中发现,在中性条件下(pH 7.2),单月桂酸甘油酯对G+菌具有很强的抑制效果,对G-菌抑制效果较差,但降低培养基的pH(pH 5.7)可提高单月桂酸甘油酯的抑菌活性,对G-菌可起到较好的抑制作用。本研究中GDG的pH为5.69,G-菌具有细胞壁成分,在弱酸性条件下可能使细菌细胞壁厚度减小,这有可能导致GDG对G-菌的抑菌效果更好些。

3.2 GDG对DSS诱导大鼠的盲肠菌群结构影响

本试验结果表明,DSS诱导UC大鼠模型建立成功;GDG优化了人工造模UC大鼠盲肠内的微生物种群数量,增加了厚壁菌门的数量,而拟杆菌和变形菌门的数量减少。张超[27]研究表明,在用DSS处理的小鼠粪便中,厚壁菌门菌数量减少,拟杆菌门菌数量增加;黄林生等[28]研究表明,肠炎患者的肠道菌群,厚壁菌门数量减少,变形菌门数量升高;以上试验均可证明本试验造模成功。不同菌门数量的变化会对机体造成一定的影响。厚壁菌门是一类与肥胖有关的肠道菌。Daniel等[29]研究发现,当小鼠肠道内厚壁菌门数量超过拟杆菌门,对热量的吸收会更有效,从而导致机体肥胖。也有报道肠道中厚壁菌门数量每增加20%,拟杆菌门数量每减少20%,宿主的能量摄入就增加约628 kJ[30]。因此,当GDG增加人工造模UC大鼠的盲肠内厚壁菌门数量时,大鼠体重对食物营养与热量吸收加强,这有助于肠炎的修复。同时变形菌门其中包括很多病原菌,如大肠杆菌、沙门氏菌等[31-32]。在体外试验中,GDG对大肠杆菌和沙门氏菌具有较好的抑菌性,在GDG对DSS诱导的大鼠盲肠菌群结构影响试验中,与GDG使变性菌门数量减少的结果相互吻合。同时研究发现,低剂量ENR对小鼠肠道菌群的主要影响是耐药需氧和兼性厌氧菌,也特别针对大肠杆菌有一定的抑制作用[33-34];易宏波[35]研究发现,ENR能够使由大肠杆菌感染导致的小鼠肠炎中的盲肠中乳酸杆菌数量升高和大肠杆菌数量降低,能够有效调节肠道菌群。因此,ENR能够有效调节肠道菌群平衡。总的来说,可能由于GDG的抑菌作用可以选择性地抑制大鼠盲肠大肠杆菌、沙门氏菌等变形菌的繁殖,同时使厚壁菌门数量增加,使肠道菌群趋于恢复正常。

4 结论

① GDG在体外对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌具均有一定抗菌活性,MIC分别为0.030、0.040、0.050和0.050 g/mL。

② GDG抗菌作用可能与破坏细菌形态有关。

③ DSS诱导导致大鼠盲肠菌群多样性降低,厚壁菌门数量减少,拟杆菌和变形菌门数量增加,灌喂GDG能够促使DSS诱导大鼠的盲肠微生物菌群趋于恢复正常。

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