2. 南京农业大学养猪研究所, 南京 210095;
3. 南京农业大学淮安研究院, 淮安 223005
2. Institute of Swine Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
3. Huai'an Academy of Nanjing Agricultural University, Huai'an 223005, China
随着我国养猪业集约化程度增加,环境和饲粮对猪体内自由基的形成有很大的影响。当机体产生自由基的水平超过其抗氧化体系的还原能力时,导致氧化还原状态失衡,最终诱发氧化应激。氧化应激不仅诱导磷脂的过氧化以及蛋白质和DNA损伤[1],还在动脉粥样硬化的发病机制中起着重要作用[2];而高胆固醇血症或高循环浓度的低密度脂蛋白胆固醇被认为是动脉粥样硬化的重要启动因子[3]。Lv等[4]研究显示,地塞米松诱导的氧化应激可使鸡血液中胆固醇含量增加。Jung等[5]在人上的研究表明,与年龄相关的低密度脂蛋白胆固醇的增加与氧化应激的增强有关。胆固醇作为机体重要的一部分,除了参与细胞膜形成和细胞信号转导[6],同时还是类固醇激素和胆汁酸的前体[7]。胆固醇介导的复杂功能及其参与的代谢途径需要胆固醇的输入和输出之间平衡[8]。因此,通过营养调控手段提高猪的抗氧化能力,改善机体胆固醇代谢对猪肉的品质至关重要。
脱脂米糠是用浸出法从全脂米糠中脱脂后的副产物[9],是包含膳食纤维(纤维含量约为20.9%)和其他成分在内的一种非常规饲料原料[10]。脱脂米糠营养丰富,能量价值高,能作为一种可再生能量饲料资源,且价格低于玉米。关于不同的纤维原料对猪氧化还原状态和胆固醇代谢的影响已有报道。刑恒涛等[11]研究发现,饲粮中添加4.0 g/kg的可溶性玉米纤维饲喂28日龄“杜长大”仔猪,可改善机体免疫力,提高血清和肝脏的抗氧化能力并同时降低血清总胆固醇含量。杨玉芬等[12]发现,将妊娠后期大约克夏母猪粗纤维水平从2.62%提高到5.22%,可改善血脂水平,显著降低机体的抗氧化能力。然而,赵瑶等[13]研究也表明,“杜长大”杂交生长猪摄入20%豌豆纤维原料28 d,对血清低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇含量无显著影响。由此可见,不同的纤维原料和添加水平对不同阶段、不同品种猪的氧化还原状态和胆固醇代谢影响不同。关于脱脂米糠对育肥猪,特别是耐粗饲的苏淮猪的氧化还原状态和胆固醇代谢还鲜有报道。因此,本试验旨在研究不同水平脱脂米糠部分替代饲粮中玉米对苏淮猪氧化还原状态和胆固醇代谢的影响,为我国地方猪或含地方猪血统的培育新猪种合理、高效利用米糠等非常规纤维性饲料资源提供重要理论参考。
1 材料与方法 1.1 试验设计试验用苏淮育肥猪基础饲粮配制参照《猪饲养标准》(NY/T 65—2004)60~90 kg肉脂型生长肥育猪标准。试验所用脱脂米糠由淮安正昌饲料有限公司提供。试验Ⅰ组(对照组)饲粮不添加脱脂米糠,试验Ⅱ组和试验Ⅲ组分别以14%和28%的脱脂米糠等量替代对照组中的玉米。为了科学分析不同水平脱脂米糠对苏淮猪各项性能的影响,本研究使用豆粕、麸皮和豆油等物质调平对照饲粮与试验饲粮的消化能和粗蛋白质等水平,减少组间能量、粗蛋白质和氨基酸等关键营养素的差异对各试验指标的影响。本试验各组育肥猪饲粮组成及营养水平见表 1。
选用体重[(62.90±1.12) kg]相近健康的苏淮阉公猪21头,随机分为3组,每组7个重复,每个重复1头猪。3组分别为试验Ⅰ组(对照组,玉米-豆粕型基础饲粮)、试验Ⅱ组(用14%的脱脂米糠替代基础饲粮部分玉米的饲粮)和试验Ⅲ组(用28%的脱脂米糠替代基础饲粮部分玉米的饲粮)。预试期10 d,所有猪饲喂相同的基础饲粮;正试期28 d,根据分组分别饲喂基础饲粮、14%和28%脱脂米糠替代玉米饲粮。整个试验期间,所有猪于同一环境下进行常规饲养管理,每天清扫圈舍,定时清理猪粪,定期消毒,自由通风,试验猪自由采食和饮水,观察并记录试验猪健康状况。本试验于2017年11—12月在南京农业大学淮安研究院试验猪场进行。
1.3 样品采集正试期第28天,试验猪禁食称重,电击致晕后前腔静脉采血。将血液静置30 min,3 000 r/min离心15 min,吸取上清液,制备血清样并分装,-80 ℃保存备用。猪屠宰后将肝脏取出,在相同位置迅速取4 g左右的样品,用生理盐水洗净血液,装入冻存管中,液氮速冻后放入-80 ℃保存备用。
1.4 指标测定及方法 1.4.1 血清指标测定测定血清中氧化标记物和抗氧化酶,所有指标试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,测定步骤按照试剂盒说明书进行。用HITACHI-7020全自动生化分析仪测定血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和总胆汁酸(TBA)含量,试剂盒购自迈克生物股份有限公司。
1.4.2 肝脏氧化标记物和抗氧化酶测定取保存于-80 ℃的肝脏样品,称取0.05~0.10 g,按照质量(g) :体积(mL)=1 : 9的比例加入9倍体积的生理盐水,用组织匀浆机5 000 r/min匀浆3次,每次20 s,4 ℃、3 500 r/min离心10 min,吸取上清,保存于-80 ℃,用于测定组织内酶活性。分别测定肝脏组织匀浆液中氧化标记物和抗氧化酶活性,所有指标试剂盒购于南京建成生物工程研究所,按照试剂盒说明书要求操作并完成测定。
1.4.3 肝脏TC和TG含量测定肝脏TC和TG含量用北京普利莱基因技术有限公司检测试剂盒检测,具体操作步骤参照说明书进行测定。
1.4.4 肝脏胆固醇代谢相关基因mRNA表达量测定将研磨过的肝脏组织样品从-80 ℃中取出,称取50 mg左右,按照动物组织总RNA提取试剂盒(#9108,TaKaRa)说明书提取肝脏组织总RNA。提取完后测定RNA浓度以及光密度(OD260/ OD280),反转cDNA,再用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测胆固醇代谢相关基因mRNA表达量。根据NCBI网站上的GenBank数据库,找到目标基因的mRNA序列,使用Primer premier 5.0设计引物,引物序列见表 2。
试验所得数据通过Excel 2013初步整理后,运用SPSS 24.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),用Duncan氏法进行多重比较。相关性分析使用斯皮尔曼(Spearman)相关性分析,P < 0.05为差异显著,P < 0.01为差异极显著。
2 结果 2.1 不同水平脱脂米糠部分替代玉米对苏淮猪血清氧化标记物和抗氧化酶的影响由表 3可知,与对照组(试验Ⅰ组)相比,试验Ⅱ组和试验Ⅲ组苏淮猪血清丙二醛(MDA)含量均显著降低(P < 0.05);试验Ⅱ组苏淮猪血清过氧化氢酶(CAT)活性显著高于对照组和试验Ⅲ组(P < 0.05);与对照组相比,试验Ⅲ组苏淮猪血清铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)活性显著升高(P < 0.05);各组间苏淮猪血清其他指标没有显著差异(P>0.05)。
由表 4可知,试验Ⅱ组和试验Ⅲ组苏淮猪肝脏MDA含量数值上均低于对照组,但差异不显著(P>0.05);试验Ⅲ组苏淮猪肝脏氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量显著低于对照组(P < 0.05),而肝脏还原型谷胱甘肽(GSH)含量以及还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)显著高于对照组(P < 0.05);不同水平脱脂米糠部分替代玉米对苏淮猪肝脏中其他抗氧化酶活性无显著影响(P>0.05)。
由表 5可知,各组间苏淮猪血清TG、HDL-C和TBA含量均无显著差异(P>0.05);与对照组相比,试验Ⅲ组苏淮猪血清TC和LDL-C含量显著提高(P < 0.05)。
由表 6可知,不同水平脱脂米糠部分替代玉米对苏淮猪肝脏TC和TG含量均无显著影响(P>0.05)。
由表 7可知,与对照组相比,试验Ⅱ组和试验Ⅲ组苏淮猪肝脏3-羟-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)、固醇调节原件结合蛋白-2(SREBP-2)和清道夫受体BI(SR-BI)mRNA表达量显著降低(P < 0.05);试验Ⅲ组苏淮猪肝脏低密度脂蛋白受体(LDLR)mRNA表达量显著降低(P < 0.05)。在胆固醇转化为胆汁酸过程中,不同饲粮处理对苏淮猪肝脏胆固醇-7α-羟化酶1(CYP7α1)和胆固醇-27α-羟化酶1(CYP27α1)mRNA表达量无显著影响(P>0.05)。
由表 8可知,苏淮猪血清TC含量与肝脏GSH含量和GSH/GSSG呈显著正相关(P < 0.05);血清LDL-C含量与肝脏GSH含量和GSH/GSSG呈极显著正相关(P < 0.01)。但是,苏淮猪血清TC和LDL-C含量与血清MDA含量、CAT和CuZn-SOD活性和肝脏GSSG含量无显著相关性(P>0.05)。
近年来,我国畜牧业迅速发展,导致玉米进口量大,价格不断上涨,国内供需缺口进一步扩大。脱脂米糠作为一种营养丰富的经济饲料原料,越来越多的应用于养猪生产。本次动物试验的前期研究[14]发现,3组猪初始体重、第14天体重、终末体重、平均日采食量、平均日增重、料重比、第1~14天平均日增重和第15~28天平均日增重均无显著差异。本研究通过评价不同水平脱脂米糠部分替代饲粮中玉米对育肥苏淮猪氧化还原状态和胆固醇代谢的影响,为我国地方猪或含地方猪血统的培育新猪种合理、高效利用米糠等非常规纤维性饲料资源提供重要理论参考。
动物机体存在CAT、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化防御系统的关键酶,它们参与减少生物体内活性氧和过氧化物,以及某些外源化合物的解毒作用,从而维持机体稳态[15]。大量研究表明,谷类产品中的纤维物质在预防与氧化应激和活性氧相关的慢性健康问题中起着重要作用。Li等[16]报道,用6%苎麻粉替代部分玉米、豆粕和麸皮,可提高湘村黑猪肌肉SOD mRNA表达量以及血清GSH含量,降低血清MDA含量,改善机体抗氧化状态。本试验中,与对照组相比,试验Ⅱ组和试验Ⅲ组苏淮猪血清MDA含量显著降低;试验Ⅱ组苏淮猪血清CAT活性显著高于其他2组;与对照组相比,试验Ⅲ组苏淮猪血清CuZn-SOD活性和肝脏GSH含量以及GSH/GSSG显著升高。上述结果表明,28%脱脂米糠等量替代饲粮中部分玉米,可影响苏淮猪血清和肝脏中抗氧化酶的活性。然而,郝帅帅[17]以48头苏淮母猪为研究对象,在饲粮中用34.8%的米糠替代部分玉米进行为期74 d的试验发现,米糠对日增重、屠宰性能和肉质指标等均无显著影响。宋伟[18]研究发现,高温应激使得生长猪脂类过氧化活动增强,同时肉质的适口性和营养性降低。通过热应激敏感指标与肉质的相关性分析表明,血液抗氧化能力的总体变化可以估测肉质的系水力和剪切力。因此,本试验育肥猪机体抗氧化能力的提高在一定程度上对改善猪肉品质具有积极意义。当然,除纤维类物质外,脱脂米糠中富含的一些植物化学物质,包括酚类物质[19]、多糖、植酸和肌醇[20]等成分,也能部分影响苏淮猪机体的抗氧化活性[21-22]。
为了进一步阐明机体氧化还原状态与胆固醇代谢的关系,将血清和肝脏中有显著差异的氧化还原相关指标与血清TC和LDL-C含量做相关性分析。结果表明,苏淮猪血清TC和LDL-C含量均与肝脏GSH含量及GSH/GSSG呈显著正相关,这为苏淮猪机体抗氧化状态可能与猪血液胆固醇存在直接相关性提供了直接的证据。
脱脂米糠作为一种经济的纤维原料,对胆固醇的影响目前还存在争议。吴莺等[23]通过体外试验表明,米糠中的半纤维素能够结合一定量的胆酸和胆盐,推测其具有降胆固醇作用。Newman等[24]报道,在肉鸡饲粮中用60%的脱脂米糠替代部分玉米豆粕,可显著增加血清TC、HDL-C、LDL-C和TG含量。在本文中,我们的研究发现,试验Ⅲ组苏淮猪血清TC和LDL-C含量显著高于对照组(试验Ⅰ组),而肝脏中TC含量没有显著变化,这可能是因为胆固醇的逆转运还没有发生变化。研究表明,通过提高肝脏SR-BI[25]和LDLR[26]表达可促进胆固醇逆向转运,最终降低血液胆固醇水平。本试验中不同水平脱脂米糠部分替代玉米组苏淮猪肝脏中SR-BI和LDLR的mRNA表达水平显著低于对照组,表明脱脂米糠可能通过抑制SR-BI和LDLR的表达,导致血液胆固醇清除受阻。此外,高纤维降低血液胆固醇的部分机制在于纤维与肠道中胆汁酸结合,导致胆汁酸不能被肝脏重新回收而排出体外[27]。因此,肝脏需要额外利用血液中的胆固醇转化为胆汁酸进入肠道促进食物消化。本试验中促使肝脏胆固醇转化为胆汁酸的限速酶CYP7α1和CYP27α1的mRNA表达量却没有显著变化,从侧面反映本试验的纤维并没有或很少结合胆汁酸,从而达不到降低血液胆固醇的目的。SREBP-2作为一种转录因子,能促进HMGCR表达,增加细胞内胆固醇的合成[8]。本试验中,不同水平脱脂米糠部分替代玉米组苏淮猪肝脏SREBP-2的mRNA表达量下降可能是HMGCR下降的原因,而血液胆固醇含量升高可能通过负反馈机制抑制了SREBP-2的mRNA表达。此外,为了科学分析不同水平脱脂米糠对苏淮猪各项性能的影响,本研究使用豆粕、麸皮和豆油等物质调平对照饲粮与试验饲粮的消化能和粗蛋白质等水平,减少组间能量、粗蛋白质和氨基酸等关键营养素的差异对各试验指标的影响。不可否认,油脂对脂代谢有很重要的影响。李平华等[28]研究表明,给仔猪基础饲粮添加4%的豆油,其血清TC含量增加了13.33%,这可能也是本试验中苏淮猪血清TC含量升高的另外一个因素。
脱脂米糠纤维中主要的降胆固醇纤维[29]——可溶性膳食纤维含量仅为6.16%[30],低可溶性纤维含量意味着脱脂米糠纤维将更少地影响延迟胃排空、葡萄糖吸收和血液胆固醇[31],而可溶性纤维和不溶性膳食纤维均能清除自由基,因此我们推测,脱脂米糠中极低的可溶性纤维含量在本试验条件下不会显著降低血清TC含量。此外,前人研究大多是建立病理模型,表明氧化应激会增加动脉粥样硬化等心血管疾病,而本试验研究的是健康猪群,可能也是导致氧化还原状态和胆固醇代谢不一致的原因。虽然脱脂米糠对于苏淮猪机体氧化还原状态的改善并未引起机体胆固醇水平直接降低,这可能对于育肥猪后续的抗氧化能力以及宰后猪肉品质具有积极意义。
4 结论综上所述,苏淮猪饲粮中用脱脂米糠替代部分玉米能改变苏淮猪血清和肝脏的氧化还原相关酶的活性,并在一定程度上影响机体的胆固醇代谢和肝脏胆固醇代谢相关基因的表达。
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