2. 聊城大学农学院, 山东省黑毛驴高效繁育与生态饲养工程技术研究中心, 山东省驴产业科技协同创新中心, 聊城 252059;
3. 国家胶类中药工程技术研究中心, 东阿阿胶股份有限公司, 东阿 252201
2. Shandong Engineering Technology Research Center for Efficient Breeding and Ecological Feeding of Black Donkey, Shandong Donkey Industry Technology Collaborative Innovation Center, Agricultural College, Liaocheng University, Liaocheng 252059, China;
3. National Engineering Research Center for Gelatin-Based Traditional Chinese Medicine, Dong-E-E-Jiao Co., Ltd., Donge 252201, China
对于草食动物而言，传统的精粗分饲饲喂方式难以提高干物质采食量，不能保证精粗比适宜，且对消化道微生物多样性有一定影响[1]。全混合日粮(total mixed ration，TMR)是指根据动物不同生长期营养需要，把不同营养水平的粗饲料、精饲料、各种添加剂和水分，按照一定比例充分混合得到的一种营养平衡的日粮。TMR饲喂方式是反刍动物规模化、标准化饲养的关键技术[2-3]，但目前在驴饲养中尚未见应用。TMR饲喂方式对驴规模化集约化养殖具有重要促进作用，研究表明，不同的饲喂方式可改变动物的采食量和营养物质消化率，增加经济效益[4]。肠道微生物被认为是宿主的“附加基因组”，Moeller等[5]指出某些细菌群落往往在品系之间存在差异，动物品系之间消化道的生理功能及内容物的理化特性等不同，在马[6]、鼠[7]、鹅[8]、奶牛[9]、水貂[10]等上均有消化道微生物的多样性和丰富度存在着极显著差异的报道。Zarrinpar等[11]研究表明，饲喂方式不同可改变小鼠肠道微生物组成，且肠道微生物可能参与小鼠能量代谢的调控。不同的饲喂方式会打乱动物消化道微生物动态平衡(微生物区系、菌体蛋白质合成、挥发性脂肪酸生成)，动物消化道微生物亦可帮助机体利用其不能消化的营养物质[5]。基于以上研究结果，推测不同饲喂方式可导致肠道微生物组成不同，间接影响动物的生长性能和营养物质消化率。德州驴体格高大，具有耐粗饲、饲料利用率高的特点，属于单胃草食性动物，目前对于德州驴最适宜的饲喂方式的研究国内鲜有报道。鉴于此，本试验旨在研究饲喂方式对德州驴生长性能、营养物质消化率和盲肠微生物多样性的影响，以期为实际生产中德州驴饲喂方式的选择提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验动物和分组试验用德州驴由东阿阿胶股份有限公司提供。选择2周岁±3月龄、体重(215±10) kg的健康德州公驴15头，随机分为C1组(饲喂方式为先粗后精)、C2组(饲喂方式为先精后粗)、C3组(饲喂方式为TMR)，每组5头，饲养地点为聊城市东阿县黑毛驴养殖基地。
1.2 试验饲粮以玉米、豆粕、麦麸等为主要原料制成精饲料，为了防止天气炎热导致饲料腐败，试验用精饲料分批制作。精饲料组成及营养水平见表 1。粗饲料为豆秸，其营养水平见表 2。
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表 1 精饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the concentrate (air-dry basis) |
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表 2 豆秸营养水平(风干基础) Table 2 Nutrient levels of beanstalk (air-dry basis) |
所有试验驴均采用单栏饲养，精饲料和豆秸饲喂量分别为体重的1.3%和2.0%，每天饲喂2次(07:00和17:00)。试验期间每30 d称重并调整饲喂量，C1组和C2组在饲喂粗饲料或精饲料0.5 h后再饲喂精饲料或粗饲料，C3组将粗饲料、精饲料和水按一定比例混匀制成TMR后饲喂，自由饮水。试验前对驴舍及舍内器具均彻底消毒，预试期7 d，正试期75 d。
1.4 样品采集所有试验驴于正试期第53天开始进行消化试验。采用随排随捡全收粪法，连续收集4 d粪便，消化试验期间饲养管理与日常饲养管理相同。粪便称重后按鲜重的5%加入10%硫酸溶液，保存于-20 ℃备用。消化试验结束后将4 d的粪便混合均匀后取300 g，于65 ℃烘至恒重，粉碎后过40目筛，制成风干样本，以备实验室分析。
正试期结束后，将各组试验驴屠宰并取出盲肠，在盲肠盲端取50 mL内容物于无菌无酶的冻存管中，立即投入液氮中，然后于-80 ℃保存待测。
1.5 测定指标及方法 1.5.1 生长性能于试验开始前和试验结束当天上午空腹时对所有试验驴进行称重以获得初重和末重，计算平均日增重；每隔4 d称草称料置于各自的草料桶里分4 d饲喂，每天称量剩料量，计算平均日采食量；根据平均日增重和平均日采食量计算料重比。
平均日增重(g/d)＝(末重-初重)/试验天数；
平均日采食量(g/d)＝试验期内采食量/试验天数；
料重比＝平均日采食量/平均日增重。
1.5.2 营养物质消化率测定精饲料、豆秸、粪便等样品的干物质、粗脂肪、粗蛋白质、粗纤维、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维的含量。干物质含量采用105 ℃烘干法测定，参考GB/T 6435—2006；粗脂肪含量采用索氏提取法测定，参考GB/T 6433—2006；粗蛋白质含量采用凯氏定氮法测定，参考GB/T 6432—1994；粗纤维含量采用过滤法测定，参考GB/T 6434—2006；酸性洗涤纤维含量采用过滤法测定，参考NY/T 1459—2007；中性洗涤纤维含量采用过滤法测定，参考GB/T 20806—2006。
干物质消化率(%)＝[(干物质采食量-干物质排出量)/干物质采食量]×100；
粗脂肪消化率(%)＝[(粗脂肪摄入量-粗脂肪排出量)/粗脂肪摄入量]×100；
粗蛋白质消化率(%)＝[(粗蛋白质摄入量-粗蛋白质排出量)/粗蛋白质摄入量]×100；
粗纤维消化率(%)=[(粗纤维摄入量-粗纤维排出量)/粗纤维摄入量]×100；
酸性洗涤纤维消化率(%)=[(酸性洗涤纤维摄入量-酸性洗涤纤维排出量)/酸性洗涤纤维摄入量]×100；
中性洗涤纤维消化率(%)=[(中性洗涤纤维摄入量-中性洗涤纤维排出量)/中性洗涤纤维摄入量]×100。
1.5.3 盲肠微生物多样性DNA提取、PCR扩增、高通量测序由北京诺禾致源生物信息科技有限公司协助完成。生物信息学分析通过测序公司提供的平台https://magic.novogene.com/public/customer进行分析。
1.6 数据统计与分析数据采用SAS 8.0软件中的GLM程序进行方差分析，并采用Duncan氏法进行多重比较，试验结果以平均值±标准差表示，P≤0.01为差异极显著，P≤0.05为差异显著，P＞0.05为差异不显著。
2 结果 2.1 饲喂方式对德州驴生长性能的影响由表 3可知，饲喂方式对平均日增重有极显著影响(P≤0.01)，表现为C2组极显著高于C1组和C3组(P≤0.01)。平均日采食量和料重比各组之间均差异不显著(P＞0.05)。
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表 3 饲喂方式对德州驴生长性能的影响 Table 3 Effects of feeding mode on growth performance of Dezhou donkeys |
由表 4可知，C1组干物质和酸性洗涤纤维消化率显著高于C2组和C3组，且与C2组的差异达到显著水平(P≤0.05)；粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维和中性洗涤纤维消化率各组之间无显著差异(P＞0.05)。
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表 4 饲喂方式对德州驴营养物质消化率的影响 Table 4 Effects of feeding mode on nutrient digestibility of Dezhou donkeys |
所有试验样品共得到有效序列1 118 523条，平均每个样品含(79 894±4 991)条。将所得有效序列在不同分类水平上进行物种注释，共得到3 130个OTU，属于24个门、34个纲、65个目、124个科、253个属。OTU韦恩图(图 1)显示，各组间共有OTU数为1 545个，各组的OTU表现出较高的丰富度和多样性；C1组、C2组、C3组独有OTU数分别为217、190、363个；C1组与C2组、C3组共有OTU数分别是166、207个，C2组和C3组共有OTU数为126个。
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C1：C1组C1 group；C2：C2组C2 group；C3：C3组C3 group。图 4和图 5同The same as Fig. 4 and Fig. 5。 图 1 OTU韦恩图 Fig. 1 Venn diagram of OTU |
由表 5可知，饲喂方式显著影响盲肠微生物Ace指数和Observed species指数(P≤0.05)，均以C2组最低，显著低于C1组和C3组(P≤0.05)，其他α-多样性指数各组之间差异不显著(P>0.05)。
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表 5 饲喂方式对德州驴盲肠微生物α-多样性指数的影响 Table 5 Effects of feeding mode on α-diversity indexes of microbes in cecum of Dezhou donkeys |
将各组所得有效序列在门和属水平进行聚类并注释后，列出相对丰度在前10位的菌门，见图 2；未鉴定出种属的相对丰度>75%，聚类为其他，在属水平上相对丰度排在前10位的物种见图 3。
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图 2 门水平上德州驴盲肠微生物物种相对丰度(前10位) Fig. 2 Relative abundances of microbes in cecum of Dezhou donkeys at phylum level (top 10) |
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图 3 属水平上德州驴盲肠微生物物种相对丰度(前10位) Fig. 3 Relative abundances of microbes in cecum of Dezhou donkeys at genus level (top 10) |
由图 2可以看出，在门水平上，各组盲肠微生物中均以厚壁菌门和拟杆菌门为主(二者占比>75%)，且C2组厚壁菌门相对丰度(52.6%)高于C1组(40.7%)和C3组(43.1%)。各组盲肠微生物中排名前10的菌门相对丰度高低均依次为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、螺旋体菌门(Spirochaetes)、变形菌门(Proteobacteria)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、未知细菌(unidentified-bacteria)、黑水仙菌门(Melainabacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、柔壁菌门(Tenericutes)和脱铁杆菌门(Deferribacteres)。
由图 3可知，各组均以相对丰度小于1%的其他菌属为优势菌属(总占比>75%)。随后，C1组以螺旋体科未定义属(unidentified-Spirochaetaceae)和厌氧孤菌属(Anaerovirbrio)为主；C2组以厌氧孤菌属、链球菌属(Streptococcus)和螺旋体科未定义属为主；C3组则以乳酸杆菌属(Lactobacillus)和螺旋体科未定义属为主。在属水平上，各组盲肠菌属相对丰度存在较大差异，说明不同饲喂方式对盲肠微生物群落结构有影响。
2.3.4 微生物群落差异分析图 4为各组德州驴盲肠微生物群落差异分析，线性判断分析(LDA)值分布柱状图展示了各组在丰度上有显著差异的物种，柱状图的长度代表显著差异物种影响的大小。LDA值超过2.0时，差异OUT C1组有7个，C2组有9个，C3组有6个；LDA值超过3.0时，只有C1组有4个差异OTU，其他2组没有差异OTU。
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图 4 差异OTU分布图 Fig. 4 Distribution diagram of difference OTU |
由图 5可知，C1组与C3组盲肠微生物聚为一类，具有微生物种群相似性，C2组盲肠微生物与其他2组的差别较大，在C2组中厚壁菌门的占比最大(>50%)。此外，通过主成分分析(图 6)可知，各组盲肠微生物群落可以明显分开。
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图 5 基于weighted_unifrac距离的UPGMAA聚类树 Fig. 5 UPGMAA clustering tree based on weighted_unifrac distance |
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图 6 盲肠微生物主成分分析 Fig. 6 Principal component analysis of cecal microbes |
饲喂方式改变会影响动物采食习惯和营养物质代谢，进而影响机体蛋白质和脂肪的沉积[12]。本试验发现，先精后粗饲喂方式较先粗后精和TMR可获得更佳的生长性能，而先粗后精组的干物质和酸性洗涤纤维消化率高于先精后粗组和TMR组。鲍坤等[13]研究发现，采用TMR的饲喂方式可以提高梅花鹿的日增重和营养物质利用率，改善瘤胃环境。此外，研究表明，饲喂TMR可提高试验动物的采食量[14]，维持胃肠道健康[15]，有利于粗饲料中纤维素的分解，提高营养物质消化率[16]。与本试验结果与以上研究所得结果不尽一致，其原因：一方面可能是由于奶牛、梅花鹿均属于反刍动物，饲喂TMR有利于瘤胃环境的稳定而促进发酵，而驴属于后消化道发酵动物，其生理结构与其他动物显著不同；另一方面可能是由于饲喂方式导致动物体内激素分泌变化，影响体内脂肪沉积和蛋白质的分解代谢。
影响肠道微生物多样性的因素有很多，如年龄、性别、饮食、消化道部位、品种、饲粮组成、健康状况以及环境中微生物间的群体效应等[17]。目前对消化道微生物多样性的研究主要集中在瘤胃、盲肠内容物和粪便样品上，Liu等[18]和赵文静等[7]均发现粪便微生物不能完全代表动物宿主肠道微生物的真实情况，加之驴在1周岁后其后肠消化道发酵系统就已经基本完善[19]，因此本试验选用2周岁左右的德州驴盲肠内容物进行微生物多样性研究。微生物菌群在不同消化道部位的差异主要归结于消化道的生理功能。前消化道部位主要负责食物的消化吸收，而后消化道尤其是盲肠与微生物发酵有关[20]。肠道微生物与宿主经过长期的发展过程，形成一种互惠共生的关系。研究发现，饲喂方式会显著影响小鼠肠道微生物的组成[21]。研究发现不同饲料转化率的动物基于β-多样性的肠道微生物结构差异性不同，即不同料重比的肉鸡其基于β-多样性的肠道微生物结构没有显著差异[22]，而不同料重比的猪基于β-多样性的肠道微生物结构存在显著差异[23-24]。上述研究表明，微生物的β-多样性差异虽与饲料转化率有关，但在一定程度上取决于物种。本研究发现，先精后粗组的平均日增重极显著高于先粗后精组和TMR组，饲喂方式对料重比没有显著影响，但以先精后粗组料重比最低，可能与先精后粗组盲肠厚壁菌门相对丰度高，而拟杆菌门相对丰度低有关。较高的厚壁菌门丰度与较低的拟杆菌门丰度被认为与肥胖有关，但也尚未明确。最近有研究表明，饲粮纤维摄入与猪肠道菌群中普氏菌属(Prevotella)丰度呈正相关[25-26]，可促进宿主摄取糖分，表现出较好的生长性能，这一发现与本试验所得结果不同，主要原因可能是由于动物种类和试验饲粮纤维含量不同所致。本研究从β-多样性和物种差异分析发现，3种不同饲喂方式德州驴的盲肠微生物结构有明显不同，饲喂方式可以改变盲肠微生物组成，且先精后粗组盲肠微生物组成与其他2组差别较大，先粗后精组和TMR组聚为一类，推测德州驴生长性能与盲肠微生物变化之间存在相关性，但是两者间的因果关系还需要进一步验证。
4 结论① 饲喂方式极显著影响德州驴的平均日增重，德州驴采用先精后粗的饲喂方式可较采用先粗后精和TMR的饲喂方式获得更佳的生长性能。
② 德州驴采用先粗后精饲喂方式时干物质和酸性洗涤纤维消化率显著高于采用其他2种饲喂方式时。
③ 饲喂方式改变了德州驴的盲肠微生物组成，采用先精后粗饲喂方式时盲肠微生物组成与采用其他2种饲喂方式时差别较大。
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