厌氧真菌是反刍动物和非反刍草食动物消化道内一类重要的降解植物细胞壁的功能菌,其产生的多种水解酶,包括纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、漆酶和纤维小体等,在纤维降解过程中起着非常重要的作用,具有很强的植物组织降解能力。厌氧真菌可特化出氢化酶体和纤维小体结构,提高厌氧环境下自身的能量供应;也能特化出厚的细胞壁或孢子样结构增加对不良环境的适应[1]。反刍动物在出生时瘤胃内并没有微生物的定植,通过接触环境和牧草,微生物才开始在瘤胃中出现,然后繁殖扩增。田可等[2]认为早期饲粮是引起早期瘤胃微生物区系变化的重要干扰因素。宋慧东等[3]研究发现饲粮精粗比显著影响瘤胃真菌产纤维素酶的活性。本研究基于内转录间隔区(ITS)rDNA测序技术,分析不同饲养方式对滩羊羔羊瘤胃真菌组成及多样性的影响,为幼龄反刍动物瘤胃微生物构建提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计选择体重接近、健康的刚出生放牧滩羊与舍饲滩羊羔羊各12只,放牧组羔羊随放牧哺乳母羊哺乳饲养,可自由采食草场牧草,草场主要牧草比例为:沙打旺(Astragalus adsurgens)40%、达乌里胡枝子(Lespedeza davurica)20%、苦豆子(Sophora alopecuroides)5%、柠条(Caragana korshinskii)10%、甘草(Glycyrrhizae radix)10%、芨芨草(Achnatherum splendens)10%;舍饲组随舍饲哺乳母羊哺乳饲养,7日龄自由采食开食料,开食料组成及营养水平见表 1。
放牧组与舍饲组滩羊各随机选取5只,在2月龄时屠宰采集瘤胃液,4层纱布过滤,取50 mL瘤胃液于离心管中,放置于-80 ℃冰箱中冻存,用于菌群结构分析,共有10个样品,其中放牧组5个(G2-1、G2-2、G2-3、G2-4、G2-5),舍饲组5个(R2-1、R2-2、R2-3、R2-4、R2-5)。
1.3 Hiseq测序瘤胃样品提取基因组DNA以后,用带有barcode的特异引物扩增ITS rDNA的ITS2区。引物序列为KYO2F:GATGAAGAACGYAGYRAA;ITS4R:TCCTCCGCTTATTGATATGC。
然后PCR扩增产物切胶回收,用QuantiFluorTM荧光计进行定量。将纯化的扩增产物进行等量混合,连接测序接头,构建测序文库,Hiseq2500 PE250上机测序。
1.4 数据统计分析数据采用Excel 2016进行初步处理,然后采用SAS 8.2统计软件中的随机区组设计进行组间差异显著性比较。P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。
2 结果与分析 2.1 操作分类单元(OTU)比较分析为了研究2组滩羊瘤胃液内物种的组成多样性,使用Uparse软件对2组瘤胃液样品中的全部Effective Tags序列进行聚类,以具有97%的一致性(identity)将序列聚类成为1个OTU。所有瘤胃液样本OTU结果如表 1所示。试验又选取了平均相对丰度大于1的所有OTU(即高丰度并集OTU)进行韦恩图分析,可以了解到2组间OTU的分布信息。由图 1可知,放牧组滩羊瘤胃真菌OTU数量为398个,舍饲组为349个。其中放牧组与舍饲组滩羊共有的瘤胃真菌OTU数量为226个。从表 2可以看出,放牧组滩羊瘤胃真菌OTU数量与舍饲组相比没有显著差异(P>0.05),说明2组滩羊瘤胃液真菌菌群多样性差异不显著。
微生物物种分类一般分为界、门、纲、目、科、属、种7个等级,而每个OTU代表某类型分类水平集合。根据OTU的序列信息进行物种注释,选取相对丰度大于1%的部分物种分类单元,利用perl+SVG软件,做出分组的物种分类树的展示图。由图 2可知,几乎全部的新丽鞭毛菌门(Neocallimastigomycota)都存在于放牧组滩羊瘤胃液中,绝大多数的子囊菌门(Ascomycota)存在于舍饲组滩羊瘤胃液中。
Shannon指数可以评价瘤胃液中物种多样性程度,Shannon指数值越高代表多样性程度越大。试验通过抽取样本中n个tags来计算Shannon指数的期望值,然后根据1组n值(一般为1组小于总序列数的等差数列)与其相对应的Shannon的期望值绘制Shannon稀释曲线,当曲线趋于平缓时就可以认为测序量趋于饱和,继续测序已经不影响其物种多样性。由图 3可知,随着测序深度的增加,曲线趋于平缓,表明当前测序深度已经基本覆盖到样品中的所有物种,足够进行样品菌群多样性分析。
alpha多样性是指特定生境或者生态系统内的物种多样性情况,它可以指示生境被物种隔离的程度,alpha多样性通常利用Chao1和ACE指数来表示样品物种丰富度信息(种类情况),利用Simpson和Shannon指数来表示物种的均匀度(分布情况)。从表 3可以看出,样品覆盖率均达到99%以上,说明样品采集足以反映2组滩羊瘤胃菌群情况。放牧组滩羊瘤胃真菌菌群的ACE和Chao1指数均大于舍饲组,但差异不显著(P>0.05),说明放牧饲养的滩羊瘤胃真菌菌群丰富度与舍饲滩羊相比没有显著差异;放牧组滩羊瘤胃真菌菌群的Shannon和Simpson指数均大于舍饲组,且差异极显著(P < 0.01),说明放牧滩羊瘤胃中真菌多样性极显著高于舍饲滩羊。
UniFrac距离是用于比较生物群落的距离度量,利用各样品序列间的进化信息来比较样品在特定的进化谱系中是否有显著的微生物群落差异。UniFrac包括Weighted UniFrac(加权UniFrac,定量)和Unweighted UniFrac(未加权,定性),广泛用于微生物生态学。Weighted UniFrac不仅考虑生物群落的存在与否,还要考虑其丰度,而Uweighted UniFrac仅考虑它们的存在或不存在,不考虑丰度。
Unifrac计量的是来自2个不同环境的样品之间的差异,差异用0~1距离值来表示,差异越大,距离越长,距离为1时说明2个群落是完全独立的2个进化过程;差异越小,距离越短,距离为0时说明2个群落没有各自独立的进化过程。利用R语言的Pheatmap包,以热图形式展示组间Unweighted和Weighted Unifrac指数。由图 4可知,舍饲组组内样品距离值在0.4~0.6,说明组内菌群比较差异不大。放牧组组内对照距离值在0.5~0.6,说明放牧组组内的菌群均一性优于舍饲组。2组物种有无情况,放牧组与舍饲组比较距离值均在0.5以上,表明放牧组滩羊瘤胃真菌菌群与舍饲组的多样性差异较大。从图 5可以看出,经过丰度加权之后,舍饲组组内样本距离值在0.4~0.6,说明组内菌群比较差异并没有什么变化。放牧组除G2-1样本外,样本距离值在0~0.2,说明放牧组组内的菌群差异进一步缩小。组间距离值在0.8~0.9,表明放牧组滩羊瘤胃真菌菌群的丰富度与多样性与舍饲组滩羊相比差异更显著。
PCoA是一种展示样本间相似性的分析方式,它的分析思路是通过降维方式寻找复杂样本中的主要样本差异距离。基于样本间的Weighted和Unweighted Unifrac数据结果,绘制PCoA图形。分析结果中,样品越相似,反映在PCoA图中的距离越近,而且不同环境间的样品往往可能表现出各自聚集的分布情况。由图 6和图 7可知,放牧组及舍饲组组内样品间距离较短,差异较小;而放牧组和舍饲组组间样本距离较远,差异较大,表现出2组各自聚集的分布情况。图 7较图 6来看,各组内样本间距离更近,分布更加聚集,也说明了放牧组和舍饲组滩羊瘤胃真菌菌群的丰富度和多样性组内差异都较小。组间样本距离更远,说明2组滩羊瘤胃真菌菌群的丰富度和多样性组间差异都较大。
在微生物生态研究当中,UPGMA分类树可以用于研究样本间的相似性,解答样本的分类学问题。利用Mothur软件,可以将样本进行UPGMA分类树分类。其中越相似的样本将拥有越短的共同分支。由图 8可知,在门水平上,舍饲组滩羊瘤胃内优势菌门为子囊菌门,其相对丰度明显高于放牧组滩羊;放牧组滩羊瘤胃内优势菌门为新丽鞭毛菌门,新丽鞭毛菌门和担子菌门(Basidiomycota)的相对丰度明显高于舍饲组滩羊。由图 9可知,在属水平上,舍饲组滩羊瘤胃内优势菌属为Kazachstania,其相对丰度明显高于放牧组滩羊;放牧组滩羊瘤胃内优势菌属为Kazachstania、梨囊鞭菌属(Piromyces)和盲肠鞭菌属(Caecomyces),其中梨囊鞭菌属和梨囊鞭菌属的相对丰度高于舍饲组滩羊。
由表 4可知,滩羊瘤胃液中共涉及6个真菌门,其中放牧组鉴定出5个菌门,舍饲组鉴定出6个菌门,包括子囊菌门、新丽鞭毛菌门、被孢霉门(Mortierellomycota)、毛霉门(Mucoromycota)、担子菌门和其他真菌门(Fungi_NA)。子囊菌门和新丽鞭毛菌门占到总菌群比例的95%以上,其中,放牧组的新丽鞭毛菌门的相对丰度均极显著高于舍饲组(P<0.01);舍饲组的子囊菌门的相对丰度极显著高于放牧组(P<0.01)。
本试验滩羊瘤胃液真菌群总共涉及69个属,其中放牧组鉴定出55个菌属,舍饲组鉴定出56个菌属。表 5中只显示了相对丰度较高的25个菌属,占各样品总菌属的99%以上。其中7个菌属的相对丰度较高,放牧组中相对丰度较高的有Kazachstania、梨囊鞭菌属、盲肠鞭菌属、新丽鞭菌属(Neocallimastix)、NA、未分类新丽鞭菌科(Neocallimastigaceae_NA)、节担菌属(Wallemia);舍饲组中相对丰度较高的有Kazachstania、梨囊鞭菌属、NA、链格孢属(Alternaria)、赤霉菌属(Gibberella)。其中舍饲组的Kazachstania、赤霉菌属、酵母属(Saccharomyces)的相对丰度均极显著高于放牧组(P<0.01),香蘑属(Lepista)的相对丰度显著高于放牧组(P<0.05)。而放牧组梨囊鞭菌属、盲肠鞭菌属、新丽鞭菌属、未分类新丽鞭菌科(Neocallimastigaceae_NA)、Chalastospora等的相对丰度均极显著高于舍饲组(P<0.01);未分类毕赤酵母科(Pichiaceae_NA)的相对丰度显著高于舍饲组(P<0.05)。
瘤胃对于反刍动物来说相当于饲料加工厂,饲料中50%粗纤维和70%~85%的可消化物是在瘤胃内消化的,这种消化作用都是依赖于复杂多样的瘤胃微生物区系。刚出生的反刍动物瘤胃内是没有微生物的定植的,在出生24 h后,随着动物与环境的接触,兼性厌氧细菌才在其瘤胃壁上定植,出生后2 d瘤胃内才出现严格厌氧微生物。1975年,Orpin首次从绵羊瘤胃内容物中分离出瘤胃厌氧真菌,至今40多年间国内外学者陆续证明了厌氧真菌具有降解植物细胞壁的功能,对反刍动物消化植物细胞壁起到很重要的作用[4-5]。本试验研究表明,滩羊羔羊2月龄时,放牧组滩羊瘤胃内真菌菌群的Shannon和Simpson指数均极显著高于舍饲组滩羊,说明放牧滩羊瘤胃中真菌多样性极显著高于舍饲滩羊。且在放牧组滩羊瘤胃中,子囊相门和新丽鞭毛菌门为优势菌群,新丽鞭毛菌门的相对丰度极显著的高于舍饲组滩羊。而在舍饲组滩羊瘤胃中,子囊相门的相对丰度达到了94%以上,2组之间差异极显著。这说明不同的饲养方式会影响滩羊羔羊瘤胃内真菌菌群的结构以及多样性。
以前人们一直以为瘤胃内能够消化和利用纤维素的只有细菌和部分原虫,Akin等[6]证实瘤胃内有厌氧真菌的存在时,人们才认识到厌氧真菌降解纤维素的能力。反刍动物能够消化木质纤维含量高的植物茎秆类饲料并吸收其中的营养成分靠的是瘤胃内各种细菌、真菌和原虫所分泌的多种降解纤维素、半纤维素和木质素的酶。其中厌氧真菌的作用是通过假根穿过植物细胞壁进入植物维管组织内,穿透植物表皮角质层屏障,削弱木质化组织的抗性,使得植物性饲料内部更容易接触到瘤胃微生物产生的降解酶[7]。厌氧真菌分泌的半纤维素酶主要为木聚糖酶,有研究表明,厌氧真菌所分泌的植物细胞壁降解酶活性要高于里氏木霉和曲霉,尤其梨囊鞭菌属真菌的木聚糖酶活性是木霉和曲霉的3倍以上[8]。本试验结果显示,放牧组滩羊瘤胃液中梨囊鞭菌属真菌的相对丰度极显著高于舍饲组,说明放牧可以提高滩羊瘤胃中梨囊鞭菌属真菌的含量,这可能是因为放牧组滩羊瘤胃中需要分泌更多的木聚糖酶来降解半纤维素。酵母纲(Saccharomycetes)作为子囊菌门中的重要成员,其培养物是一种安全环保的饲料添加剂,已经受到生产者和学者的重视,并在家畜养殖中得到了广泛应用和研究[9]。酵母菌是兼性厌氧型真菌,具有庞大的家族系统,种类达1 000多种。在动物生产中,常用的酵母菌种是酿酒酵母[10]。孔义川[11]研究发现,在基础饲粮中添加精料量1%的酿酒酵母可以提高犊牛生长性能,降低瘤胃pH,提高羧甲基纤维素酶活性,改善瘤胃发酵。寇慧娟[12]在羔羊上也有研究,饲粮添加20 g/kg酵母培养物显著提高了羔羊瘤胃内羧甲基纤维酶活性,可以促进羔羊瘤胃发育,有利于维持瘤胃乳头的正常形态,在高精料饲粮中效果更显著。本研究结果显示,舍饲条件下滩羊羔羊瘤胃中酿酒酵母的含量高于放牧组羔羊,这与上述研究结果一致,说明舍饲喂养方式下,精料较多,会促进酿酒酵母在2月龄滩羊瘤胃内的定植。本研究还发现Kazachstania在2组滩羊瘤胃液中的相对丰度也有极显著差异,但对Kazachstania的报道很少,值得进一步研究。
4 结论① 放牧方式下2月龄滩羊瘤胃优势真菌菌门为子囊菌门和新丽鞭毛菌门,舍饲方式下优势菌门为子囊菌门。
② 放牧方式下2月龄滩羊瘤胃优势菌属为Kazachstania和梨囊鞭菌属,舍饲方式下优势菌属为Kazachstania。
③ 饲养方式对2月龄滩羊瘤胃真菌菌群结构的构建有显著影响。
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