蜂王浆(royal jelly)是由蜂群中哺育蜂咽下腺和上颚腺分泌的供给蜂王终身和3日龄以内蜜蜂幼虫食用的乳白色或淡黄色浆状物质[1-2]，是蜂群繁育的必要物质，也是一种重要的蜂产品。蜂王浆组分相当复杂，随着蜜蜂品种、哺育蜂年龄、季节、花粉植物的不同，其化学成分也有所不同[3]。一般来说，蜂王浆的水分含量在60%~70%、粗蛋白质含量在12%~15%、糖类含量在10%~16%、脂类含量在3%~6%、低分子质量物质(维生素、盐类、游离氨基酸等)含量在2%~3%[4]。其中，蛋白质是蜂王浆中的主要成分，约占蜂王浆干物质的50%[5]。蜂王浆中约有150多种蛋白质[6]，分为水溶性蛋白和水不溶性蛋白，其中水溶性蛋白占蛋白质总量的46%~89%，是蜂王浆中蛋白质的主要组成，故称为蜂王浆主蛋白(major royal jelly proteins，MRJPs)家族[7-8]。MRJPs家族是一个比较大的蛋白质家族，其成员分子质量均在49~87 ku，氨基酸序列同源性在47%~74%[9]。目前，一共发现了10个MRJPs家族成员，分别为MRJP1、MRJP2、MRJP3、MRJP4、MRJP5、MRJP6、MRJP7、MRJP8、MRJP9和MRJP-ψ。Drapeau等[10]预测MRJP-ψ是一个编码不完整多肽的假基因，但并未发现其转录本。目前研究发现MRJPs具有多重生物学功能，MRJP1~MRJP9在蜂王浆的蛋白质中都能被检测到，其中MRJP1~MRJP5占到MRJPs的90%，暗示MRJP1~MRJP5在蜂王浆中主要发挥营养功能[9]；另外，MRJP1可以促进蜜蜂幼虫转变为蜂王，MRJP3可以优化蜂王幼虫的生长，两者在级型分化中起作用[11]；MRJP2和MRJP7与工蜂卵巢发育有关[12]；mrjp4(基因符号用蛋白质符号的小写斜体表示，后文同)在工蜂和蜂王中都有表达，但仅在蜂王幼虫期进行表达[13]，由于该蛋白的必需氨基酸含量较低，研究者认为MRJP4在蜜蜂体内除营养功能外还可能发挥着其他功能[8]；MRJP5富含甲硫氨酸，是富含硫元素的重要蛋白；mrjp6在采集蜂中表达量高于哺育蜂，与神经发育相关[14]；也有研究发现mrjp5和mrjp6都是在采集蜂中的表达量高于哺育蜂[15]，进化分析MRJP5和MRJP6处于同一分支[10]，推测MRJP5除了作为主要营养物质外，在西方蜜蜂(Apis mellifera)中还发挥其他功能，可能与MRJP6的功能相近，与西方蜜蜂神经发育相关；mrjp8和mrjp9在蜜蜂毒腺中表达，与蜂毒引起的过敏反应有关[16]。虽然MRJPs家族成员间同源性较高，但MRJPs家族中各个成员的含量和作用不尽相同，在进化过程中出现了一定的遗传分化和功能分歧，甚至同一成员因在不同组织中表达而所起功能不同[17]。另外，MRJPs对其他动物机体具有重要的医疗保健作用，主要表现为高效的抗菌活性、较强的免疫活性和促进特殊细胞增殖等[18]。
蜂花粉(bee pollen)是蜜蜂从显花植物花蕊内采集的花粉粒加入花蜜和唾液混合而成了一种不规则扁圆形状物。蜂花粉含有200多种营养成分[19]，富含蛋白质、氨基酸、维生素、微量元素、活性酶、酚类和黄酮类化合物、脂类、核酸等，几乎包含自然界全部营养成分[20]。花粉是蜜蜂生存最重要的蛋白质资源[21]，蜜蜂从花粉中得到蛋白质等生长、发育所需要的各种营养物质[22]。同时，花粉可以增强蜜蜂抗性，维持蜂群健康[23]。哺育1只蜜蜂从卵的孵化到羽化需氮3.21 mg，相当于花粉145 mg[24]。花粉可以刺激工蜂咽下腺的发育和王浆蛋白的合成，充足的营养食物条件，特别是高蛋白质食物供应是工蜂咽下腺发育和王浆分泌的必要前提[25]。哺育蜂从花粉中汲取的蛋白质通过咽下腺分泌王浆，为蜂王和幼虫提供生命所需的营养物质[26]。缺乏花粉会出现蜜蜂幼虫发育不良、成年蜂生长受阻、泌浆能力降低等情况，而蜂王产卵能力也会受到影响而下降[27]。不同植物花粉对于蜜蜂具有不同营养价值，主要取决于花粉中蜜蜂所需必需氨基酸的含量[28]。鬼针草为一年生草本植物，在云南分布较广，常年开花，每年9—11月份为盛花期，花粉量最多。油菜、土连翘分别为云南大宗、特色蜜粉源植物。本试验通过饲喂西方蜜蜂油菜花粉和土连翘蜂花粉，研究不同蜂花粉粗蛋白质和氨基酸含量对mrjps表达的影响，分析影响西方蜜蜂王浆产量因素，探索蛋白质营养对蜂王浆合成与分泌的作用，以期为养蜂生产提供参考。蜂花粉不只为蜜蜂生命活动提供蛋白质，还为蜜蜂提供脂类、维生素、矿物质等营养元素，蜂花粉对于蜜蜂生命活动具有至关重要的作用，本研究结果还可为补充蜜蜂营养学研究以及蜜蜂人工饲料配制提供一些参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料本试验采用的蜜蜂品种为西方蜜蜂亚种意大利蜜蜂(A. m. ligustica)，由国家蜂产业体系红河综合试验站西方蜜蜂示范场提供。所用花粉为油菜花粉(产地：云南罗平，2017年4月产)、土连翘花粉(产地：云南泸西，2017年6月产)，将花粉自然晾干，密封，-20 ℃保存。
1.2 试验设计本研究在开展后续相关试验前对多种花粉的粗蛋白质含量进行了检测调查，选取了粗蛋白质含量具有一定梯度(粗蛋白质含量相差5%左右为1个梯度)的油菜花粉、土连翘花粉和鬼针草花粉作为饲喂蜂群的蜂花粉。由于本试验的对照组为自然采粉，所以选择外源蜜粉源植物主要为鬼针草的季节开展试验，外界花粉源充足，可以满足对照组蜂群的花粉量需求。选取蜂王(约3个月蜂龄，产卵能力强)、群势(卵、幼虫、蛹及成蜂等基本一致，每群8个巢脾，其中卵约1脾、幼虫约1脾、封盖子脾约2脾、成蜂爬满8个巢脾约有1.6万只)基本一致的意大利蜜蜂9群，把每群中的花粉脾取出，保留1张蜜脾，从其他蜂群调入子脾至群势相当，然后随机分为3组，每组3群蜜蜂：油菜花粉组，饲喂油菜花粉；土连翘花粉组，饲喂土连翘花粉；对照组，不饲喂花粉，自然采粉。饲喂花粉的油菜花粉组和土连翘花粉组安装脱粉器，对照组不安装脱粉器，自然采粉。试验周期为2个月，试验时间为2017年9月中旬至11月中旬。饲喂时，将花粉粉碎，过20目筛，每群称取200 g，加入适量糖水(糖:水=1 : 1)揉成花粉团，以不粘手为宜，搓成条状均匀摆放到巢脾横梁上让蜜蜂采食，每3 d饲喂1次，每次饲喂前清理掉上次饲喂剩余花粉。试验期间保证提供每组蜂群充足糖量，定期饲喂糖水(糖:水=1 : 1)，每个蜂群至少有1张蜜脾余量。饲喂30 d后标记刚出房工蜂，选取标记后9日龄工蜂，取头部进行mrjp1~mrjp9和黄体基因e3(yellow-e3)相对表达量的检测；工蜂取样同期进行蜂王浆生产，检测蜂王浆产量、质量，并对蜂王浆中水溶性蛋白和氨基酸组成与含量进行检测；检测不同蜂花粉粗蛋白质含量及氨基酸组成与含量。
1.3 蜂花粉粗蛋白质含量及氨基酸组成与含量测定 1.3.1 蜂花粉粗蛋白质含量测定参照GB 5009.5—2016，取0.4 g样品使用全自动凯氏定氮仪(Hanon K9860，济南)检测样品中粗蛋白质含量(氮换算为粗蛋白质的系数为6.25)。
1.3.2 蜂花粉氨基酸组成与含量测定参照GB 5009.124—2016，称取0.07 g样品于水解瓶中，加入6 mol/L的盐酸10 mL，通入氮气2 min后封口，置110 ℃水解24 h。水解完成后定容于50 mL容量瓶中，取出2 mL用氮吹仪于60 ℃下吹干，加入1.5 mL的样品稀释液，用氨基酸全自动分析仪(Membrapure A300，德国)检测样品氨基酸组成与含量。
1.4 西方蜜蜂mrjp1~mrjp9和yellow-e3相对表达量的检测 1.4.1 引物设计从NCBI数据库下载西方蜜蜂mrjp1~mrjp9、yellow-e3和β-肌动蛋白(β-actin，内参基因)的基因序列。利用Primer Premier 5.0软件设计定量引物(表 1)，引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。
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表 1 本研究所用引物 Table 1 Primers used in this study |
每组分别取3只蜜蜂头部放入研钵，加入液氮充分研磨，依照试剂说明书利用Trizol试剂(Invitrogen，美国)提取每组蜜蜂总RNA。利用超微量分光光度计(Implen N50，德国)测定RNA的浓度，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。采用PrimeScriptTM RT Master Mix试剂盒(TaKaRa，日本)，以0.5 μg总RNA为模板反转合成cDNA。
1.4.3 目的基因相对表达量测定以β-actin基因为内参基因检测mrjp1~mrjp9和yellow-e3的相对表达量。定量PCR反应体系为20 μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，Rox 0.4 μL(TaKaRa，日本)，RNase-free水4.4 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.6 μL，cDNA模板2 μL。定量PCR反应条件：95 ℃，5 min；95 ℃，15 s，60 ℃，60 s，40个循环。以2-△△Ct法计算mrjp1~mrjp9和yellow-e3的相对表达量。
1.5 蜂王浆产量、质量、水溶性蛋白及氨基酸组成与含量 1.5.1 蜂王浆产量检测移取孵化后约24 h工蜂幼虫至人工王台，每群72个王台，移虫72 h后钳虫取浆，用电子天平秤量每群所取蜂王浆重量，每组3群所产王浆量求和，再计算每组蜂群蜂王浆产量平均值。
1.5.2 蜂王浆质量检测参照蜂王浆国家标准(GB 9697—2008)中的检测方法分别检测蜂王浆的水分、10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)和粗蛋白质含量及酸度。
1.5.3 蜂王浆中水溶性蛋白及氨基酸组成与含量检测称取3种蜂王浆各1 g分别至15 mL离心管，加入8 mL 0.5 mol/L pH 8.0的NaCl溶液，混匀，4 ℃、250 r/min摇床抽提8 h后，4 ℃、12 000×g离心30 min，取上清即为MRJPs溶液。将MRJPs溶液稀释50倍，按TaKaRa BCA Protein Assay Kit试剂盒(TaKaRa，日本)说明书进行蛋质白浓度测定，每样取10 μL进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，检测水溶性蛋白组成与含量；参照1.3.2中方法检测蜂王浆的氨基酸组成与含量。
1.6 数据处理与分析本试验所有检测指标每组均是3个重复数据，结果用平均值±标准差表示。试验数据采用SPSS 17.0软件进行分析，差异显著性分析采用one-way ANOVA程序进行，组间多重比较采用LSD法进行，P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 3种蜂花粉粗蛋白质和总氨基酸含量由表 2可知，3种蜂花粉的粗蛋白质和总氨基酸含量均表现为油菜花粉>土连翘花粉>鬼针草花粉，且各蜂花粉间差异显著(P < 0.05)。
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表 2 3种蜂花粉粗蛋白质和总氨基酸含量 Table 2 Crude protein and total amino acid contents of three kinds of bee pollens |
参照GB 5009.124—2016对油菜花粉、土连翘花粉和鬼针草花粉的氨基酸组成与含量进行测定，发现3种蜂花粉均由20种氨基酸组成。由于本研究采用水解法测定氨基酸含量，其中天冬酰胺水解变成了天冬氨酸、谷氨酰胺水解变成了谷氨酸、色氨酸完全水解，因此共测出了17种氨基酸的含量(表 3)。3种蜂花粉中17种氨基酸的单一含量除组氨酸外全部为油菜花粉>土连翘花粉>鬼针草花粉，除脯氨酸在土连翘和鬼针草花粉中的含量差异不显著(P>0.05)外，其他氨基酸含量各蜂花粉间差异显著(P < 0.05)。3种蜂花粉中组氨酸含量为鬼针草花粉>油菜花粉>土连翘花粉，各蜂花粉间差异显著(P < 0.05)。
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表 3 3种蜂花粉氨基酸组成及含量 Table 3 Amino acid composition and contents of three kinds of bee pollens |
蜂王浆由哺育蜂咽下腺和上颚腺分泌，一般西方蜜蜂工蜂在出房第9天前后王浆蛋白表量达到最高峰，因此本试验对出房第9天工蜂头部mrjp1~mrjp9和yellow-e3的相对表达量进行检测。结果显示，mrjp1、mrjp2、mrjp3、mrjp4、mrjp5和mrjp7在工蜂头部相对高表达(图 1-A~E、G)，mrjp6、mrjp8、mrjp9和yellow-e3相对低表达(图 1-F、H、I、J)。与对照组相比，饲喂油菜花粉和土连翘花粉显著提高了mrjp1、mrjp2、mrjp3、mrjp4、mrjp5、mrjp7和yellow-e3的相对表达量(P < 0.05)，且油菜花粉组上述基因的相对表达量显著高于土连翘花粉组(P < 0.05)；饲喂油菜花粉和土连翘花粉显著降低了mrjp6、mrjp8、mrjp9的相对表达量(P < 0.05)。根据mrjp1~mrjp9的相对表达量数据，油菜花粉组、土连翘花粉组和对照组mrjp1、mrjp2、mrjp3、mrjp4、mrjp5和mrjp7的相对表达量之和分别占mrjps总相对表达量的99.94%、99.94%和98.60%。
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数据柱标注不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)，相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。 Value columns with different small letters mean significant difference (P < 0.05), and with the same small letters mean no significant difference (P>0.05). 图 1 不同蜂花粉对西方蜜蜂mrjp1~mrjp9和yellow-e3表达的影响 Fig. 1 Effects of different bee pollens on expression of mrjp1 to mrjp9 and yellow-e3 of Apis mellifera |
3组蜂王浆产量如表 4所示，其中油菜花粉组蜂王浆产量最高，其次为土连翘花粉组，对照组最低，各组之间差异显著(P < 0.05)。如表 5所示，饲喂油菜花粉和土连翘花粉与自然采粉所产蜂王浆在水分、10-HDA、粗蛋白质含量和酸度方面都存在一定差异。对3种蜂王浆理化数据进行两两比较：水分含量，油菜花粉组显著低于土连翘花粉组(P < 0.05)，其他组间差异不显著(P>0.05)；粗蛋白质含量，油菜花粉组显著高于土连翘花粉组(P < 0.05)，其他组间差异不显著(P>0.05)；酸度，油菜花粉组显著高于土连翘花粉组(P < 0.05)，其他组间差异不显著(P>0.05)；10-HDA含量，各组间差异不显著(P>0.05)。
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表 4 不同蜂花粉对蜂王浆产量的影响 Table 4 Effects of different bee pollens on royal jelly yield |
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表 5 不同蜂花粉对蜂王浆质量的影响 Table 5 Effects of different bee pollens on royal jelly quality |
按照BCA试剂盒说明书，建立牛血清白蛋白(BSA)标准曲线(图 2)，根据回归方程式：y=0.005 6x+0.034 3(R2=0.994 6，y为吸光度，x为水溶性蛋白含量)，将3组蜂王浆提取液吸光度代入方程式，计算3组蜂王浆中水溶性蛋白含量，每样取10 μL进行SDS-PAGE。蜂王浆水溶性蛋白含量测定结果显示3组蜂王浆水溶性蛋白含量基本一致，各组之间不存在显著差异(P>0.05，表 6)；3组蜂王浆水溶性蛋白SDS-PAGE在谱带数目、带的分布与强弱等方面基本一致，表明2个试验组和对照组所产蜂王浆具有相似的水溶性蛋白组成(图 3)。采用水解法对3种蜂王浆氨基酸组成及含量进行了检测，3种蜂王浆中含有17种氨基酸，且含量基本一致，除赖氨酸外不存在显著差异(P>0.05，表 7)，说明不同花粉饲喂蜂群所产蜂王浆氨基酸组成基本无差异。
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图 2 蜂王浆中水溶性蛋白含量测定标准曲线 Fig. 2 Standard curve for water-soluble proteins content determination of royal jelly |
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表 6 不同蜂花粉对蜂王浆中水溶性蛋白含量的影响 Table 6 Effects of different bee pollens on water-soluble proteins content in royal jelly |
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M：蛋白质标准分子量Protein molecular weight marker；1：对照组Control group；2：土连翘花粉组Hymenodictyon flaccidum pollen group; 3：油菜花粉组Brassica napus pollen group。 图 3 3种蜂王浆水溶性蛋白SDS-PAGE图 Fig. 3 SDS-PAGE map of water-soluble proteins of three kinds of royal jelly |
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表 7 3种蜂王浆氨基酸组成及含量 Table 7 Amino acid composition and contents of three kinds of royal jelly |
蜂花粉主要为蜜蜂提供蛋白质，自然条件下，蜂花粉是西方蜜蜂唯一蛋白质来源，不同蜂花粉粗蛋白质含量不同，从8%~40%不等[29]。不同蜂花粉对于蜜蜂具有不同营养价值，这主要取决于花粉中蜜蜂所需必需氨基酸的含量[28]。蜜蜂生长发育和生命活动必需氨基酸须由外源食物供给，蜜蜂对蛋白质的需求其实就是对氨基酸的需求[24]。本研究中，油菜花粉粗蛋白质含量为27.21%、土连翘花粉为20.54%、鬼针草花粉为15.29%，且3种蜂花粉单一氨基酸(组氨酸除外)含量全部为油菜花粉>土连翘花粉>鬼针草花粉。通过饲喂西方蜜蜂油菜花粉、土连翘花粉来研究不同粗蛋白质含量的蜂花粉对mrjps表达的影响，与西方蜜蜂自然采集花粉(试验季节主要蜜粉源植物为鬼针草)相比，饲喂粗蛋白质含量相对高的油菜花粉和土连翘花粉可以显著提高mrjp1、mrjp2、mrjp3、mrjp4、mrjp5和mrjp7在西方蜜蜂哺育蜂头部的相对表达量，且提高程度全部为油菜花粉>土连翘花粉；同时显著降低mrjp6、mrjp8和mrjp9的相对表达量，降低程度没有一定规律性。这一结果可能与MRJPs在蜂王浆中的含量和功能相关，MRJPs是蜂王浆中最主要的蛋白质成分[7-8]，在蜂王浆中主要发挥营养功能[4]，而蜂王浆的相关生理功能均与其所含有的MRJPs有关[30]，饲粮中的蛋白质可以刺激西方蜜蜂咽下腺发育和蜂王浆分泌[9]，我们推测高粗蛋白质含量的蜂花粉更能刺激咽下腺中具有营养功能的mrjps的表达。MRJP1、MRJP2、MRJP3、MRJP4 MRJP5和MRJP7在蜂王浆中主要发挥营养功能[9, 31]，因而粗蛋白质含量较高的油菜花粉和土连翘花粉更能提高mrjp1、mrjp2、mrjp3、mrjp4、mrjp5和mrjp7的相对表达量，并且3种蜂花粉中粗蛋白质含量越高对上述基因相对表达量的提高程度越高。MRJP6与其他MRJPs不同，没有富氮重复区域[17]，可能不发挥主要或不具备营养功能，并且mrjp6在采集蜂中的相对表达量高于哺育蜂[32]，可能与神经发育相关[14]。饲喂油菜花粉和土连翘花粉降低了mrjp6的相对表达量，推测饲喂油菜花粉和土连翘花粉延缓哺育蜂向采集蜂转变，使神经发育成熟变缓，从而降低了mrjp6的表达。MRJP8和MRJP9同样都缺乏后期进化出的富氮重复区域，这些重复区域被认为是蜂王浆主要的营养价值所在，因而认为MRJP8和MRJP9不具备营养功能[33]，MRJP8和MRJP9在王浆中含量极少，在王浆中的功能尚不清楚，但MRJP8和MRJP9在蜜蜂毒腺可以检测到[34]，可能参与蜂毒对异体引发的过敏反应。蜜蜂守卫蜂介于哺育蜂和采集蜂之间[35]，蜂蛰作为蜜蜂一种防御行为说明守卫蜂毒腺较哺育蜂更发达，推测mrjp8和mrjp9在哺育蜂中的表达量要低于守卫蜂。蜜蜂蜂群中工蜂存在一种日龄多型性(age-dependent roles)现象，分工情况的改变伴随着咽下腺分泌功能的变化。饲喂高粗蛋白质含量蜂花粉延长了哺育蜂分泌活动周期，推迟了哺育蜂向守卫蜂转变时间，饲喂菜花粉和土连翘花粉的9日龄工蜂还属于哺育蜂，而对照组9日龄工蜂可能已转变为守卫蜂，导致试验组的mrjp8和mrjp9的相对表达量与对照组相比反而降低。高粗蛋白质含量的蜂花粉反而会降低非营养功能基因mrjp6、mrjp8和mrjp9的相对表达量，但其相对表达量的降低程度与蜂花粉中粗蛋白质及氨基酸含量并没有一定的规律性，蜂花粉对mrjp6、mrjp8和mrjp9表达的影响作用需要更多的研究来证明。
3.2 不同蜂花粉对蜂王浆产量、质量和组成的影响影响蜂王浆产量的因素众多，包括蜂种、蜜粉源、气候、泌浆蜂日龄及取浆时间等[36-37]。蜜蜂和其他动物一样，不能制造全部氨基酸，大都需从食物中获得[38]。蜜蜂摄取蛋白质后在体内消化分解成多肽或氨基酸，被肠壁吸收，通过循环系统运输到各组织器官，重新合成所需要的蛋白质，参与细胞的构成和其他生命活动。工蜂咽下腺是分泌蜂王浆的主要器官，蜂花粉可以刺激工蜂咽下腺发育及分泌蜂王浆[25]，蜂花粉中的粗蛋白质含量直接影响工蜂的咽下腺发育水平[39]。粗蛋白质含量不同的蜂花粉对工蜂咽下腺发育的刺激有所不同，高蛋白质食物对咽下腺发育有明显的刺激作用，并能延长工蜂寿命和泌浆时间[40]。5日龄前工蜂消耗的蜂花粉主要用于咽下腺的发育，咽下腺发育成熟后哺育蜂需要大量的蛋白质用于王浆的分泌[41]。蜂群内蛋白质营养供应不足或质量不佳，会对养蜂生产造成重大影响。因此，在养蜂生产中必须根据外界蜜粉源条件，适时添加蛋白质饲料[42]。本研究取浆时间为云南省蒙自市的10—11月份，蜜粉源植物主要是鬼针草，其花粉中粗蛋白质含量为15.29%，蛋白质含量较低，生产蜂王浆的蛋白质营养供应相对不足，而饲喂粗蛋白质含量较高的油菜花粉和土连翘花粉则可以显著提高蜂王浆产量，并且蜂花粉中粗蛋白质含量越高，蜂群的蜂王浆产量越高。但是，并不是蜂花粉中粗蛋白质含量越高对蜂王浆产量的提高程度越高，粗蛋白质含量具有一定阈值，一般为30%，饲喂粗蛋白质含量超过阈值的蜂花粉甚至会降低王浆分泌量[9]，且过高的粗蛋白质含量反而会对咽下腺造成一定的抑制作用[43]。因此，西方蜜蜂所饲喂的蜂花粉中粗蛋白质含量不宜过低也不宜过高，以27.5%~30.0%为宜[30]，油菜花粉粗蛋白质含量为27.21%，对于繁育蜂群和蜂王浆生产来说油菜花粉是一种较为合适的蛋白质饲料。由于蜂花粉不只含有蛋白质和氨基酸，还富含维生素、微量元素、活性酶、酚类和黄酮类化合物、脂类、核酸等多种物质[20]，蜂花粉中其他物质对蜂王浆产量的影响还需更多研究来证明。
蜂王浆质量是对于蜂王浆作为一种商品而言的，蜂王浆质量的评判应该综合考虑蜂王浆的新鲜性、真实性、洁净程度及蜂种、地区和生产季节的差异性。蜂王浆的国家标准分别从色泽、气味、口感和理化要求等方面对蜂王浆做了相应规定，不同蜂花粉所产蜂王浆的色泽、气味、口感都有所不同，无优劣之分，本研究主要从蜂王浆理化要求方面对3种蜂王浆做了相应检测。蜂王浆的化学成分极为复杂，生物活性物质种类繁多，因而影响蜂王浆质量的因素错综复杂。蜂王浆中的多种生物活性成分大部分来源于其食物中的蛋白质，因此，王浆的质量和生物活性成分受食料(花粉)条件的影响非常明显。王浆酸(10-HDA)是自然界其他物质中未被发现的蜂王浆特有成分，是反映蜂王浆质量的重要指标之一[44]。本研究中，饲喂3种蜂花粉蜜蜂所产蜂王浆的10-HDA含量差异不显著。根据国家标准《蜂王浆》(GB 9697—2008)产品等级和理化要求，优等品水分含量≤67.5%、10-HDA含量≥1.8%、蛋白质含量在11%~16%、酸度在30~53，西方蜜蜂饲喂3种蜂花粉所产蜂王浆都属于优等品，结合3种蜂王浆各项理化指标数据差异性分析，饲喂油菜花粉和土连翘花粉西方蜜蜂所产蜂王浆与自然采粉所产蜂王浆在质量方面不存在显著差异。蜂王浆的国家标准还有待完善，不同蜂花粉对蜂王浆中其他活性物质的影响还需进一步研究。
MRJPs为水溶性蛋白，为蜂王浆中主要的蛋白质[7-8]。使用不同粗蛋白质含量的蜂花粉饲喂蜂群所产蜂王浆的水溶性蛋白含量差异不显著，水溶性蛋白SDS-PAGE图在谱带数目、带的分布与强弱等方面差异不显著，表明它们具有相似的水溶性蛋白组成，蜂花粉的粗蛋白质含量对蜂王浆水溶性蛋白组成影响很小。蜂王浆由多种蛋白质组成，每种蛋白质组成及氨基酸含量各不相同，如果一种或多种mrjps表达量改变必然会影响蜂王浆中某些氨基酸含量的变化，但是本试验检测到饲喂3种不同蜂花粉所产蜂王浆的氨基酸组成及含量基本一致，推测3种蜂王浆蛋白质组成基本没有发生改变，饲喂3种粗蛋白质含量不同的蜂花粉对所产蜂王浆组成影响不大。
3.3 mrjps和yellow-e3的表达量对蜂王浆产量的影响遗传信息由DNA转录为RNA，再翻译为行使功能的蛋白质，这是生命信息表达的中心法则[45-46]。基因表达是指基因指导下的蛋白质合成过程。在稳定状态的时候，mRNA的水平决定了蛋白质的水平。但是，不能以mRNA的丰度来判断mRNA翻译成蛋白质的水平，蛋白质的表达水平除了被转录本的量调控以外，还存在其他许多重要的调控途径[47]。蜂王浆成分十分复杂[3]，MRJPs是蜂王浆中蛋白质的主要组成成分，其中MRJP1、MRJP2、MRJP3和MRJP5占蜂王浆蛋白质总量的82%[8]。MRJPs是由mrjps基因表达合成的，mrjps是一个非量产基因，其mRNA表达量的高低反映了单只工蜂咽下腺分泌蜂王浆中MRJPs能力的高低[30]。本研究中，mrjp1、mrjp2、mrjp3、mrjp4、mrjp5和mrjp7的相对表达量均为油菜花粉组>土连翘花粉组>对照组，其蜂王浆产量也都为油菜花粉组>土连翘花粉组>对照组，3组蜂花粉中mrjp1、mrjp2、mrjp3、mrjp4、mrjp5和mrjp7的相对表达量都占mrjps总相对表达量的98%以上，在西方蜜蜂中相对高表达，其表达量的高低与蜂王浆产量正相关，而mrjp6、mrjp8和mrjp9在西方蜜蜂中相对低表达，其表达量的高低不会影响蜂王浆产量。据此推测，mrjp1、mrjp2、mrjp3、mrjp4、mrjp5和mrjp7的表达量越高，蜂王浆产量就会越高。
黄体基因(yellow)家族可能是迄今为止发现的最神秘的家族之一，由于第1个被鉴别出的黄体基因与果蝇体色相关，被命名为yellow[48-49]。迄今为止，yellow只在昆虫和一些细菌中发现，在昆虫多样性中起到重要作用。在西方蜜蜂中，mrjps家族属于yellow家族的一个分支，起初只在蜜蜂属中发现，后来研究发现mrjp类似基因普遍存在于膜翅目当中[9]。Drapeau等[10]认为mrjps起源于yellow-e3，是由yellow-e3经过一次快速多重复制的进化事件形成的。同时，mrjps的复制是通过yellow-e3作为启动子而开始的，并且yellow与西方蜜蜂的生理和发育相关。我们推测yellow-e3可能与西方蜜蜂咽下腺发育相关。定量PCR研究发现，与对照组相比，饲喂油菜花粉和土连翘花粉可以显著提高西方蜜蜂yellow-e3的相对表达量，且提高程度为油菜花粉>土连翘花粉。我们推测，yellow-e3表达量越高，其咽下腺发育程度越高，蜂王浆合成相关基因表达量越高，咽下腺分泌活动越强，蜂王浆产量越高。
4 结论不同粗蛋白质含量的蜂花粉对西方蜜蜂mrjps的表达及蜂王浆产量存在影响，对蜂王浆质量和组成的影响不大。3组蜂群相比，采食油菜花粉的蜂群具有营养功能的mrjps的相对表达量和蜂王浆产量最高。由此可见，对于西方蜜蜂繁育或蜂王浆生产，油菜花粉可作为一种优质的饲粮。
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