抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是一类具有直接抗菌活性、普遍存在于自然界、基因编码的新型抗菌剂，因其能抗传染性疾病、无残留、可替代抗生素用于疾病治疗，成为近年来抗生素替代物研究热点^[1]。AMPs作用于病原微生物的机理独特，主要通过膜靶向成孔机制，不易使微生物产生耐药性^[1]。已有的研究证明，AMPs能提高羔羊生产性能^[2]，还能改善山羊瘤胃发酵模式，提高饲料利用率^[3]。另外，饲喂AMPs不仅能提高仔猪的生长性能^[4-6]和免疫功能^[7-8]，还有助于维护仔猪^[9]和肉鸡^[10]胃肠道健康，具有与抗生素相似的作用，因此可以部分替代抗生素应用于畜禽养殖中。但目前的研究多针对非反刍动物，且对于AMPs如何影响反刍动物瘤胃发酵参数以及温室气体排放尚不清楚。本试验选用的蜜蜂肽(apidaecin)是一种昆虫源AMPs^[11]，从蜜蜂(Apis mellifera)淋巴液分离得到的，一级结构式为PVRRPVYIPQPRPPHPRL，分子质量为2.23 ku，由枯草芽孢杆菌提取改造，能特异性抑制革兰氏阴性菌。本研究旨在探究蜜蜂肽对绵羊瘤胃发酵的影响，以期为蜜蜂肽在反刍动物饲粮中的应用提供参考。

1 材料与方法 1.1 试验设计

选用健康、体重为(40±3) kg的4只高山美利奴羊作为瘤胃液供体，体外发酵饲粮选用玉米和苜蓿，按精粗比为75 : 25混合均匀，体外发酵底物饲料原料统一过1 mm筛。采用单因子试验设计，共3个处理，每个处理7个重复，每千克干物质基础上，蜜蜂肽(由甘肃奥林贝尔生物科技集团有限公司提供)添加量分别为0、0.75、1.50 mg。

1.2 体外瘤胃发酵

配制人工瘤胃营养液：A液998 mL、B液10 mL、C液2 mL，其中A液为缓冲试剂和常量元素溶液，由382.51 mg K₂HPO₄、292 mg KH₂PO₄、480 mg (NH₄)₂SO₄、200 mg NaCl、100 mg MgSO₄·7H₂O和40 00 mg Na₂CO₃加蒸馏水定容至1 000 mL配制而成；B液为微量元素溶液，由500 mg乙二胺四乙酸(EDTA)、200 mg FeSO₄·7H₂O、200 mg MnCl₂·4H₂O、10 mg ZnSO₄·7H₂O、30 mg H₃BO₃、20 mg CoCl₂·6H₂O、1 mg CuCl₂·2H₂O、2 mg NiCl₂·6H₂O、3 mg NaMoO₄加蒸馏水定容至1 000 mL配制而成；C液为还原剂溶液，由25 mg Na₂S·9H₂O加蒸馏水定容至100 mL配制而成^[12]。缓冲液用前新鲜配制，再用二氧化碳(CO₂)饱和(约40 min)，盖上橡皮塞，并恒温水浴预热至39 ℃待用。

在试验前，在每个玻璃发酵瓶内准确称取1 g饲粮，提前将水浴锅打开，加热至39 ℃。收集4只高山美利奴羊的瘤胃内容物，混合均匀后经4层纱布过滤瘤胃液，加入至用热水预热且提前通有充足CO₂的保温瓶中，盖严瓶塞，将其带回实验室。在整个试验过程中持续通入CO₂确保厌氧环境。参考李朝云^[13]的体外发酵方法，瘤胃液与人工瘤胃营养液的体积比为1 : 2，混合均匀，先用100 mL注射器准确量取80 mL人工营养液，加入到每一发酵瓶中，通入CO₂后迅速用橡胶塞密闭；再迅速揭开瓶盖，依次在每个发酵瓶中加入40 mL瘤胃液，继续通入CO₂数秒，然后将发酵瓶用橡胶塞紧密密封，放入已经预热至39 ℃的水浴锅中进行体外发酵模拟。

1.3 样品采集 1.3.1 气体采集

发酵24 h，取一注射器针头，用一软细短管将集气袋与针头连接，将针头插入发酵瓶橡胶塞，收集气体样品，接着立即从恒温水浴锅中取出所有发酵瓶，立即转入备好的冰水混合物中，冷却15 min终止发酵，将全部收集到的气体样品带回实验室测定发酵产气量。

1.3.2 瘤胃发酵液采集

取含有2 mL 25%偏磷酸溶液的10 mL离心管，用带刻度的注射器抽取5 mL发酵液加入到每个离心管中，-80 ℃保存，用于测定挥发性脂肪酸(VFAs)含量，另外，用注射器采集10 mL瘤胃发酵液，用于瘤胃微生物数量的分析。

1.4 测定指标及方法 1.4.1 体外发酵参数测定

气体收集结束后，依次打开发酵瓶，测定发酵液pH。

VFAs含量的测定，参考梁玉生^[14]的方法：于4 ℃过夜解冻瘤胃液样品(10 mL离心管)，解冻后取2 mL于离心管中。于4 ℃、3 000×g离心10 min，取全部上清液于4℃、12 000×g离心15 min，用注射器吸取上清液，过0.45 μm有机系滤膜，取1 mL瘤胃液与200 μL 1%(质量浓度)巴豆酸混合。利用气相色谱仪(Thermo Scientific，TRACE 1300，意大利)测定VFAs含量。测定条件与王志兰^[15]一致：选择毛细管色谱柱(DB-FFAP，30 m×0.320 mm×0.25 μm，Aglient，美国)，设置进样量为1 μL，分流比为50 : 1，进样口温度为240 ℃，检测器温度与之一致，氢气、空气、氮气流率分别是35、350、20 mL/min，温度从50 ℃起以25 ℃/min的速率上升至190 ℃，维持2 min，再以10 ℃/min的速率上升至200 ℃并维持5 min，之后以相同的速率升温至220 ℃维持5 min。

1.4.2 产气量测定

采用气相色谱仪(岛津，GC-2014C)测定收集到的气体产量，瘤胃发酵气体产量的测定条件：将收集到的气体全部手动推入气体进样环中，色谱柱温为50 ℃，检测器温度为200 ℃，氢气流量为10 mL/min，空气流量为400 mL/min，尾吹流量为15 mL/min。根据进样体积计算气体中的甲烷、CO₂和氧化亚氮(N₂O)的产量。

1.4.3 瘤胃微生物数量测定

选取瘤胃主要的淀粉分解菌和纤维分解菌采用荧光定量PCR技术进行定量分析。从-80 ℃冰柜取出采集的瘤胃液，在4 ℃完全解冻，摇匀，用移液枪取1 000 μL瘤胃液于1.5 mL灭菌离心管，提取微生物总DNA。具体方法参考E.Z.N.A.DNA试剂盒(Omega Bio-Tek, Norcross, 美国)中的说明。

向PCR扩增产物中加入5 μL 10×Loading Buffer混匀，加到含EB的1.2%琼脂糖凝胶中，同时加入DNA Marker，在DNA电泳仪(DYCP-32A, 北京六一生物科技有限公司)中采用120 V电压电泳30 min左右，然后在凝胶成像仪中记录结果。

将上述步骤提取的微生物DNA对瘤胃微生物进行绝对定量，使用实时定量PCR检测系统(Bio-Rad Laboratories Inc., 加拿大)。细菌的质粒DNA与试验羊的瘤胃微生物DNA在同一板进行扩增，反应体系为20 μL，包括10 μL EasyTaq DNA polymerase，7.8 μL ddH₂O，上、下游引物各0.6 μL，微生物DNA样品1 μL。各细菌的扩增引物如表 1所示。参考王尧悦^[16]的方法计算各样品中每种细菌的拷贝数。整个反应条件为：94 ℃预变性3 min、变性15 s，然后60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共计40个循环。实时定量PCR反应结束后，自动生成熔解曲线。PCR产物均呈现单一的熔解峰。每个样品3个重复，所用引物的扩增效率在87%~98%。

1.5 数据统计分析

试验结果经过整理后采用SPSS 22.0软件进行方差分析，通过one-way ANOVA进行组间差异分析，显著水平为P < 0.05，用Duncan氏法对相关指标的数据进行多重比较。

2 结果 2.1 蜜蜂肽对瘤胃发酵参数的影响

由表 2可知，体外发酵24 h，与不添加蜜蜂肽相比，添加蜜蜂肽有改变瘤胃液pH的趋势(P=0.080)，添加0.75 mg的蜜蜂肽能显著提高瘤胃内乙酸比例(P < 0.05)，显著降低瘤胃内丙酸比例(P < 0.05)，显著提高乙酸/丙酸(P < 0.05)。

2.2 蜜蜂肽对瘤胃产气量的影响

由表 3可知，体外发酵24 h，与不添加蜜蜂肽相比，添加蜜蜂肽对CO₂、N₂O产量以及总产气量没有显著影响(P>0.05)，但添加0.75 mg蜜蜂肽能显著提高CH₄产量(P < 0.05)。

2.3 蜜蜂肽对瘤胃微生物数量的影响

由表 4可知，体外发酵24 h，与不添加蜜蜂肽相比，添加蜜蜂肽对产琥珀酸丝状杆菌、嗜淀粉瘤胃杆菌、溶纤维丁酸弧菌、牛链球菌数量没有显著影响(P>0.05)，但有提高普雷沃氏菌数量的趋势(P=0.078)。

3 讨论 3.1 蜜蜂肽对绵羊瘤胃发酵参数的影响

在绵羊育肥中，为最大程度满足绵羊生长的能量需要，通常在饲粮中添加高比例易发酵碳水化合物，这在满足动物机体对能量需求的同时也会造成瘤胃内总挥发性脂肪酸含量增加、瘤胃液pH降低，导致瘤胃酸中毒的发生^[17]。瘤胃内主要是革兰氏阴性菌发酵产生丙酸^[18]。目前，研究最广的抑制革兰氏阳性菌的饲料添加剂主要有离子载体，如莫能菌素和海南霉素，植物次级代谢物，如单宁、皂苷和植物精油^[19-21]。Beauchemin等^[22]研究发现，莫能菌素通过抑制瘤胃内革兰氏阳性菌，使瘤胃发酵向丙酸模式发展，进而抑制甲烷生成。研究表明，植物精油混合物(香芹酚、石竹烯、对伞花烃、桉树脑、萜品烯和百里酚)能提高犊牛瘤胃内丙酸含量，可以在犊牛瘤胃发育过程中调节瘤胃微生物及VFAs组成^[23]。另外，有试验结果显示，在荷斯坦犊牛的开食料中添加莫能菌素，会提高瘤胃发酵中丙酸比例^[24]。体外试验的结果表明，发酵底物中添加苜蓿皂苷或山苍子油，会降低瘤胃液pH和丙酸含量^[25-26]；发酵底物加入桉叶油或茴香油降低瘤胃发酵中的乙酸/丙酸^[26]。前人的研究一致表明，可以通过添加抗革兰氏阳性菌的制剂，降低瘤胃内革兰氏阳性菌的数量，提高瘤胃发酵中的丙酸比例，降低乙酸/丙酸。而本试验选用的蜜蜂肽能选择性抑制革兰氏阴性菌，因此本试验结果与上述研究结果相反，体外发酵24 h，蜜蜂肽提高乙酸比例和乙酸/丙酸，降低丙酸比例。微生物定量结果表明，短期发酵，蜜蜂肽对瘤胃内功能性微生物无不良影响。

3.2 蜜蜂肽对绵羊甲烷排放的影响

有研究指出，反刍动物每天能产生250~500 L甲烷^[27]。研究发现，瘤胃内革兰氏阳性菌数量与瘤胃内甲烷产量密切相关，因此选择性抑制革兰氏阳性菌能有利于减少瘤胃甲烷的产量^[18]。有试验表明，壳聚糖能抑制革兰氏阳性菌，添加到奶牛饲粮中能提高丙酸含量，降低甲烷产量^{[13, 28]}。Li等^[29]研究表明，饲粮添加剂莫能菌素对瘤胃甲烷产量的抑制作用归结于瘤胃饲粮降解和乙酸/丙酸的降低。体内、体外试验表明，饲料添加剂植物精油(肉桂油和肉桂醛)能减少瘤胃中甲烷气体的产生^[30-31]；能达到同样效果的还有百里香酚和香芹酚^[32]。另外，Liu等^[33]试验发现，来自胡枝子和白桦提取物的缩合单宁，能减少瘤胃甲烷排放。植物精油乙酸龙脑酯也能减少瘤胃发酵的甲烷产量，且效果与莫能菌素相当^[34]。同样，抑制革兰氏阳性菌的维吉尼亚霉素也能降低体外发酵试验中的甲烷产量，莫能菌素则是降低乙酸含量^[35]。本研究选用的蜜蜂肽是一种特异性抑制革兰氏阴性菌的AMPs，因此本试验结果与上述研究结果相反，短期发酵24 h，蜜蜂肽会降低瘤胃内丙酸比例，因此提高了甲烷产量。

4 结论

体外发酵24 h，蜜蜂肽可以改变瘤胃发酵VFAs的生成，提高乙酸比例，降低丙酸比例，提高乙酸/丙酸，提高甲烷产量，促进瘤胃乙酸型发酵。短期发酵，蜜蜂肽对瘤胃内功能性微生物无不良影响。