乳是一类成分复杂的生物分泌物，主要含有脂肪、蛋白质、乳糖和矿物质。乳汁是哺乳动物幼子唯一的能量来源，同时供给其他必需营养素和生物活性成分。乳中含有3%~5%的脂肪，这些脂肪主要位于乳脂球中[1]。乳的水包油乳化液的稳定性由一个薄层脂类结构支撑，称为乳脂球膜(milk fat globule membrane，MFGM)。MFGM包裹乳脂球避免其脂肪分散于乳中，得以保持其乳化稳定。乳脂球是一类在乳中独有的胶状结构体，直径0.1~20.0 m，而MFGM是乳腺上皮细胞合成乳脂球过程中形成的产物[2]。研究表明，牛乳分离的MFGM中含有69%~73%的脂类和22%~24%的蛋白质及其他微量成分[3]。MFGM的组成与特性受多种因素影响，如乳的来源、加工工艺以及环境因素等[4]。目前的研究表明，无论是MFGM的脂类成分还是蛋白质成分均具有改善人体健康的生物活性作用[5-6]。本文综述了MFGM的形成与结构、化学组成和潜在生物学功能的研究进展，并讨论了未来研究趋势。
1 MFGM的形成与结构 1.1 形成乳脂肪在乳腺分泌细胞内合成并逐步形成脂小滴以乳脂球的形式分泌，在此过程中形成MFGM。脂小滴由乳腺发育激素调控并在乳腺分泌细胞形成的机理早在1959年由Bargmann等[7]首次提出，随后又被其他研究证实[8-9]。脂小滴在乳腺分泌细胞内被挤压至顶端膜，并在膜上释放位点逐渐被该膜包裹，最终完全被顶端膜包被。根据现有认知，对脂小滴的来源、增长和分泌途径的总结列于图 1。
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图 1 乳腺上皮细胞内乳脂球形成分泌过程的总结图 Fig. 1 Diagram summarizing the process of forming and secretion of milk fat globules in mammary epithelial cells[10-11] |
现有证据表明，脂小滴合成位点主要在乳腺分泌细胞基底区域，通过胞质迁徙至细胞顶端区域(图 1)。这一过程在乳腺细胞是独有的，并有别于其他类型细胞中脂类的转运。脂小滴的单向运输机制仍不明确，但有证据表明细胞骨架系统上的微管(microtubules)和微丝(microfilaments)可能参与致使该类的单向转运发生[12]。胞质微管在泌乳细胞中大量存在并且在泌乳前乳腺内微管蛋白含量大幅度的上升。微管在胞质内的综合作用以及与其关联的微管蛋白(具释放力的特性)为微管参与脂小滴运输奠定了基础[12-13]。
乳脂球在初始阶段，是被一类典型的原核细胞膜所包围。细胞膜起着防护作用，将细胞水样组件与不同溶剂隔离，并且为许多酶和转运系统提供结构位点。源自内质网的乳脂球呈现较小的脂小滴。脂类主要是甘油三酯，聚集在内质网膜内或膜上的聚集点上。这种脂类的聚集可能是由于聚集点上的局部合成，或者分散聚集，又或统一分配生物合成所致。有种推测认为，甘油三酯在双层膜的间隙聚集，然后从内质网以小滴包被一半细胞质的外层内质网膜的形式释放入胞质内[9, 12]。一种体外离体细胞研究体系中用泌乳乳腺分离所得的内质网可诱导释放脂小滴，并且其形态特征和组成与体内形成的脂小滴极为相似。在该体外体系中，只有在培养介质中细胞质部分的分子质量大于或等于10 ku时脂小滴才能形成，这表明细胞质因素参与脂小滴在内质网形成和释放过程[12]。
无论乳脂球在内质网内或上形成并释放的机制是什么，乳脂球前体物首先要在胞质内以直径小于0.5 μm的小滴形式存在，富含甘油三酯的该小滴外围包裹着小颗粒状物质，虽然该层没有双层膜结构，但在某些区域呈现增厚态，并呈3层样结构[5]。这些小滴称为微脂类小滴，相互融合后可增加体积。融合致使小滴逐渐增大，直径大于1 μm，称为细质脂小滴。乳腺上皮细胞中有种机制可使微脂小滴融合形成脂小滴。微脂小滴同样可与细质脂小滴融合，以提供甘油三酯以便进一步增大脂小滴。乳中乳脂球尺寸的范围，可用脂小滴相互融合过程进行估测或至少部分估测。小的乳脂球可能是由于微脂小滴经少许或未经融合即被分泌，而较大的脂小滴则经历了多次融合。已有证据认为，脂小滴的增长是通过相互融合实现的，但并无证据说明该过程中是如何调控和控制乳脂球最终大小的分配。融合过程可能是纯粹的随机事件，可能只受分泌前脂小滴之间相互接触的概率所控制。目前无充足证据表明脂小滴的增长仅受或主要受互溶机制的控制。其他的可能机制包括脂类转运蛋白将甘油三酯从所合成位点转运至增长中的脂小滴上[12]。平均乳脂球的直径决定乳中MFGM的含量，进而影响乳的乳化稳定性，即较大的乳脂球“节约”MFGM，但可能相应弱化乳化稳定作用。
1.2 结构真正了解MFGM结构，首先需了解3个过程，分别为在基底细胞的浆液性内质网内或内质网上的甘油三酯合成脂小滴的过程、脂小滴穿越细胞的活动以及乳脂球从细胞内分泌至囊泡官腔内(图 1)[14-17]。
MFGM源自顶端浆膜区域和内质网或者也可能源自其他细胞内组件，乳脂球与MFGM的结构见图 2。MFGM首要组成部分来自顶端浆膜结构层，其具有典型的2层膜，内膜表面富集电子。脂小滴表面不与质膜直接接触，而是与上述富含电子的胞质表面物质接触。研究发现，MFGM上的嗜乳脂蛋白(butyrophilin)和黄嘌呤氧化还原酶(xanthine oxidoreductase)是顶端质膜表面胞质上富集电子物质的主要组分[9]。嗜乳脂蛋白是具泌乳细胞特质的一类疏水性跨膜糖蛋白，富集于顶端泌乳细胞的表面，该蛋白与磷脂紧密结合，且可能参与介导脂小滴与顶端质膜间的互作。黄嘌呤氧化还原酶分布于整个胞质，但在顶端细胞表面呈现富集[12]。来自内质网的MFGM呈现单层蛋白质和极性脂类，该层在乳脂球分泌前包裹着富含甘油三酯的内核脂类。该单层或其包被物质在细胞间区分内核脂类并在细胞内参与脂小滴通过融合增加体积，这一包被层的组分也可能参与脂小滴与浆膜的互作[3, 5]。
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图 2 乳脂球与乳脂球膜结构图 Fig. 2 Structure of milk fat globule and milk fat globules membrane[10] |
电子显微镜观察表明，MFGM的厚度有7~9 nm，呈现3层样结构，1层亮的疏电子夹在2层暗的富电子层之间。磷脂分子排布成双层结构，非极性的碳氢化合物链朝向内侧，可自由“蠕动”，形成一个连续的碳氢化合物基底。亲水区域朝向外，相对比较僵硬。在该双层结构中具有流动性、灵活性、高电子耐受性和对极性分子的低渗透性，致使单个脂类分子可在此横向活动。一些膜蛋白部分镶嵌于膜内，从一侧渗透入脂类相，其他一些完全埋在膜内，而另外一些则跨膜存在[9, 12]。
乳脂球被3层顶端膜结构所包围，并趋于稳定。膜的内表面是一层高密度蛋白质层，可能作用于分泌细胞内乳脂球从基底的粗内质网(甘油三酯在此合成)向顶端移动的过程，一个高融点甘油三酯层可能存在于上述蛋白质层内。多数该3层膜在乳陈化过程中损失，尤其搅拌后；因此所脱落的膜在脱脂乳中以囊泡(微粒体)形式存在，这一现象亦解释了脱脂乳含有较高比例的磷脂的原因。MFGM的结构模型先后得以公开发表，包括Mc Pherson[18]、Keenan等[8-9, 16, 19]、Mather[17]。但由于MFGM是一类动态、不稳定结构，因此很难描述每一种情况和条件下的结构模式和组成。
2 MFGM的化学组成 2.1 总化学组成早期研究发现，MFGM中含有磷脂和有别于脱脂乳蛋白的蛋白质[20]。随后报道称，每100 g乳脂肪中含有0.5~1.5 g的MFGM[21]。采用不同方法对膜的组成进行分离和分类测得膜的总化学组成，各报道结果相对差异较小，其主要组成为蛋白质、脂类、水和其他微量成分。Mulder等[21]根据诸多检测结果总结了MFGM的概略组分(表 1)。随后Keenan等[19]对牛乳MFGM的组分进行了更加细微分类，即主要对脂类组分和蛋白质组分进行了明确分类。另外，随分析化学和仪器分析技术的进步，对MFGM的总化学组分进行了更加细微的检测[8-9]。
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表 1 乳脂球膜概略组分 Table 1 Approximate component of milk fat globule membrane[21] |
MFGM中的蛋白质约占乳中总蛋白的1%。膜内含有独特的蛋白质，而这类蛋白质不会出现在脱脂乳相。多数蛋白质是糖蛋白并且含有显著数量的碳水化合物(己糖：2.8%~4.2%，氨基己糖：2.5%~4.2%，唾液酸：1.3%~1.8%)[12]。
采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、银离子染色胶，可将MFGM蛋白质分离出分子质量在11~250 ku的多达60个条带[8-9, 22]。这些蛋白质浓度多数微量(许多条带只在银离子染色时出现，而不在考马斯蓝染色时出现)。其中一些蛋白质可能是遗传性变型，并且由于MFGM中含有一种胞浆素样蛋白酶，因此一些小的多肽可能是较大蛋白质的水解碎片。MFGM中3个主要的蛋白质是黄嘌呤氧化还原酶、嗜乳脂蛋白和糖蛋白B(glycoprotein B)，其分子量分别为155、67和48 ku。用希夫试剂(Schiff’s reagent)染色后曾检测到5或6个糖蛋白。MFGM内约20%的蛋白质较容易从膜上脱离，比如在加工冷却过程中；等电聚焦结果表明等电点(pI)在7.0~7.5间至少存在4种变体[8-9, 22]。
MFGM中几种微量的蛋白质也得以分离，并且研究者对部分特性进行了探知[8-9]，同时亦对蛋白质组学的研究方法进行了评估[23]。近年，借助蛋白质组学研究方法对不同物种或品种动物来源的MFGM蛋白质组成、丰度与代谢路径进行对比，结果表明不同来源MFGM蛋白质均有部分组成和功能的重叠，但丰度和代谢路径上存在不同程度的差异[24-28]。此外，Mather[22]根据蛋白质在SDS-PAGE的相对电泳淌度，提出了一种对MFGM蛋白质的系统命名方法。
2.3 脂类组分MFGM的脂类占乳中总脂类的0.5%~1.0%，且主要由磷脂和中性脂组成，二者比例约为2 : 1，同时存在少量其他脂类(例如脑苷脂，见表 1)，在分离与检测中难免受内核脂类的“污染”。其中，磷脂主要是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂，比例约为2 : 2 : 1。磷脂中的主要脂肪酸组成为C14 : 0(约5%)、C16 : 0(约25%)、C18 : 0(约14%)、C18 : 1(约25%)、C18 : 2(约9%)、C22 : 0(约3%)和C24 : 0(约3%)[19]。可见，相对于总乳脂肪，膜上的脂肪含有较高水平的多不饱和脂肪酸，因此该部分脂类更容易氧化。脑苷脂富含极长链脂肪酸，该特性可能有助于膜的稳定性。此外，膜内也含有糖脂[19]。
MFGM中中性脂类的定量与特性目前仍不确定，主要原因是很难精确定义内膜界限。通常认为，该部分脂类中含有83%~88%的甘油三酯、5%~14%的甘油二酯和1%~5%的游离脂肪酸[12]。其甘油二酯的含量显著高于总乳脂中的含量；甘油二酯相对而言具有一定极性，因此具有表面活性作用。中性脂类部分的脂肪酸链长长于总乳脂脂肪酸链长，其主要脂肪酸组成包括棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸和月桂酸[12]。
多数固醇和固醇酯、维生素A、胡萝卜素和鲨烯(三十碳六烯酸)存在于乳脂球的内核部分，但一些可能也存在于膜上[12]。
2.4 其他组分MFGM中含有多种微量元素。脂肪膜中含5%~25%乳中固有的铜(Cu)和30%~60%的铁(Fe)，同时也含有其他几种微量元素，比如钴(Co)、钙(Ca)、钠(Na)、钾(K)、镁(Mg)、锰(Mn)、钼(Mo)、锌(Zn)、硒(Se)；多数金属元素是酶的组分，如Zn和Mg存在于碱基磷酸酶中，Fe和Mo存在于黄嘌呤氧化还原酶中，Fe还存在于过氧化氢酶和乳过氧化物酶中[12]。
MFGM中含有多种酶。这些酶源自分泌细胞的胞质和膜，并存在于MFGM中，因为MFGM由上述细胞所分泌[8]。
3 MFGM的潜在生物活性作用MFGM除具有营养价值外，其主要成分亦具有益健康的生物活性作用，主要包括磷脂和部分膜蛋白[29-30]。诸多研究表明，MFGM上的成分具有不同生理活性作用。如鞘磷脂具有抗癌细胞增殖活性；糖苷鞘磷脂与免疫活性或细胞信号传导有关；位于膜上极性脂类层间隙的黄嘌呤脱氢酶(XDH)和黄嘌呤氧化酶(XO)具有抗菌作用；膜外层上的一类主要糖蛋白黏蛋白1(MUC1)具有抑制肠内细菌与肠道上皮细胞结合的作用[31-32]。但就MFGM的整体活性作用或各成分间的相互作用的研究报道较少。
3.1 抗炎症与干预肥胖症的作用有研究证实MFGM碎片具有抗炎症作用。添加饲粮MFGM可升高血清中抗炎细胞因子白细胞介素-10(IL-10)水平，降低促炎细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子-α水平，并降低胰岛素反馈效应和总胆固醇水平[6]。类似的研究表明，MFGM分离物可降低脂多糖(LPS)诱导的小鼠系统性炎症反应，与对照动物比较，试验动物添加MFGM分离物可降低血清促炎因子水平[33]。
在成年肥胖症患者的相关研究中发现，在高饱和脂肪饲粮条件下，MFGM碎片具有一定的抗炎效应[34]，并可通过抑制脂类合成代谢和促进白色脂类组织中的褐色脂肪样转变，从而降低食物诱导的肥胖症的发生[35]。对肥胖症患者或超重人群高饱和脂肪酸食物中添加MFGM对炎症指标和骨骼周转速率无显著影响[36]，但对具有较高血液胆固醇与高密度脂蛋白比例的人群有一定抗炎保护作用[34, 37]。
3.2 免疫调节作用MFGM成分亦可能具有免疫调节作用。一项体外研究表明，MFGM分离物可抑制由LPS或刀豆凝集素A(二者均为多克隆激活剂)诱导的脾脏淋巴细胞增殖，表现为降低γ-干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α的分泌[38]。近年的研究证实，这一免疫调节作用不只局限于生乳提取的MFGM，同时在巴氏杀菌乳中获得的MFGM碎片同样具有该功效[38]。未被肠道消化的MFGM相较于消化的MFGM对目标细胞的免疫调节作用下降，说明肠道内的酶对其有水解作用，如胰蛋白酶和磷脂酶A2影响MFGM的活性。这一现象可能是由于MFGM的分子组分、蛋白质和脂类或多分子结构发生改变所致[38]。但另有研究表明，消化后的MFGM的生物活性表现取决于媒介中促细胞分裂剂的使用与否，即使用促细胞分裂剂时对抑制刀豆凝集素A诱导的T细胞数量具有较好的生物活性表现[39]。
研究证实MFGM组分通过免疫调节和抗炎可减缓骨骼肌衰老，从而对延缓机体衰老和提高运动表现有积极意义[40-41]。MFGM组分的极性脂类[41]和蛋白质[40]均可能具备上述作用，其中研究认为蛋白质组分的分子作用机理可能主要是通过调节细胞分化而实现[40]。
3.3 抗癌作用MFGM除免疫调节作用外，其抗癌潜能也得以关注。生乳分离获得的MFGM对结肠癌细胞系HT-29具有抗细胞增殖作用，主要通过激活一类编码细胞死亡的蛋白酶半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)而实现[42]。类似的结果在结肠腺癌细胞系Caco-2的试验中也得以证实，但经过80 ℃、10 min的热处理后提取的MFGM的生物活性作用明显降低[43]。无加热处理所得乳制品的该活性功能可较好的被保护，可同样降低HT-29细胞系的增殖[44]。此外与牛乳来源MFGM比较，山羊乳和水牛乳来源MFGM对HT-29细胞系的诱导凋亡作用显著[45]。大鼠为模型动物的研究中被重复证实饲粮添加MFGM组分可减少变性隐窝病灶(aderrant crypt foci)[46]。
3.4 抗菌、抗病毒作用MFGM具有一定抗菌作用或潜能。研究表明，MFGM对鼠伤寒沙门氏杆菌和荧光假单胞菌的增殖有抑制作用，但对大肠杆菌O157 : H7或单核细胞增多性李斯特氏菌的作用不明显[47]。Guri等[48]的研究证实，相比于牛，山羊MFGM对肠炎沙门氏菌在HT-29细胞中的附着和内化的抑制作用更强。此外，牛MFGM通过抑制志贺毒素基因表达，可降低大肠杆菌O157 : H7的毒性[49]。与MFGM对癌细胞的增殖的抑制作用不同，加热处理的奶油并没有降低MFGM对细菌毒性和内化作用的抑制效果[48-49]。MFGM抗菌作用的研究并非只限于体外试验，近期在一项婴儿饮食添加牛MFGM提取物的研究表明，按蛋白质质量比添加4%的MFGM提取物时，会降低婴儿急性耳炎的发生[50]。当每千克体重添加400 mg MFGM分离物时可抑制小鼠感染幽门螺旋杆菌[51]。
MFGM具有潜在抗病毒作用。由酪乳(butter milk)或乳清蛋白膏(whey cream)中分离所得的MFGM具有抑制轮状病毒活性作用，该研究中推断该作用是由MFGM中脂质组分实现[52]。MFGM的来源可能是影响其抗病毒生物活性的重要因素，因为酪乳提取所得活性高于奶酪乳清提取所得[6]。
MFGM抗微生物及其毒素的作用机制主要围绕其黏附作用开展。黏附作用是致病微生物在肠道定植生存的关键步骤，而MFGM组分可优先黏附致病微生物从而降低宿主炎症的发生[53]。乳脂球和MFGM黏附微生物的特性在体外研究中也被充分验证。研究发现在瑞士干酪发酵过程中细菌主要集中于脂肪-蛋白质结合的表面[54]，另有电镜研究中发现马苏里拉乳酪介质中细菌结合位点集中于乳脂球和MFGM碎片[55]。此外，有研究报道MFGM组分中有多个类似接收器可识别多种细菌毒素，比如志贺毒素、沙门氏菌毒素、霍乱弧菌肠毒素等[53]。Steil等[56]初步细化研究了志贺毒素接收器的结构及识别结合的特点。
3.5 MFGM作为食物添加剂的应用研究MFGM作为人膳食营养添加剂的应用研究主要集中于婴幼儿代乳粉中的添加以及成年人的食物添加方面。目前采用的婴幼儿代乳粉加工工艺极易破坏MFGM结构及其生物学特性，从而降低或丧失其生物学功能。因此，添加MFGM组分是使代乳粉更接近母乳的有效方法。有研究表明，在2~6月龄婴儿代乳粉中添加富含脂类组分的MFGM或富含蛋白质组分的MFGM均会提升婴儿在12月龄时的认知表现和增加非劣效性的体增重[57-59]。添加富含蛋白质组分的MFGM降低6月龄前的感染性死亡率，同时会升高血清胆固醇浓度至接近母乳喂养婴儿的水平[60]。但也有研究报道，添加富含蛋白质的MFGM时提高了婴儿患湿疹的风险[52]。模型动物试验结果表明，幼龄小鼠添加人工合成MFGM可有效避免成年时的肥胖症的发生[61]。介于MFGM对婴幼儿脑发育和健康具有诸多积极影响，因此认为作为婴幼儿食品添加剂的潜力较大，但仍需进行剂量与安全性方面的充分研究评估[62-64]。
健康成年人食物中添加MFGM可增加骨骼肌力量。在模型动物试验中发现添加MFGM结合习惯性运动可通过神经肌肉发育显著改善肌肉功能不足症，并且发现此过程中MFGM的磷脂和鞘磷脂起主要生理作用[41]。随后的研究表明，与安慰剂组比较成年健康男性每日持续口服1 g MFGM，大腿肌伸展力显著提升[65]。而在另一项针对75岁以上老龄女性的研究中，MFGM对肌肉虚弱状态的改善效果并不显著[66]。
4 小结MFGM是乳的重要功能性组成，除具有基本营养功能外，还具有多种生物活性作用。目前对MFGM的形成与结构已开展较深入的研究，并对MFGM形成的历程以及分泌的结构有了基本的认识，但对形成过程中的调控和调节机理如乳脂球的大小、相应MFGM的结构组成关联、乳脂球形成过程的单向性的调控机理等仍不明确。在物质组成方面，已充分了解MFGM的化学组成，包括从不同来源乳及乳制品中分离并检测，进一步的研究主要侧重于不同加工工艺对MFGM成分的重塑和分离提取时乳中其他成分的干扰等。MFGM的生物活性作用是目前人的膳食营养与医学领域的研究热点，已在抗炎、干预肥胖症、免疫调节、抗癌、抗菌、抗病毒等领域证实具有一定潜能，但多数仍处于体外试验阶段。因此，进一步的研究趋势主要集中在体内效应、不同来源以及不同组分MFGM的生物活性表现、MFGM组分与消化生理的互作机制与调控因素等方面。
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