微小RNA(miRNAs)是一类内生的、长度20~24 nt的非编码单链的RNA，在细胞中有多种调节作用。miRNAs多数在内分泌、神经内分泌或上皮组织中富集，可调节细胞促进细胞分裂、调节肝脏中的代谢、调控肌肉发育、诱导骨骼肌分化等。miRNAs作为治疗工具与核酸导向疗法相比，也是高效的沉默剂。与质粒DNA或合成寡核苷酸相比，miRNAs自然存在于血液中，通过多个mRNAs产生的协同效应对治疗可能具有积极意义[1]。作为生物标记物，miRNAs对疾病也具有靶点治疗的潜力，与Argonaute2蛋白(Ago2)或脂蛋白结合稳定，包含在外显子中不易被降解。
此外，miRNAs还是脂代谢的主要调节因子，可以修饰和代谢脂肪组织，在脂肪细胞分化和脂肪发生中发挥重要作用。本文主要介绍miRNAs家族中miRNA-33的生物学功能及其参与脂代谢调控的作用。
1 miRNA-33的生物学功能miRNAs家族因其在调节胆固醇外流和高密度脂蛋白代谢[ATP结合盒运转体A1(ABCA1)和ATP结合盒转运体G1(ABCG1)]、脂肪酸氧化[腺苷酸活化蛋白激酶α(AMPKα)、肉碱棕榈酰转移酶1A(CPT1A)、羟烷基辅酶A脱氢酶β(HADHβ)、ATP酶单磷脂转运子Ⅰ族8B1型(ATP8B1)]及胆汁酸合成[胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)]和分泌[ATP8B1和ATP结合盒转运体B11(ABCB11)]相关基因中的作用而备受关注[2]。
甾醇调节元件结合蛋白(SREBP)[3]转录因子是调节细胞胆固醇和脂肪酸代谢的重要作用因子，而miRNA-33是位于SREBP基因内的一种miRNA。miRNA-33基因包含有miRNA-33a和miRNA-33b，分别位于SREBP基因的SREBP-2和SREBP-1内含子区域[4]。SREBP可以激活诱导它们的表达，而且这2种miRNA-33都与宿主基因共同转录，并受其调控[5]。
miRNA-33正常情况下可提高脂肪酸氧化和胰岛素信号通路代谢途径活性，而miRNA-33过表达则起抑制作用。miRNA-33b与SREBP-1可共同诱导前脂肪细胞分化，miRNA-33b是脂肪发生的重要调节因子，抑制miRNA-33b可促进脂滴的积累。相反，miRNA-33b过表达会抑制前脂肪细胞的增殖，诱导过氧化物酶体增殖物活化受体-γ(PPAR-γ)靶基因的分化[6-8]。
miRNA-33还能够增加啮齿动物和其他灵长类动物循环中的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量。内源性miRNA-33a可负调控血浆高密度脂蛋白(HDL)含量，miRNA-33b可调节脂肪酸β氧化。有研究表明，miRNA-33在大脑中也大量存在，糖尿病动物大脑中的胆固醇代谢会受到损害，这表明miRNA-33在脑胆固醇代谢中也具有一定的潜在作用[9]。
2 脂代谢的过程及调控脂肪是体内能量贮存的主要形式，在维持细胞的完整性方面具有非常重要的作用。脂代谢是指生物体内脂肪在相关酶的作用下，对脂肪的消化吸收、合成分解的过程，保证机体机能正常运作。脂代谢主要分为甘油三酯、磷脂、胆固醇、脂蛋白这4类脂类物质的代谢。
脂肪的生成受到多种脂肪细胞选择性miRNAs和调节脂肪细胞增殖和分化的转录因子调控的作用。有研究发现，miRNAs在转录后能够调控脂质相关基因的表达水平，目前已经确定了一些miRNAs，包括miRNA-33、miRNA-122和miRNA-148a等。这类miRNAs具有参与脂肪细胞分化和成熟脂肪细胞的功能，在脂肪形成过程中，miRNAs通过作用于转录因子，促进或抑制脂肪细胞的分化，调节与脂肪发生相关的信号通路来控制胆固醇和脂代谢的稳态，在脂代谢方面发挥着重要的作用[10]。miRNA-33是miRNAs家族中重要的脂代谢调节因子，主要通过参与脂肪酸合成、脂质积累、胆固醇及胆汁酸代谢、SREBP-1的表达以及由胰岛素抵抗与衰老引起脂代谢异常的调控等环节参与脂代谢的调控。
3 miRNA-33对脂代谢的调控作用 3.1 miRNA-33参与脂肪酸氧化及合成的调节脂肪酸β氧化是脂代谢过程中的关键步骤，促使脂肪降解成水、二氧化碳并释放能量。研究证明，miRNA-33影响胆固醇代谢时能够抑制脂肪酸氧化蛋白HADHβ和CPT1A的表达水平。而且miRNA-33过表达减少了线粒体20%的β氧化，细胞内游离脂肪酸和胆固醇含量显著增加。miRNA-33参与脂肪酸β氧化的目标基因包括肉碱O辛酰转移酶(CROT)、CPT1A、HADHβ和AMPKα，而miRNA-33b显著抑制荧光素酶构建体CROT、CPT1A、HADHβ和AMPKα的3′端非翻译区(3′-UTR)活性以及mRNA表达。相反，表达anti-miRNA-33b的小鼠表现出CROT、CPT1A、HADHβ和AMPKα表达适度增加。评估miRNA-33对脂肪酸β氧化的影响显示，miRNA-33过表达显著降低Huh7细胞中的脂肪酸β氧化，积累更多甘油三酯。相反，抑制内源性miRNA-33表达增加脂肪酸氧化速率。另有研究表明，miRNA-33缺陷症增加了肝脏和脂肪组织中的SREBP-1含量、脂肪酸合成和脂肪酸积累。在饮食诱导的肥胖小鼠模型中证明，miRNA-33治疗性沉默促进全身氧化代谢[11]。
由于miRNA-33b只在大型哺乳动物中编码，鸡中的miRNA-33编码于SREBF-2的第16内含子内，因此只有miRNA-33a表达，其序列和基因组位置在进化过程中均保持保守[12]。鸡体内脂肪酸的从头合成主要发生在肝脏，miRNA-33可能通过负性调控肝脏中CROT和HADHβ的表达参与鸡的脂代谢和能量稳态。miRNA-33通过miRNAs靶蛋白预测程序“miRanda”和“TargetScan”编码脂肪酸氧化已知关键酶的CROT和HADHβ，后二者被推测为是miRNA-33的潜在靶点。在共转染和双荧光素酶报告基因检测中显示，鸡基因组的3′-UTR的CROT和HADHβ的表达会被miRNA-33过度抑制，而当推测的miRNA-33靶点位于CROT和HADHβ时，这种抑制被完全取消。试验用miRNA-33 mimics转染鸡肝癌细胞(LMH)，驱动miRNA-33过表达。这种增加与mRNA和蛋白水平上的CROT和HADHβ的减少有关。耐药LMH-逆转录病毒载体(pLNCX)-miRNA-33细胞中靶基因表达降低，miRNA-33表达明显升高[13]。
相比之下，转染miRNA-33的抑制剂anti-miRNA-33后，原发性鸡肝细胞中CROT的表达上调。定量逆转录-PCR(RT-PCR)研究结果显示，miRNA-33在鸡肝脏中表达量在0~49日龄呈上升趋势，而CROT和HADHβ的mRNA水平在同一时期呈下降趋势[13]。将锁核酸(locked nucleic acid，LNA)-anti-miRNA-33转染鸡肝细胞后，miRNA-33表达下降44%，而这一下降显著增加了CROT的表达，但与抑制miRNA-33时的HADHβ表达水平无关。该抑制结果提示，miRNA-33在原代鸡肝细胞中表达不完整，相对表达水平较低。这些转录可能受到其他miRNA的平行抑制。
有研究发现，miRNA-33还可以靶向调控鹅的CROT和HADHβ[14]。通过抑制miRNA-33可减少动脉斑块中的脂质积累，提高循环HDL含量。在诱导小鼠过度饮食致肥胖的模型中，抑制miRNA-33可促进脂肪酸氧化而不影响代谢功能障碍[15]。
3.2 miRNA-33参与脂质积累的调节miRNA-33能够通过调控鸡的肥胖基因(FTO)参与脂代谢和能量平衡，从而控制脂质积累[16]。对miRNA-33和FTO在雏鸡肝脏组织中相互作用的研究发现，LNA-ant-miRNA-33转染鸡肝细胞可使miRNA-33的表达降低，同时FTO mRNA表达增加，这些数据表明miRNA-33对鸡肝脏FTO mRNA表达具有负调控作用。内源性miRNA-33在原代鸡肝细胞中的表达与FTO mRNA表达上调有关。此关联的研究证明，miRNA-33能够靶向调控鸡肝细胞FTO mRNA。研究还发现在大多数发育阶段，miRNA-33和FTO mRNA在鸡肝脏中的表达呈负相关。这种关系使miRNA-33存在负调控鸡肝脏FTO mRNA表达的可能性，但在35和42日龄时，miRNA-33和FTO mRNA表达无显著负相关，这表明FTO mRNA在2个不同年龄阶段的表达可能主要受miRNA-33以外的其他机制的调控[17]。
参与能量平衡调节的鸡下丘脑中有FTO mRNA表达，且FTO可对营养控制发生反应，例如禁食也会增加FTO mRNA在大脑、肝脏、乳房肌肉和皮下脂肪中的表达，喂养状态的改变也会导致其表达量显著变化。此外，代谢状态的变化也会改变肝脏FTO，葡萄糖可以降低肝脏FTO mRNA表达，说明miRNA-33可能通过抑制FTO mRNA的表达，在调节鸡肝脏营养代谢中起重要作用[18]。
3.3 miRNA-33参与胆固醇及胆汁酸代谢的调节胆固醇是细胞膜的重要结构成分。同时，胆固醇也是胆汁酸、类固醇激素和维生素D等的生物合成前体。哺乳动物细胞需通过胆固醇逆向转运(RCT)去除自身不可降解的胆固醇。在RCT过程中，多余的胆固醇从周围组织转运到肝脏，在肝脏中可以被再利用或排除[18-19]。HDL及其主要蛋白组分载脂蛋白AI(apolipoprotein AI，ApoAI)是胆固醇通过ABCG1和ABCA1外排后，能够促进胆固醇从外周细胞向肝脏动员的主要固醇转运蛋白[19-20]。HDL受体清除剂受体B类1型(SR-B1)通过增加巨噬细胞的胆固醇外排量和肝细胞摄取HDL-C，进而介导RCT向胆汁转移[21]。常见的ABCB11、ATP结合盒转运体B4(ABCB4)和ATP结合盒转运体G5/G8(ABCG5/G8)等在胆汁分泌过程中发挥着重要作用。
miRNAs是HDL-C代谢的关键调控因子。通过抑制miRNA-33会增加线粒体呼吸和上调ATP产生，miRNA-33目标基因包括过氧物酶体扩散激活受体γ共激活剂1-α(PGC1-α)、丙酮酸脱氢酶激酶同工酶4(PDK4)和溶质载体家族蛋白25成员A25(SLC25A25)，并促进ABCA1介导胆固醇流出[22]。RCT介导泡沫细胞的胆固醇外排可预防动脉粥样硬化病变的进展，并诱导已有斑块的消退。miRNA-33除了具有调节胆固醇外排和HDL的生物发生，其在调节胆汁酸合成和分泌中也有一定的作用。胆固醇和胆汁酸在不依赖miRNA-33调节ABCA1/ABCG1表达能力的同时可以通过RCT调节来降低循环中的胆固醇含量，通过ABCB11和ATP8B1调控胆汁酸转运体的表达，miRNA-33的沉默能够导致胆汁中甾醇的增加和体内RCT的增强[23]。
在细胞内胆固醇含量较低的条件下，miRNA-33a通过与SREBP-2共转录，抑制ABCA1、ABCG1以及溶酶体蛋白C型1类尼曼-匹克蛋白(niemann-pick C1，NPC1)表达，减少胆固醇输出，从而提高细胞胆固醇含量。同样，当SREBP-1c在高胰岛素血症或胰岛素抵抗期间被诱导时，哺乳动物中miRNA-33b被共转录，通过靶向CROT、HADHβ、CPT1A表达来减少细胞脂肪酸氧化。
3.4 miRNA-33参与SREBP-1的表达miRNA-33可以调控SREBP-1的表达，其缺失会激活和增加肝脏SREBP-1的表达水平[24]。SREBP-1表达水平的升高可能会导致miRNA-33缺陷小鼠出现明显的肥胖、血脂异常和胰岛素抵抗，而SREBP-1a和SREBP-1c转基因小鼠的体重和循环脂质受到的影响不大。也有研究发现，在敲除SREBP-1的杂合小鼠中，miRNA-33的缺失并不影响体重或肝脏脂肪变性[25]。虽然SREBP-1及其靶基因在缺乏miRNA-33的细胞和组织中的表达经常发生改变，但这种现象并不表明miRNA-33直接靶向SREBP-1。
通过高脂肪食物喂养miRNA-33基因敲除小鼠后，其循环甘油三酯含量增加，肝脏中脂质含量增加。但就目前的研究数据暂不支持SREBP-1在促进这些变化中的直接作用[26]。该研究还表明，miRNA-33完全性基因敲除小鼠的肥胖表型可能是通过其在多个代谢组织中的作用以及对SREBP-1以外其他基因的调控介导的。对组织特异性miRNA-33敲除小鼠的进一步研究将有助于分析miRNA-33在其他几个代谢组织中的特异性作用，对miRNA-33缺陷导致小鼠显著肥胖和胰岛素抵抗表型的影响将会有所帮助。
3.5 miRNA-33参与动脉粥样硬化的调节脂代谢的改变会增加心脏代谢紊乱的风险，造成心血管疾病(CVD)发生。而脂质紊乱的治疗是降低CVD发生率的最常见方法。miRNA-33以ABCA1为靶点，通过将胆固醇外排衰减到ApoA1和新生成HDL来抑制HDL的合成。在低密度脂蛋白受体缺失(LDLR2/2)小鼠中，缺失miRNA-33会使血浆中HDL-C含量提高，并促使胆固醇逆向转运。研究表明，抗miRNA-33治疗会减轻LDLR2/2小鼠动脉粥样硬化的进展，并增强了动脉粥样硬化的消退[27]。载脂蛋白E (ApoE)基因敲除小鼠通过miRNA-33的拮抗作用可以增加巨噬细胞的线粒体功能，降低ABCA1表达，结合后可促使巨噬细胞胆固醇外排增加，而敲除miRNA-33可显著降低动脉粥样硬化。抗miRNA-33治疗动脉粥样硬化性ApoE基因敲除小鼠，既使循环脂质含量不受影响，也可降低斑块大小。
近些年来已经确定了许多种类的非编码RNA分子，包括miRNAs、长链非编码RNA(long-non-coding RNA，lncRNAs)，它们是参与脂代谢和CVD基因表达的关键调控因子，主要作用于转录后水平调控。miRNA-33等多种miRNA通过调节胆固醇稳态和脂蛋白代谢可控制CVD。
4 小结与展望综上所述，miRNA-33可通过靶向脂代谢的关键转录调控因子，在脂肪酸氧化、脂质积累、调节HDL-C代谢、RCT和动脉粥样硬化进展方面发挥重要作用。此外，miRNA-33的缺失可能会导致肥胖和胰岛素抵抗的发生，造成肝脏脂质积累增加，影响相关基因的表达，代谢功能受损。可见，miRNA-33的生物学功能十分强大，但还存在很多待发现和解决的问题，相信未来在miRNA-33对脂代谢作用机制方面会有更加全面完善的深入研究。
| [1] |
THOMOU T, MORI M A, DREYFUSS J M, et al. Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues[J]. Nature, 2017, 542(7642): 450-455. DOI:10.1038/nature21365 |
| [2] |
SAHEBKAR A, WATTS G F. Developing role of microRNA-33 in lipid metabolism and atherosclerosis[J]. Current Opinion in Lipidology, 2016, 27(2): 197-199. DOI:10.1097/MOL.0000000000000286 |
| [3] |
PRICE N L, HOLTRUP B, KWEI S L, et al. SREBP-1c/MicroRNA 33b genomic loci control adipocyte differentiation[J]. Molecular and Cellular Biology, 2016, 36(7): 1180-1193. DOI:10.1128/MCB.00745-15 |
| [4] |
GERIN I, CLERBAUX L A, HAUMONT O, et al. Expression of miR-33 from an SREBP2 intron inhibits cholesterol export and fatty acid oxidation[J]. Journal of Biological Chemistry, 2010, 285(35): 33652-33661. |
| [5] |
TARLING E J, AHN H, DE AGUIAR VALLIM T Q. The nuclear receptor FXR uncouples the actions of miR-33 from SREBP-2[J]. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 2015, 35(4): 787-795. DOI:10.1161/ATVBAHA.114.304179 |
| [6] |
VINCENT R, SANYAL A. Recent advances in understanding of NASH:MicroRNAs as both biochemical markers and players[J]. Current Pathobiology Reports, 2014, 2(3): 109-116. DOI:10.1007/s40139-014-0049-8 |
| [7] |
LINSEL-NITSCHKE P, TALL A R. HDL as a target in the treatment of atherosclerotic cardiovascular disease[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2005, 4(3): 193-205. DOI:10.1038/nrd1658 |
| [8] |
NAJAFI-SHOUSHTARI S H, KRISTO F, LI Y X, et al. MicroRNA-33 and the SREBP host genes cooperate to control cholesterol homeostasis[J]. Science, 2010, 328(5985): 1566-1569. DOI:10.1126/science.1189123 |
| [9] |
GOEDEKE L, VALES-LARA F M, FENSTERMAKER M, et al. A regulatory role for MicroRNA 33 in controlling lipid metabolism gene expression[J]. Molecular and Cellular Biology, 2013, 33(11): 2339-2352. DOI:10.1128/MCB.01714-12 |
| [10] |
SINGH A K, ARYAL B, ZHANG X B, et al. Posttranscriptional regulation of lipid metabolism by non-coding RNAs and RNA binding proteins[J]. Seminars in Cell & Developmental Biology, 2018, 81: 129-140. |
| [11] |
张海滨, 朱磊. miRNA-33对脂代谢的调节[J]. 体育世界(学术版), 2018(7): 189-190. |
| [12] |
SHAO F, WANG X G, YU J F, et al. Expression of miR-33 from an SREBF2 intron targets the FTO Gene in the chicken[J]. PLoS One, 2014, 9(3): e91236. DOI:10.1371/journal.pone.0091236 |
| [13] |
SHAO F, WANG X, YU J, et al. Expression of miR-33 from an SREBP2 intron inhibits the expression of the fatty acid oxidation-regulatory genes CROT and HADHβ in chicken liver[J]. British Poultry Science, 2019, 60(2): 115-124. DOI:10.1080/00071668.2018.1564242 |
| [14] |
ZHENG Y, JIANG S B, ZHANG Y H, et al. Detection of miR-33 expression and the verification of its target genes in the fatty liver of geese[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2015, 16(6): 12737-12752. |
| [15] |
KARUNAKARAN D, RICHARDS L, GEOFFRION M, et al. Therapeutic inhibition of miR-33 promotes fatty acid oxidation but does not ameliorate metabolic dysfunction in diet-induced obesity[J]. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 2015, 35(12): 2536-2543. DOI:10.1161/ATVBAHA.115.306404 |
| [16] |
PORITSANOS N J, LEW P S, MIZUNO T M. Relationship between blood glucose levels and hepatic Fto mRNA expression in mice[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2010, 400(4): 713-717. DOI:10.1016/j.bbrc.2010.08.133 |
| [17] |
SHAO F, WANG X G, YU J F, et al. Expression of miR-33 from an SREBF2 intron targets the FTO gene in the chicken[J]. PLoS One, 2014, 9(3): e91236. DOI:10.1371/journal.pone.0091236 |
| [18] |
SHAO F, WANG X G, YU J F, et al. Expression of miR-33 from an SREBF2 intron targets the FTO gene in the chicken[J]. PLoS One, 2014, 9(3): e91236. DOI:10.1371/journal.pone.0091236 |
| [19] |
RADER D J, HOVINGH G K. HDL and cardiovascular disease[J]. The Lancet, 2014, 384(9943): 618-625. DOI:10.1016/S0140-6736(14)61217-4 |
| [20] |
ROSENSON R S, BREWER H B, DAVIDSON W S, et al. Cholesterol efflux and atheroprotection:advancing the concept of reverse cholesterol transport[J]. Circulation, 2012, 125(15): 1905-1919. DOI:10.1161/CIRCULATIONAHA.111.066589 |
| [21] |
LINTON M R F, TAO H, LINTON E F, et al. SR-BI:a multifunctional receptor in cholesterol homeostasis and atherosclerosis[J]. Trends in Endocrinology & Metabolism, 2017, 28(6): 461-472. |
| [22] |
KARUNAKARAN D, THRUSH A B, NGUYEN M A, et al. Macrophage mitochondrial energy status regulates cholesterol efflux and is enhanced by anti-miR33 in atherosclerosis[J]. Circulation Research, 2015, 117(3): 266-278. DOI:10.1161/CIRCRESAHA.117.305624 |
| [23] |
ALLEN R M, MARQUART T J, ALBERT C J, et al. miR-33 controls the expression of biliary transporters, and mediates statin- and diet-induced hepatotoxicity[J]. EMBO Molecular Medicine, 2012, 4(9): 882-895. DOI:10.1002/emmm.201201228 |
| [24] |
ARYAL B, SINGH A K, ROTLLAN N, et al. MicroRNAs and lipid metabolism[J]. Current Opinion in Lipidology, 2017, 28(3): 273-280. DOI:10.1097/MOL.0000000000000420 |
| [25] |
HORIE T, NISHINO T, BABA O, et al. MicroRNA-33 regulates sterol regulatory element-binding protein 1 expression in mice[J]. Nature Communications, 2013, 4: 2883. DOI:10.1038/ncomms3883 |
| [26] |
PRICE N L, SINGH A K, ROTLLAN N, et al. Genetic ablation of miR-33 increases food intake, enhances adipose tissue expansion, and promotes obesity and insulin resistance[J]. Cell Reports, 2018, 22(8): 2133-2145. DOI:10.1016/j.celrep.2018.01.074 |
| [27] |
ROTLLAN N, RAMIREZ C M, ARYAL B, et al. Therapeutic silencing of microRNA-33 inhibits the progression of atherosclerosis in Ldlr-/- mice—brief report[J]. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 2013, 33(8): 1973-1977. DOI:10.1161/ATVBAHA.113.301732 |