2. 湖南今汉药业有限公司, 长沙 410014;
3. 中南大学湘雅药学院, 长沙 410013
2. Geneham Pharmaceutical Co., Ltd., Changsha 410014, China;
3. Xiangya School of Pharmaceutical Sciences, Central South University, Changsha 410013, China
葫芦巴(fenugreek)是属于双子叶植物纲、被子植物门、豆科蝶形花亚科、葫芦巴属的1年生草本植物[1],又名芸香草、香苜蓿。葫芦巴起源于地中海地区,在亚洲和非洲广泛种植,偶尔在欧洲种植[2],在我国主要分布于四川、安徽、河南、新疆等地,且南北各地均有栽培,是一种传统的药食两用资源[3]。葫芦巴的功效取决于其生物活性成分,已分离出100多种植物化学物质,主要包括多糖、皂苷、生物碱、多酚和黄酮类等。葫芦巴含有多酚化合物[4],具有若干有益作用,例如抗氧化[5]、降血糖[6]及降胆固醇[7]作用。葫芦巴籽中含有丰富的油脂,主要是以亚油酸和亚麻酸为主的不饱和脂肪酸[8]。此外,葫芦巴含有大量的纤维、磷脂、糖脂、蛋白质、脂肪、维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素C和多糖等成分,具有极高的营养价值与诸多生理功效[9]。虽然葫芦巴在我国作为中药原料已有很长的历史,但我国对葫芦巴的深度和广度却缺乏研究。
仔猪受到断奶应激,表现出采食量降低、生长速度减缓、饲料报酬降低和腹泻等症状,同时,也给仔猪造成巨大氧化应激反应,这种应激是由于自由基的产生和抗氧化防御系统的有效性之间的不平衡造成的[10]。孙国栋等[11]对胡芦巴提取物体外氧化自由基清除效果进行研究,结果表明胡芦巴取提物对氧化自由基具有较好的清除效果。葫芦巴含有挥发油,带有芳香型气味,会对仔猪产生诱食作用。因此,本试验在断奶仔猪饲粮中添加不同水平的葫芦巴渣及提取物,探讨其对断奶仔猪生长性能、抗氧化功能和血清生化指标的影响,旨在探索葫芦巴渣及提取物在断奶仔猪饲粮中的作用效果及其合理添加比例,从而为饲用抗生素替代品探索提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验所用葫芦巴渣及提取物由湖南今汉药业有限公司提供,3种添加物分别为葫芦巴渣、葫芦巴渣复合物(含0.05%葫芦巴提取物)和葫芦巴渣复合物(含0.10%葫芦巴提取物)。经常规营养成分分析,3种添加物营养水平见表 1。
试验猪为杜洛克与陆川猪的杂交猪,当地称“中里黑猪”,由湖南双峰康源生态养殖公司提供。选择21日龄健康断奶仔猪160头(平均体重5 kg左右),随机分为4组,每组5个重复,每个重复8头猪(公母各占1/2),各组试验仔猪初始体重差异不显著(P>0.05)。对照组饲喂基础饲粮,试验组(Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组)分别在基础饲粮中添加5%葫芦巴渣、5%葫芦巴渣复合物(含0.05%葫芦巴提取物)、5%葫芦巴渣复合物(含0.10%葫芦巴提取物)。预试期3 d,正试期21 d。基础饲粮参照NRC(2012)仔猪营养需要标准并结合生产实践配制,其组成及营养水平见表 2。
本试验在湖南双峰康源生态养殖公司进行。断奶仔猪饲养于全封闭猪舍的半漏缝地板上,试验前对圈舍进行彻底清扫消毒。于每天08: 00、14: 00和20: 00进行饲喂,每次以吃饱后料槽中略有余料为度。试验期间断奶仔猪自由采食和饮水,舍内温度稳定维持在25 ℃左右。所有断奶仔猪均按照猪场的常规管理程序进行免疫驱虫,猪舍进行定期消毒,每天清扫圈舍,保持圈内清洁,舍内自然通风。
1.4 样品采集与处理试验第22天08:00,每个重复选取4头仔猪(即每个组选取20头,共80头,公母各1/2),前腔静脉采血10 mL,静置30 min后,3 500 r /min离心10 min,分离血清,-80 ℃保存待测。
1.5 测定指标及方法 1.5.1 生长性能断奶仔猪在试验开始和结束时分别逐只空腹称重,用于计算平均日增重(ADG);以栏为单位准确记录仔猪的喂料量和余料量,计算仔猪的平均日采食量(ADFI);根据断奶仔猪的ADG和ADFI,计算料重比(F/G)。每日观察断奶仔猪肛门处粪便污染情况和栏上残留粪便的形态,确定腹泻仔猪头数,统计各组断奶仔猪的腹泻率。
1.5.2 血清抗氧化和生化指标严格按照试剂盒(南京建成生物工程研究所生产)方法测定血清抗氧化指标,包括总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和总抗氧化能力(T-AOC)及丙二醛(MDA)含量。MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定,CAT活性采用可见光法测定,T-SOD活性采用羟胺法测定,GSH-Px活性和T-AOC采用比色法测定,详细步骤参考试剂盒说明书。
采用全自动系列化分析仪检测血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)活性及总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、尿素氮(UN)、肌酐(CREA)、葡萄糖(GLU)、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量,详细步骤参考试剂盒说明书。
1.6 数据处理与统计分析试验数据采用Excel 2013进行整理,采用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),采用Duncan氏多重比较法进行差异显著性分析,P < 0.05作为差异显著判断标准。所有结果均以平均值±标准差(mean±SD)表示。
2 结果 2.1 葫芦巴渣及提取物对断奶仔猪生长性能的影响由表 3可知,各组之间断奶仔猪初始体重差异不显著(P>0.05),符合试验要求。Ⅱ组和Ⅲ组断奶仔猪ADFI显著高于对照组(P < 0.05),分别升高了9.22%和9.19%。Ⅱ组和Ⅲ组断奶仔猪ADG与对照组差异不显著(P>0.05);Ⅰ组断奶仔猪ADG显著低于对照组和Ⅲ组(P < 0.05),但与Ⅱ组差异不显著(P>0.05)。Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组断奶仔猪F/G显著高于对照组(P < 0.05)。各组之间断奶仔猪腹泻率差异不显著(P>0.05)。
由表 4可知,各组之间断奶仔猪血清GSH-Px活性差异不显著(P>0.05)。Ⅱ组和Ⅲ组断奶仔猪血清T-AOC及T-SOD、CAT活性显著高于对照组(P < 0.05),Ⅰ组与对照组差异不显著(P>0.05)。Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组断奶仔猪血清MDA含量显著低于对照组(P < 0.05)。
由表 5可知,各组之间断奶仔猪血清AST、ALT活性及TC、TP、ALB、GLO和TG含量差异不显著(P>0.05)。Ⅱ组断奶仔猪血清UN含量显著高于对照组(P < 0.05)。Ⅱ组和Ⅲ组断奶仔猪血清CREA含量显著低于对照组(P < 0.05)。Ⅰ组和Ⅱ组断奶仔猪血清GLU含量与对照组差异不显著(P>0.05),Ⅲ组断奶仔猪血清GLU含量显著低于对照组(P < 0.05)。
仔猪断奶会导致仔猪严重的应激反应,对仔猪肠道造成损失,并且会影响免疫系统,同时消化吸收能力也随之下降,影响仔猪的健康、生长、采食量等[12]。有研究表明,在鱼饲料中添加葫芦巴和地衣芽孢杆菌饲喂3周后,与对照组相比,添加组生长速率和增重显著增加[13]。本试验发现,饲粮中添加葫芦巴提取物对断奶仔猪的ADFI有显著影响,添加葫芦巴渣对ADFI没有改善,添加分别含0.05%和0.10%葫芦巴提取物的葫芦巴渣复合物提高了断奶仔猪ADFI,可能是由于葫芦巴提取物具芳香气味,使饲粮具有较好的适口性,这表明葫芦巴提取物对仔猪具有诱食作用;与对照组相比,Ⅰ组断奶仔猪ADG显著降低,Ⅱ组和Ⅲ组ADG无显著差异,可能是由于断奶仔猪肠道发育不完善,葫芦巴渣中高纤维影响了肠道对营养物质的摄入,使ADG降低,而葫芦巴提取物可提高采食量并促进仔猪生长,从而缓解葫芦巴渣对营养物质摄入所受的影响。也有可能是葫芦巴渣中某些成分对消化酶有一定的抑制作用[14],从而影响营养物质的消化和吸收,但具体的作用机制还需进一步研究。
断奶应激会破坏仔猪小肠绒毛结构的完整性,降低营养物质的消化率,导致仔猪腹泻,从而降低生长性能。本研究中,饲粮添加葫芦巴渣及提取物对断奶仔猪腹泻率没有显著影响,但腹泻率有下降趋势,可能的原因是葫芦巴提取物含有膳食纤维,可以调节机体肠道内的菌群,对形成良好的肠道环境有重要的作用,能够改善断奶仔猪的肠道形态,促进断奶仔猪的免疫发育,从而缓解仔猪断奶应激,对断奶仔猪的生长发育产生有利影响。
3.2 葫芦巴渣及提取物对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响活性氧(ROS)的生成与清除处于内部动态平衡状态,当外源性氧化应激超过机体自身的抵抗能力时,就会降低生物体的抗氧化能力从而导致氧化损伤[15]。在畜牧业生产中,许多因素都会导致氧化应激,从而对畜牧业健康发展造成不利影响。生物体内的抗氧化系统包括酶防御系统(CAT、GSH-Px、T-SOD)和非酶防御系统[谷胱甘肽(GSH)、维生素E和维生素C],在其共同作用下,消除或防止氧化损伤的过量自由基,从而保护机体健康[16-17]。有研究表明,仔猪断奶后会出现肠道功能障碍,抗氧化系统受到抑制,断奶后血清超氧化物歧化酶(SOD)活性降低,MDA含量升高,与抗氧化酶和消化酶相关的基因在断奶后均有下调[18]。王雅等[19]研究表明,葫芦巴挥发油有较强的还原能力,对1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基有较强的清除能力,而葫芦巴多糖的酸解和酶解产物对超氧阴离子自由基(O2·)和羟基自由基(·OH)有较强的体外清除作用,并且对·OH的清除作用较O2·更为显著[20]。另有研究表明,葫芦巴黄酮也对DPPH自由基有清除能力,显示出具有一定的体外抗氧化活性[21]。Ktari等[22]从葫芦巴种子中分离得到了一种新型的胡芦巴水溶性多糖(fenugreek water-soluble polysaccharide,FWSP),该多糖由葡萄糖酸聚合物组成,研究结果表明,FWSP对脂肪和肌红蛋白氧化有显著的抑制作用,表明FWSP是一种有效的抗氧化剂。Joglekar等[23]研究了葫芦巴籽的成分及抗氧化能力,结果表明葫芦巴籽的还原能力较弱,然而对超氧化物和自由基的清除能力较强。Tanko等[24]研究发现,对高脂血症大鼠饲喂葫芦巴能显著增加其血清CAT、SOD和GSH-Px活性,而MDA含量显著降低,表明葫芦巴可能通过调控糖尿病大鼠抗氧化酶参与抗氧化防御系统的恢复。有研究表明,单独或与益生菌联合使用胡芦巴补充物可被认为是天然抗氧化剂的良好来源,并可作为金头鲷的功能性水产饲料成分[25]。Guardiola等[26]在金边海鲷饲料中加入葫芦巴粉,结果提高了·OH的清除能力,表明葫芦巴提取物具有很高的抗氧化活性。本试验研究中,饲粮中添加葫芦巴提取物显著提高血清T-SOD和CAT的活性,显著降低了血清MDA含量,与以上报道相一致。由此说明,葫芦巴渣及提取物的抗氧化能力是多种活性成分之间协同增效的结果,从而维持机体健康,促进生长,对缓解仔猪断奶应激有重要意义。
3.3 葫芦巴渣及提取物对断奶仔猪血清生化指标的影响血清生化指标能够反映动物机体代谢和组织细胞通透性,也能够反映机体生理状态和自身的健康状况。ALT和AST均为细胞内酶,是2种重要的氨基酸转移酶,其活性可以在一定程度上反映机体肝脏和心脏的健康状况。本试验研究中,饲粮添加葫芦巴渣及提取物对断奶仔猪血清ALT、AST没有显著影响,表明饲粮添加葫芦巴渣及提取物对仔猪肝脏和心脏无不良影响。血清TP和ALB含量的高低能直接反映机体蛋白质合成代谢的强弱[27],TP含量越高则机体蛋白质合成效率越高,ALB由肝脏合成,能够反映机体营养状态和蛋白质代谢情况。本研究结果表明,饲粮添加葫芦巴渣及提取物对断奶仔猪血清TP和ALB含量没有显著影响,但有升高趋势,表明饲粮添加葫芦巴渣及提取物对断奶仔猪的蛋白质合成、体内代谢及机体健康生产无不良影响。
CREA是动物肌肉分解的主要产物,是肾脏功能强弱的主要评价指标,能反映机体蛋白质分解程度的强弱,而UN是蛋白质分解的最终产物,UN含量的高低可以反映饲粮蛋白质利用率的高低[28]。本试验中,Ⅱ组断奶仔猪血清UN显著高于对照组,这表示断奶仔猪对饲粮的转化率低,表现在生长性能方面则断奶仔猪ADG没有明显变化,这与试验结果一致。葫芦巴提取物对慢性肾功能衰竭大鼠有明显的治疗作用,能降低血清CREA含量,可以有效地减轻肾脏组织的损伤。本试验研究中,Ⅱ组和Ⅲ组断奶仔猪血清CREA含量显著低于对照组,表明饲粮添加葫芦巴渣及提取物可以有效保护仔猪肾脏免受损失。葫芦巴具有明显的降脂作用,其有效成分主要包括葫芦巴中的生物碱、纤维成分、皂苷类物质、4-羟基异亮氨酸等[29]。Jiang等[30]研究表明,胡芦巴的生物活性成分黄酮类化合物,能够降低血清GLU含量,其作用机制可能是通过降低胰岛素抵抗、促进糖异生、保护胰岛细胞和肾脏免受损伤从而发挥对糖尿病的治疗作用。Mukthamba等[31]研究发现,葫芦巴多糖具有降血糖作用。葫芦巴籽的独特活性成分4-羟基异亮氨酸具有促进脂肪细胞和骨骼肌细胞的GLU摄取的作用,从而起到降血糖的作用[32-33]。汪佳琦等[34]研究发现,胡芦巴组分多糖:皂苷:黄酮=3 : 6 : 1的配伍比例对1型糖尿病大鼠的血液GLU含量有更佳的调节作用。仔猪在出生1周后,血液GLU含量会趋于稳定,而仔猪对血液GLU的吸收主要通过小肠黏膜,葫芦巴活性成分能够改善仔猪肠道发育,从而促进血液GLU的吸收。过高或过低的血液GLU含量对仔猪生长发育都是不利的,血液GLU含量过低会导致仔猪机体及脑部发育不健全,也会导致营养摄入不足,造成腹泻,严重时造成死亡;而血液GLU含量过高,会导致仔猪器官发生病变,从而损害仔猪机体健康,适当的血液GLU含量能使机体有效抵御外界不良刺激,有助于提高动物的免疫力,也是体内代谢过程中的重要物质,可以反映机体能量变化。刘正旭[35]研究表明,断奶仔猪饲粮中添加植物提取物能够使血液GLU含量显著下降,可能是由于蛋白质合成代谢增强使得糖代谢供能需求增多所致。本试验结果表明,Ⅲ组断奶仔猪血清GLU含量显著降低,可能是由于机体蛋白质合成代谢增强所致,具体机制有待进一步研究。本研究未发现葫芦巴渣及提取物对血清TG和TC含量有显著影响,与上述报道有出入,可能是因为葫芦巴渣及提取物添加水平过高,导致葫芦巴渣及提取物降脂效果未能表现出来或受到抑制,具体原因有待进一步研究。
4 结论① 饲粮中添加5%葫芦巴渣复合物(分别含0.05%和0.10%葫芦巴提取物)可显著提高断奶仔猪ADFI。
② 饲粮中添加5%葫芦巴渣复合物(分别含0.05%和0.10%葫芦巴提取物)可显著提高断奶仔猪的血清T-AOC及T-SOD、CAT活性,显著降低血清MDA含量,提高仔猪抗氧化能力。
③ 饲粮中添加5%葫芦巴渣复合物(含葫芦巴提取物0.10%)可显著降低血清CREA和GLU含量,保护仔猪肾脏。
④ 在添加葫芦巴渣情况下,添加0.10%葫芦巴提取物比添加0.05%葫芦巴提取物对断奶仔猪的生长性能、抗氧化功能和血清生化指标作用效果较好。
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