目前国内外地方猪种新生期脂代谢情况研究较少,梅山猪作为优良的地方猪种品系,具有环境适应力强、繁殖力高、肌间脂肪丰富等特点,受到国内生猪养殖业广泛关注。研究梅山仔猪脂代谢可为其提供合理的营养调控,对实际生产具有一定意义。不同猪种由于遗传背景、生长所处地理环境、饲养管理等不同,从而造成各自不同的种间特性[1]。前人研究发现,韩国本土猪与西方长白猪脂质代谢存在特定的品种特征[2],伊比利亚-杜洛克杂交猪与纯种伊比利亚猪表型差异与其相关的候选基因、代谢途径和遗传多态性有关[3]。梅山猪属于高脂肪型猪种,杜长大仔猪则属于瘦肉型猪种,造成2个猪种脂肪含量不同可能与肝脏脂代谢功能差异有关。肝脏作为动物体重要的脂质代谢器官,其脂肪生成影响肌肉和胴体中的脂肪沉积[4]。
不同猪种间脂肪酸代谢表达基因存在一定差异[5],其中包括脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)、过氧化物酶体增殖激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ,PPARγ)、激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive triglyceride lipase,HSL)基因等。研究表明,梅山猪肝脏脂质合成基因表达量高于大白猪[6]。中国梅山猪和其他4个猪种群相比基因的多态性和基因型频率存在显着差异[7]。梅山猪的苹果酸酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性均高于大白猪,表明梅山猪的脂肪组织发育早于大白猪[8]。在前人研究梅山猪与大白猪差异的基础上,本文研究其与杜长大仔猪的差异,因杜长大和大白猪具有类似的特性[9],并以2个不同品种新生仔猪脂代谢的比较研究作为切入点,比较两者肝脏脂代谢相关酶及其基因表达有何差异,旨在为梅山猪和杜长大新生仔猪的营养调控提供理论指导,并通过研究地方猪种梅山仔猪的肝脏脂代谢功能特性,为比较不同猪种脂质代谢种间特征提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验对象新生杜长大仔猪[(1.227±0.020) kg],猪种由扬州苏胜生态农业发展有限公司提供;新生正常初生重梅山仔猪[(0.854±0.063) kg],猪种由昆山市梅山猪保种有限公司提供。
1.2 试验设计试验选取预产期相近、第2胎次的梅山猪、长白×大白(长白)妊娠母猪各3头。在其分娩后6 h内,每组新生仔猪中随机选取2头仔猪,总计12头仔猪进行颈动脉放血致死、屠宰取样,测定相关指标。
1.3 饲养管理妊娠母猪分娩前自由采食、自由饮水,基础饲粮按照各自营养需要饲喂,每天清扫圈舍保持圈内洁净,自然通风,日常管理、消毒与防疫生产按照猪场常规程序进行。
1.4 测定指标及方法 1.4.1 血清脂代谢指标血清采集和处理:试验仔猪心脏采血10 mL静置15 min后3 000 r/min离心10 min,取上清得到血清,分装后置于-20 ℃保存待测,测定甘油三酯(triglyceride, TG)、总胆固醇(total cholesterol, TC)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)的含量。
1.4.2 肝脏重量及肝脏指数屠宰解剖取出肝脏,立即用生理盐水洗去表面杂质及血液,滤纸吸干并称重。肝脏指数按公式计算:
称完重后,迅速投入液氮中,随后置于-80 ℃超低温冰箱保存,用于进行后续试验。
1.4.3 肝脏组织结构测定方法制成肝脏组织苏木精-伊红(HE)染色切片,并通过显微镜(Olympus CKX41,日本)拍摄染色部分的代表性图像。使用Image-Pro Plus 6.0软件测量肝细胞的大小。
1.4.4 肝脏脂代谢指标及测定方法取肝脏冻存样品约260 mg,按1 : 9(质量体积比)比例,加入9倍体积的生理盐水,冰水浴条件匀浆,2 500 r/min离心10 min,吸取上清液用于测定肝脏中TC(货号:A111-1)、TG(货号:A110-1)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)(货号:A112-1)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)(货号:A113-1)含量以及总脂酶(total lipase, TLP)、肝脂酶(hepatic lipase, HL)、LPL(货号:A067-1-2)活性。检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,测定步骤按照试剂盒说明书进行。
1.4.5 肝脏脂代谢相关基因及RT-PCR荧光定量方法用Trizol法提取肝脏冻存样品总RNA,反转录为cDNA后待测。用Primer 5.0软件设计磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、FAS、LPL、PPARγ、HSL基因特异性引物,引物序列见表 1,基因特异性引物由金维智生物科技有限公司(GENEWIZ,苏州)合成。各基因的表达水平由内参基因GAPDH进行均一化,用△△Ct法检测实时定量PCR中各基因表达的相对差异。通过检测各脂代谢相关基因和GAPDH在肝脏中的相对表达量,记录Ct值。脂代谢基因在各组织中的表达水平的变化由下面公式求出:
目的基因表达水平=2-△△Ct[△△CT=
(Ct目的基因-CtGADPH)试验组-(Ct目的基因-CtGADPH)对照组]。
反转录及荧光定量试剂盒为TaKaRa(TaKaRa RR047A, TaKaRa RR820A)试剂盒,操作步骤按说明书进行。
1.5 数据处理及分析试验结果数据通过Excel 2013初步计算整理后,采用SPSS 19.0软件对试验数据进行独立样本t检验,以P < 0.05作为差异显著性判断标准,以P < 0.01作为差异极显著性判断标准。试验结果表示为“平均值±标准误”。
2 结果 2.1 血清脂代谢指标差异由表 2可知,新生梅山仔猪血清中TG含量极显著高于新生杜长大仔猪(P < 0.01),新生梅山仔猪与杜长大仔猪血清中TC和LDL含量均无显著差异(P>0.05)。
由表 3可知,新生杜长大仔猪肝脏重量及肝脏指数均极显著高于新生梅山仔猪(P < 0.01)。
图 1-A和图 1-B为新生梅山仔猪肝脏组织HE染色切片,图 1-C和图 1-D为新生杜长大仔猪肝脏组织HE染色切片,由图 1及表 4可知,新生梅山仔猪肝脏细胞面积大小及粒径长短均显著高于新生杜长大仔猪(P < 0.05)。
由图 2可知,新生梅山仔猪肝脏中TC、TG和HDL-C含量均极显著高于新生杜长大仔猪(P < 0.01),新生杜长大仔猪肝脏中LPL活性显著高于梅山仔猪(P < 0.05),新生梅山仔猪肝脏中LDL-C含量及TLP和HL活性与杜长大仔猪相比均无显著差异(P>0.05)。
由表 5可知,新生梅山仔猪肝脏中LPL mRNA表达水平极显著低于杜长大仔猪(P < 0.01),肝脏中FAS mRNA表达水平与杜长大仔猪相比极显著提高(P < 0.01),新生杜长大仔猪肝脏中HSL和PPARγ mRNA表达水平较梅山仔猪差异不显著(P>0.05)。
通过分析血液中脂质含量变化,可以在一定程度上反映机体内脂质代谢情况。不同品种的猪对饲粮中各种营养物质利用能力不同,各种营养物质消化吸收后经过血液运输至全身组织代谢,可以放映机体脂质代谢情况。本研究发现,新生梅山仔猪血清中TG含量极显著高于杜长大仔猪,但两者血清中TC含量相比差异不显著,这可能与仔猪品种以及母体效应有一定关系,Calabuig-Navarro等[10]发现母体脂质代谢物质变化量与转移至胎儿的脂质物质的量相同。还有研究报道,改变泌乳母猪饲粮中脂肪水平,使得仔猪出栏时血液TG含量显著上升[11]。TG是体内脂肪组织的主要成分,在血液中与LDL结合转运,LDL将肝脏合成的脂质运输到机体各组织,梅山仔猪血清TG含量较高,提示这可能是新生梅山仔猪脂肪沉积高于杜长大仔猪的原因之一。通过研究脂质代谢器官肝脏及其相关基因表达量,进一步解释2种不同品种仔猪产生脂代谢差异的原因。
3.2 不同品种新生仔猪肝脏发育差异比较肝脏是一种重要的代谢中枢器官,与动物机体内的各种营养物质代谢有密切关联,尤其对调控体内葡萄糖、脂质、胆固醇等含量变化起着至关重要的作用,具有维持全身代谢稳态的功能。组织和器官发育指数在一定程度上可以反映动物生长发育情况和机体机能状况,对实际生产具有重要意义[12]。研究表明,新生儿对肝脏代谢非常敏感且易受母体影响,此阶段肝脏脂代谢状况将长期影响机体健康[13]。根据器官重量及指数来判断体内器官的发育及病变程度,本试验发现新生梅山仔猪比杜长大仔猪肝脏重量低55.99%,肝脏器官指数低36.36%,新生杜长大仔猪肝脏重量及肝脏器官指数均极显著高于梅山仔猪,说明新生杜长大仔猪肝脏发育情况优于梅山仔猪,这与猪种、体重有着密切关系,新生杜长大仔猪比梅山仔猪体重上升43.68%。李清宏[14]
对獭兔消化器官生长发育规律研究结果表明肝脏重量随体重增加而增加,消化器官重量和体重有紧密联系,并与其他消化器官相比,肝脏对体重的随依性最好。本试验结果与其研究大体一致,但在数据方面存在差异,这与物种差异有一定关系。根据肝脏细胞大小及粒径来判断肝脏的发育情况,推测2猪种间脂代谢功能差异[15],新生梅山仔猪比杜长大仔猪肝脏细胞面积上升23.54%,肝脏细胞粒径上升12.18%,由此推测梅山仔猪肝脏脂代谢功能可能高于杜长大仔猪。不同品种新生仔猪之间肝脏发育状况随初生体重不同而存在一定差异性,肝脏发育情况随体重增加呈现增加趋势,肝脏指数、肝脏细胞面积及粒径可以表观上反映机体发育优差,但说明2猪种间肝脏功能以及脂代谢功能的差异,还需要做进一步的研究。
3.3 不同品种新生仔猪肝脏脂代谢相关酶活性差异比较脂代谢是动物机体内发生的一系列复杂生化反应过程,在各种酶系作用下,脂质进行消化、吸收、合成与分解,生成动物机体所需要的营养物质,为机体进行储能和供能,从而保证动物机体正常生理活动运作[16]。动物机体脂肪酸来源主要是饮食,而本试验2个不同品种新生仔猪脂肪酸来源于母体供应和自身转化,利用糖和蛋白质等营养物质在体内通过三羧酸循环生成TG,作为能量储存于体内。有研究表明,甜菜碱可诱导肥育猪体内中激素和生长因子的变化,通过降低脂肪生成酶活性来抑制脂肪合成,并通过提高HSL活性促进脂肪降解,从而减少脂肪组织质量和改善在胴体特征[17]。LDL可以将肝脏内的胆固醇运输到肝脏外,再进行脂肪合成,从而增加血液内脂质含量;高密度脂蛋白(HDL)可以将肝脏外的胆固醇运输到肝脏内,降低血液中的胆固醇含量[18]。Kim等[19]研究表明饲粮中补充富里酸降低了猪的平均背膘厚度,产生这种变化的原因与HSL活性提高和脂肪组织中LPL活性降低有关。本试验结果表明,新生梅山仔猪肝脏中TG、TC含量均极显著高于杜长大仔猪,肝脏中LPL活性显著低于杜长大仔猪,表明梅山仔猪肝脏合成的TG、胆固醇含量高于杜长大仔猪,进而梅山仔猪肝脏脂肪含量高于杜长大仔猪。同时,梅山仔猪肝脏内HDL-C含量极显著高于杜长大仔猪,可将梅山猪肝脏外多余的胆固醇运输到肝脏内,致使梅山猪血清中TC含量低于杜长大仔猪,与血清脂代谢数据结果一致。结果表明,梅山仔猪肝脏脂质代谢功能优于杜长大仔猪,从而造成2品种间血清脂代谢指标、肝脏脂代谢酶活性存在差异。
3.4 不同品种新生仔猪肝脏脂代谢相关基因表达差异比较本试验中,新生梅山仔猪肝脏FAS mRNA表达水平极显著高于杜长大仔猪。FAS是脂肪沉积关键酶之一,参与脂肪合成过程,在脂肪沉积过程中具有重要作用[20]。动物脂肪沉积需要的脂肪酸多数来自脂肪酸合成,FAS可以催化乙酰辅酶A、丙二酰单酸辅酶A以及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)来实现脂肪酸合成,其基因表达量的多少直接影响TG合成速率[21]。此外,FAS基因脂肪沉积性状和肉质性状的重要候选基因之一,FAS促进肝脏TG合成速率,进而促进脂肪沉积[22]。HSL在动物体内器官及其脂肪组织中表达,是脂肪分解的限速酶[23]。PPARγ具有脂肪组织特异性,能被脂肪酸激活调控某些参与脂质代谢酶的表达[24]。新生梅山仔猪肝脏FAS基因表达量高于杜长大仔猪,说明新生梅山仔猪肝脏中TG合成速率高于杜长大仔猪,致使新生梅山仔猪肝脏中TG、TC等脂质含量高于杜长大仔猪。McNeel等[25]研究发现,脂肪酸结合蛋白、FAS、葡萄糖转运载体4和瘦素基因在脂肪型猪种脂肪组织表达量显著高于瘦肉型猪种,提示基因型是决定脂肪沉积的主要因素。LPL是脂代谢的关键酶,参与脂质代谢,其编码LPL基因可以催化乳糜微粒和极低密度脂蛋白中TG的水解[26]。有研究表明,荣昌猪的脂肪生成(PPARγ、乙酰辅酶A羧化酶和FAS)和脂肪酸摄取(LPL)相关基因的mRNA表达水平较高,而脂肪分解(甘油三酯脂肪酶和HSL)和脂肪酸氧化(肉毒碱棕榈酰转移酶-1B)相关基因在长白猪中表达更高,提示了脂肪型猪种肉质更好的潜在分子机制可能部分归因于脂肪生成和脂肪酸摄取相关基因更高的mRNA表达水平[27]。本试验中,杜长大仔猪肝脏中LPL mRNA表达水平极显著高于梅山仔猪,可促进杜长大仔猪肝脏中TG水解,降低肝脏中TG含量; 梅山仔猪肝脏脂肪酸合成速率高于杜长大仔猪,从而造成2种不同猪种肝脏脂质代谢差异。FAS和LPL基因可以在一定程度上影响脂质代谢,提示基因型的差异可能是引起新生梅山仔猪和杜长大仔猪脂代谢差异的主要原因之一。
4 结论综上所述,新生梅山仔猪肝脏中TG、TC、HDL-C含量均极显著高于新生杜长大仔猪,肝脏LPL mRNA表达水平极显著低于新生杜长大仔猪,而肝脏中FAS mRNA表达水平极显著高于新生杜长大仔猪,提示新生梅山仔猪肝脏脂代谢功能强于新生杜长大仔猪。
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