肌纤维是构成肌肉组织的基本单位,肌纤维的类型及组成对畜禽的生长发育及肉品质起着决定性作用[1-2]。肌纤维的分类方法很多,根据肌纤维所含的代谢酶及其活性差异,肌纤维可被分为以有氧代谢为特征和以无氧糖酵解代谢为特征的两大类[3]。按照不同的酶(三磷酸腺苷酶、琥珀酸脱氢酶)反应可将其分为Ⅰ型肌纤维和Ⅱ型肌纤维;按照肌球蛋白重链(myosin heavy chain, MyHC)亚型的多样性,又可以分为慢速氧化型(Ⅰ型)、快速氧化型(Ⅱa型)、中间型(Ⅱx型)和快速糖酵解型(Ⅱb型)[4]。与组织化学方法相比,MyHC法能更为准确地反映肌纤维之间的差异[5]。这种多种肌纤维类型存在的现象,与动物机体的生理动态转化平衡有关。
畜禽出生以后,其肌纤维数量已基本确定,但肌纤维类型在受到环境因素、年龄因素、营养因素等多种因素影响时会进行相互转化。MyHC亚型转化次序为Ⅰ型↔Ⅱa型↔Ⅱx型↔Ⅱb型[6]。目前的研究多集中在过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α, PGC-1α)等信号分子在肌纤维类型转化中的作用[7-8]。PGC-1α与氧化型肌纤维的形成密切相关[9]。Handschin等[10]发现,PGC-1α基因敲除小鼠会导致其肌纤维由Ⅰ型、Ⅱa型向Ⅱx型、Ⅱb型转化。另有研究表明,PGC-1α的赖氨酸残基会受到乙酰转移酶p300的乙酰化修饰,进而导致PGC-1α的转录活性丧失[11]。
山竹醇(garcinol,化学式为C38H50O6,相对分子质量为602),是由藤黄属植物提取而来的一种黄色晶体化合物,常作为食用色素和增味剂[12],其化学结构与抗氧化活性物质姜黄素相似,都含有酚羟基和β-二酮基团[12]。由于具有抗氧化活性,山竹醇受到人们越来越多的关注[13]。已有研究表明,山竹醇对乙醇诱导的氧化损伤具有改善作用,可能是其增加了机体的内源性抗氧化剂[13]。Kirana等[14]按照100和200 mg/kg的剂量给链脲酶素诱导的2型糖尿病大鼠饲喂山竹醇,结果发现山竹醇能恢复大鼠细胞内谷胱甘肽的水平。Du等[15]的研究表明,山竹醇是组蛋白乙酰转移酶p300的天然抑制剂,能强有力地抑制组蛋白乙酰化酶的活性。目前针对山竹醇的研究大多集中在模型小鼠和细胞方面,且主要是研究其抗氧化活性[16-17],而在畜牧生产中有关山竹醇应用效果的研究鲜见报道。因此,本试验通过在饲粮中添加山竹醇,研究其对生长育肥猪生长性能、肌肉抗氧化能力和肌纤维类型组成的影响,为了解山竹醇的生物学作用及其用作功能性饲料添加剂的可能性提供理论依据和试验证据。
1 材料与方法 1.1 试验材料山竹醇由湖南爱生思生物科技有限公司提供,有效含量为30%。
1.2 试验设计试验选取80日龄左右、健康状况良好且体重[(35.50±1.50) kg]相近的“杜×长×大”三元杂交公猪48头,随机分为4个组,每组12个重复,每个重复1头。试验期共90 d,试验期间,对照组全程饲喂基础饲粮,3个试验组分别在屠宰前30(T1组)、60(T2组)、90 d(T3组)持续饲喂在基础饲粮中添加400 mg/kg山竹醇的试验饲粮;基础饲粮参照NRC(2012)生长育肥猪营养需要配制,其组成及营养水平见表 1。
饲养试验在华中农业大学动物代谢室进行,试验猪饲养在160 cm×90 cm×120 cm的代谢笼中,单笼饲养。转猪前,笼舍用2%~3%氢氧化钠溶液进行彻底杀菌消毒。试验期间尽可能减少与试验无关的应激因素,每天饲喂3次(08:00、14:00、18:00)并记录采食量,自由采食,自由饮水,每周用含2.0%~2.3%有效氯的消毒液对代谢室进行2~3次消毒。代谢室环境温度控制在25~30 ℃,相对湿度控制在40%~60%。
1.4 样品采集与处理试验结束时,每组随机选择6头健康且体重相近的试验猪。将猪只电击晕(220 V),迅速倒挂、屠宰、主动脉放血、取出内脏、劈半,确保每头猪取样时间相同。迅速分离左侧胴体背最长肌,取若干质量约20 g的肉块,-20 ℃保存用于测定背最长肌抗氧化指标;同时在右侧胴体第10肋骨处背最长肌取样,切成约5 g大小分装于15 mL EP管中后液氮速冻,随后-80 ℃冰箱保存,用于组织切片三磷酸腺苷酶(ATPase)染色、肌纤维类型和肌肉生长相关基因mRNA表达量以及PGC-1α和p300活性检测。
1.5 测定指标与方法 1.5.1 生长性能分别在试验开始和结束时以重复为单位对每头试验猪进行空腹称重,试验期间记录每次的投料量和料槽中剩余的料量,以计算每头猪每天的采食量。由此计算试验猪的平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。
1.5.2 肌肉抗氧化指标使用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定背最长肌中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)活性以及总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量,严格按照试剂盒说明书进行检测。
1.5.3 肌纤维类型组织学测定切片制备:将用于组织化学分析的背最长肌样品先从-80 ℃冰箱转入-30 ℃冰箱进行逐步回温,然后沿肌纤维垂直方向进行冰冻切片,设置冻头温度-20 ℃,切片厚度10 μm。参考章涛等[18]的试验方法,制备好的切片经过固定、孵育、氯化钴置换、硫化铵显色等步骤后进行镜检。常规梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。每张切片利用五点法,Ⅰ型肌纤维呈浅灰色或无色,Ⅱ型肌纤维呈深灰或黑色,在显微镜(100×)下观察肌纤维并拍照,用Motic Images Advanced 3.2图像分析软件对各类型肌纤维比例进行统计。
1.5.4 肌纤维类型和肌肉生长相关基因mRNA表达量测定应用MagZolTM Reagent溶液提取生长肥育猪背最长肌总RNA,1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,核酸浓度仪检测RNA的浓度和纯度。对每个样品的RNA浓度做相应的稀释,使其浓度均一。使用反转录试剂盒获取cDNA作为实时荧光定量PCR的模板。根据GenBank提供的基因序列,使用Primer 5.0软件设计引物序列,引物由上海生物工程有限公司合成。目的基因MyHC-Ⅰ、MyHC-Ⅱa、MyHC-Ⅱx、MyHC-Ⅱb、生肌决定因子(myogenic determination gene, MyoD)和内参基因18S rRNA的引物信息如表 2所示。将模板cDNA进行梯度稀释,分别对内参基因和目的基因进行PCR扩增。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的mRNA表达量。
取适量背最长肌,经匀浆器研磨后加入细胞裂解液,取组织裂解液分装。参考万伟等[19]试验方法,使用Fluorometric p300 Assay Kit(Active Motif,Cat.No.81158)测定背最长肌中p300活性。具体检测过程按照说明书指示进行。背最长肌中PGC-1α活性检测步骤按照PGC-1α检测试剂盒(江苏江莱生物科技有限公司)说明书进行。
1.6 数据统计与分析试验数据采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),组间数据存在显著差异时,用Duncan氏法进行多重比较,P<0.05为差异显著。结果以“平均值±标准差”表示。
2 结果 2.1 山竹醇对生长育肥猪生长性能的影响由表 3可知,与对照组相比,各试验组生长育肥猪全程ADG、ADFI和F/G均无显著变化(P>0.05),但ADG和ADFI有提高的趋势。
由表 4可知,与对照组相比,各试验组生长育肥猪背最长肌T-AOC无显著变化(P>0.05),但有提高的趋势;与对照组相比,屠宰前饲喂30 d山竹醇(T1组)对生长育肥猪背最长肌中T-SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量无显著影响(P>0.05),屠宰前饲喂60(T2组)和90 d山竹醇(T3组)显著提高了生长育肥猪背最长肌中T-SOD、GSH-Px、CAT活性(P<0.05),显著降低了背最长肌中MDA含量(P<0.05),但屠宰前饲喂60和90 d山竹醇的2组(T2和T3组)之间背最长肌中上述抗氧化指标均无显著差异(P>0.05)。
生长育肥猪背最长肌三磷酸腺苷酶染色结果见图 1。由表 5可知,与对照组相比,屠宰前饲喂30 d山竹醇(T1组)对生长育肥猪背最长肌Ⅰ型和Ⅱ型肌纤维比例无显著影响(P>0.05),屠宰前饲喂60(T2组)和90 d山竹醇(T3组)则显著提高了Ⅰ型肌纤维比例(P<0.05),显著降低了Ⅱ型肌纤维比例(P<0.05),但T2、T3组之间2种类型肌纤维比例无显著差异(P>0.05)。
由图 2可知,与对照组相比,各试验组生长育肥猪背最长肌中MyHC-Ⅱx基因的mRNA表达量均无显著差异(P>0.05),屠宰前饲喂30 d山竹醇(T1组)对背最长肌中MyHC-Ⅰ、MyHC-Ⅱa和MyHC-Ⅱb基因的mRNA表达量无显著影响(P>0.05),屠宰前饲喂60(T2组)和90 d山竹醇(T3组)显著提高了背最长肌中MyHC-Ⅰ和MyHC-Ⅱa基因的mRNA表达量(P<0.05),显著降低了MyHC-Ⅱb基因的mRNA表达量(P<0.05),但T2、T3组之间上述指标无显著差异(P>0.05)。此外,与对照组相比,各试验组生长育肥猪背最长肌中MyoD基因的mRNA表达量均无显著差异(P>0.05)。
由图 3可知,与对照组相比,屠宰前饲喂30 d山竹醇(T1组)对生长育肥猪背最长肌中p300和PGC-1α活性无显著影响(P>0.05),屠宰前饲喂60(T2组)和90 d山竹醇(T3组)均显著提高了背最长肌中PGC-1α活性(P<0.05),显著降低了p300活性(P<0.05),但T2、T3组之间上述指标无显著差异(P>0.05)。
Lee等[20]研究发现,山竹醇能够以剂量依赖的方式降低高脂饮食诱导的小鼠体重增加和相对内脏脂肪组织的脂肪重量,可添加剂量高达5 000 mg/kg且对小鼠无不良影响。本研究结果表明,虽然在饲粮中添加山竹醇对生长育肥猪的ADG、ADFI和F/G等生长性能指标无显著影响,但对ADG和ADFI有提高的趋势,说明山竹醇对生长育肥猪的生长性能可能有一定的促进作用。
商品猪被宰杀后,其肉品在加工贮存等过程中也会产生大量氧自由基,继而引发脂质过氧化反应,并因此影响肌肉的持水力、肉色、嫩度等肉质特性[21]。研究发现,山竹醇具有很强的自由基清除以及改善机体抗氧化功能的能力[22]。Kirana等[14]在大鼠饲粮中添加山竹醇后显著增加了其红细胞内谷胱甘肽(GSH)的含量。本试验发现,饲粮中添加400 mg/kg山竹醇,在屠宰前饲喂60或90 d均可显著提高背最长肌中T-SOD、GSH-Px、CAT活性,同时显著降低MDA含量,这可能表明背最长肌脂质过氧化降低,山竹醇间接地提高了背最长肌的抗氧化能力。Priyadarsini等[23]研究发现酚羟基具有很强的清除自由基的能力,在抗氧化功能中起决定性的作用。同时,有研究报道,某些营养物质如壳寡糖可通过改善机体的抗氧化能力来改善畜禽的生长性能[24]。山竹醇可能是因其酚羟基基团而具有较强的抗氧化活性,这也可能是山竹醇对生长育肥猪的生长性能有一定促进作用的原因。
仔猪出生后的前20天,肌纤维类型主要是氧化型;20~180日龄阶段,氧化型肌纤维的比例缓慢减少,而酵解型肌纤维比例缓慢增加[25]。有研究报道,家畜肌肉中Ⅰ型、Ⅱa型和Ⅱx型肌纤维含量与肌肉嫩度、色泽、脂肪含量等指标呈正相关,与剪切力呈负相关;而Ⅱb型肌纤维含量与剪切力呈正相关,与其他肉质性状呈负相关[26]。本试验中,三磷酸腺苷酶染色结果表明,生长育肥猪用含400 mg/kg山竹醇的饲粮连续饲喂30 d对背最长肌的肌纤维类型无显著影响,连续饲喂60、90 d则显著改变了背最长肌肌纤维类型组成,提高了Ⅰ型肌纤维的比例,降低了Ⅱ型肌纤维的比例,说明饲喂山竹醇可能需要一定的时间以达到其改变肌纤维组成的作用。MyHC基因表达结果表明,屠宰前饲喂60(T2组)和90 d山竹醇(T3组)对生长育肥猪背最长肌中MyHC-Ⅱx基因的mRNA表达量无显著影响,但是却显著提高了MyHC-Ⅰ、MyHC-Ⅱa基因的mRNA表达量,显著降低了MyHC-Ⅱb基因的mRNA表达量,提示猪肉品质可能得到一定程度的改善,这与对白藜芦醇的研究所得结果[27]有相似之处。畜禽出生以后,肌肉组织的生长主要是肌纤维长度和直径的增加[28]。在肌肉生长相关基因中,MyoD可以促使其他类型细胞转化为成肌细胞并进一步融合为肌管,能通过控制肌纤维的生长和直径的增大来影响肉用动物的产肉性能[29]。本试验中,各组之间生长育肥猪背最长肌中MyoD基因的mRNA表达量均无显著差异,说明山竹醇并不能通过影响MyoD基因的表达进而影响肌肉的生长。
体内体外研究均表明山竹醇是组蛋白乙酰转移酶p300的有效抑制剂[15]。p300属于目前研究最多的p300/CBP家族,可以直接作用于组蛋白和非组蛋白,在转录和代谢调控等方面起着重要的作用[30]。有研究报道,p300可以乙酰化PGC-1α而使其失去转录活性[11, 31]。Handschin等[10]研究发现,PGC-1α敲除小鼠其肌纤维由Ⅰ型、Ⅱa型向Ⅱx型、Ⅱb型转化。本试验中,屠宰前饲喂60或90 d山竹醇有效抑制了生长育肥猪背最长肌中p300的活性,提高了PGC-1α的活性,并发现肌纤维类型组成发生了改变,说明饲喂山竹醇可能需要一定的时间才能达到改变肌纤维组成的作用。近年来的研究发现,植物提取物如白藜芦醇能通过增强沉默调节蛋白1(SIRT1)-PGC-1α轴活性而激活PGC-1α,进而提高Ⅰ型及Ⅱa型肌纤维比例[32-33]。因此,本研究中山竹醇通过调控背最长肌中p300的活性,进而影响PGC-1α的活性表达,这可能是山竹醇改变生长育肥猪背最长肌肌纤维类型的潜在机制。
4 结论综合以上结果可知,山竹醇提高了生长育肥猪的肌肉抗氧化能力,增加背最长肌中Ⅰ型肌纤维比例,且具有生理阶段效应。
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