全球经济建设飞速发展，人类对不可再生资源的肆意使用，使得有毒有害气体对全球环境造成了严重危害。所以可再生资源的有效利用引起了科学家们的关注。纤维素是自然界存量最多的可再生资源，由D-葡萄糖通过β-1, 4-糖苷键连接而成[1-2]，是地球上分布最广、含量最多的一种多糖。纤维素主要通过植物的光合作用产生[3]，在自然界中，纤维素的降解是碳素循环的关键[4]。纤维素的利用与转化对解决资源危机以及人类的可持续发展具有重要意义。但纤维素分子结构极其稳定，很难被有效降解和利用。通过生物酶降解是利用纤维素的一种较为理想方式，能很好地起到降低经济成本和保护环境的作用[5]。纤维素酶(CMCase)属于糖苷水解酶家族，其在真菌、细菌、植物、动物体内均有不同表现形式[6]，其中通过动物体内真菌、细菌所产CMCase来降解纤维素，并克隆CMCase相关基因用于重组菌的构建已被科学家们广泛研究[7-8]。随着现代生物技术、基因重组技术的大力发展，外源CMCase基因已经成功在不同模式的宿主菌株中表达，如大肠杆菌(Escherichia coli)、乳酸杆菌、里氏木霉等[9-10]。
桑天牛(Apriona germari)属于昆虫纲，鞘翅目，天牛科，在我国分布广泛，是许多树木、花卉的主要害虫之一，但它可以通过降解纤维素来促进农业生态系统的平衡。CMCase可由细菌产生，由于细菌生长速度快，便于作为研究对象，因此科学家们对细菌所产CMCase产生了浓厚的兴趣。桑天牛成虫最喜蛀食树皮来获取营养成分，故该天牛具有较强的纤维素分解能力，考虑到其潜在作用，故本试验选取了桑天牛作为研究对象。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有编码分泌优良酶的基因，故被认为是CMCase有效的生产者，且枯草芽孢杆菌作为常见菌株，耐受力佳，更具研究意义。CMCase是把纤维素降解为葡萄糖的酶的总称，根据作用机理分为3类，分别是内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，3种CMCase各司其职将纤维素大分子降解为生物可以吸收利用的葡萄糖[11-12]。枯草芽孢杆菌作为好氧革兰氏阳性杆状细菌，它不会产生毒素，是一种无致病性的安全微生物，易于存活，是良好的基础研究试验菌种。
乳酸杆菌嗜酸性，因发酵产生乳酸而得名[13]，是一类生活在机体内益于宿主健康的微生物，它可以调节机体免疫功能以及维护机体的健康。近年来，重组微生物技术迅速发展，乳酸杆菌被大量学者选作基因工程宿主菌，构建重组菌来表达各种目的基因[14]，这在生产实践中具有极其重要的应用价值。
本试验从桑天牛体内获取的枯草芽孢杆菌中克隆了内切葡聚糖酶基因，并与乳酸杆菌成功构建重组菌，从而使得重组菌既有传统乳酸菌发酵饲料提高粗饲料品质、适口性的作用，同时又能发挥降解纤维素的功能。之后对表达产物进行了酶学性质研究以及粗饲料发酵试验，充实了乳酸杆菌重组菌的研究数据，为提高粗饲料的利用提供了试验依据，同时为相关试验提供一定的参考价值。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 菌株与质粒质粒pMP(含乳酸菌组成型启动子P32和信号肽SPlp0373)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并保存于实验室；乳酸杆菌质粒pLEM-415、大肠杆菌DH5α及感受态和罗伊乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)及感受态均由本实验室保存；枯草芽孢杆菌分离于桑天牛体内。
1.1.2 主要培养基固体筛选培养基：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)10 g/L、蛋白胨2 g/L、酵母膏0.5 g/L、K2HPO4 1.5 g/L、Na2SO4 2.5 g/L、琼脂20 g/L。
种子培养基：牛肉膏1 g/L、蛋白胨0.3 g/L、NaCl 0.5 g /L。
发酵产酶培养基：CMC-Na 7.5 g/L、蛋白胨3 g/L、酵母膏0.5 g/L、KH2PO4 2 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、CaCl2 0.3 g/L。
MRS培养基：酵母提取物5 g/L、牛肉膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、K2HPO4 2 g/L、MnSO4 0.25 g/L、吐温-80 1 mL/L、葡萄糖5 g/L、MgSO4 0.58 g/L、柠檬酸三胺2 g/L、乙酸钠5 g/L。
1.1.3 主要试剂限制性内切酶、T4 DNA连接酶等购于TaKaRa(大连)公司；DNA凝胶回收、质粒提取试剂盒购于北京全式金生物技术公司；细菌全基因组DNA提取试剂盒购于美国OMEGA BIO-TEK公司。
1.2 试验方法1.2.1桑天牛肠道产CMCase细菌的分离鉴定将前期试验制备的桑天牛体内肠道悬液10-5稀释液100 μL涂板于固体筛选培养基，37 ℃培养30 h，待单克隆长成后接种于种子培养基中，重复以上步骤直至获得形状近似的纯化菌株。最后用1%刚果红在固体筛选培养基中染色15 min，用1 mol/L NaCl溶液洗脱15 min，若观察到菌落周围有水解圈，则可判定是产CMCase菌株，取较大水解圈的2株菌株分别命名C1、C2，菌液交由北京擎科新业生物技术公司进行16S rDNA测序种属鉴定。
1.2.2 目的菌株内切葡聚糖酶活性测定将C1、C2接种至发酵产酶培养基，在摇床37 ℃条件下发酵培养获得粗酶液，在不同时间测定内切葡聚糖酶活性。
CMCase活性采用DNS法测定[15]：配制1 mg/mL的葡萄糖母液，以0.2 mL为梯度，分别取0~2 mL放入比色管中，不足2 mL则用蒸馏水补足2 mL，随后加入2 mL 3，5-二硝基水杨酸溶液摇匀，沸水浴5 min，冷却后用蒸馏水定容至10 mL，以对照管调零，于540 nm波长测定吸光度(OD)值，根据OD540值和对应葡萄糖含量绘制标准曲线。测定内切葡聚糖酶活性时，在比色管中加入500 μL粗酶液与1% CMC-Na磷酸盐缓冲液作为底物，50 ℃保温5 min，随后迅速加入2 mL 3，5-二硝基水杨酸溶液，沸水浴5 min。冷却后加蒸馏水定容至10 mL。根据葡萄糖含量标准曲线计算内切葡聚糖酶活性。内切葡聚糖酶活性单位定义：一定条件下，每分钟与CMC-Na反应生成1 μmol还原糖所需要的酶量，单位为U/mL。
1.2.3 目的基因的扩增取内切葡聚糖酶活性较高的菌株——枯草芽孢杆菌作为后续试验对象，提取枯草芽孢杆菌全基因组DNA作模板，根据GenBank公布的枯草芽孢杆菌内切-β-1, 4-葡聚糖酶基因序列(ID:KT992142.1)设计特异性引物NqmF、NqmR，克隆其内切葡聚糖酶基因，命名Nqm。同时利用引物P32F、P32R和SPF、SPR扩增乳酸杆菌启动子P32和信号肽SPlp0373，引物由北京擎科新业生物公司合成，引物序列见表 1(下划线为保护碱基，大写表示酶切位点)。
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表 1 引物序列 Table 1 Primer sequence |
PCR反应体系12.5 μL：cDNA模板1 μL、正反向引物各0.5 μL、Taq MasterMix(康为)6.5 μL、ddH2O 4 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，退火温度时间如表 2，退火时间30 s，72 ℃延伸时间如表 2，进行38个循环；72 ℃延伸5 min；最后4 ℃保温10 min。
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表 2 PCR退火温度和延伸时间 Table 2 Annealing temperature and extension time of PCR |
使用SpeⅠ和BamHⅠ限制性内切酶对pLEM-415载体与启动子P32扩增产物进行双酶切，再利用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态中，经抗性平板筛选阳性菌落提质粒测序。将测序鉴定正确的重组质粒命名为pLEM-P32。测序均由北京擎科生物公司完成。
使用相同方法用对应的限制性内切酶对pLEM-P32载体与信号肽SPlp0373扩增产物进行酶切，连接，转化，提质粒测序验证，将正确构建的质粒命名为pLEM-P32SP。
最后，将质粒pLEM-P32SP与扩增出的内切葡聚糖酶基因片段Nqm经SacⅡ和SacⅠ双酶切，连接，转化，提质粒鉴定后，获得最终重组质粒pLEM-P32SPNqm。
1.2.5 重组乳酸杆菌的构建与表达使用Eppendorf电转化仪，在电压2 500 V、电击时间5 ms的条件下将重组质粒pLEM-P32SPNqm转化至罗伊氏乳酸杆菌感受态细胞中，将电转化产物涂布于含红霉素抗性的MRS固体培养基，培养后提取质粒测序同时进行SacⅠ、SacⅡ双酶切鉴定。
将重组菌在MRS培养基中37 ℃、厌氧、静置培养过夜，离心10 min分别收集上清液和菌体沉淀。使用磷酸盐缓冲液重悬菌体沉淀，利用超声波裂解(频率20 kHz，破碎4 s，休息5 s，运行15 min)使菌液澄清透亮。再使用Millipore 10 ku规格超滤管，将上清液及澄清菌体液进行蛋白浓缩。最后，各取20 μL上清液和超声波破碎溶液加入适量上样缓冲液，沸水浴10 min后，在电压90 V、电泳时间180 min条件下进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白的表达。
1.2.6 重组蛋白酶学性质研究将重组乳酸杆菌在MRS培养基中培养，分别于30、37、45 ℃培养，于30 h后测定菌内CMCase活性，确定其最佳产酶温度。在最佳产酶温度下再次培养重组乳酸杆菌，分别在不同时间段测定CMCase活性，确定其最佳产酶时间。在最佳产酶时间和温度下收集粗酶液。不同温度、pH条件下，测定产酶最适反应温度、pH、热稳定性、pH耐受性，将粗酶液与含有5 mmol/L的常见金属离子溶液混合，以无添加金属离子的底物作为对照组，即CMCase相对活性为100%，反应5 min后测定酶活性以确定不同金属离子对该酶的影响。每1次试验测定均独立重复3次。
CMCase活性测定方法同1.2.2。
1.2.7 重组乳酸杆菌粗饲料发酵试验将15 mL重组乳酸杆菌菌液、15 mL蒸馏水以及80 g粉碎后过1 mm筛的苜蓿秸秆加入到厌氧发酵袋中混匀作为试验组，对照组将重组乳酸杆菌换为野生型罗伊斯乳酸杆菌，试验组和对照组各进行3个重复试验，在37 ℃培养箱发酵5 d。使用ANKOM 200i半自动纤维分析仪(美国)测定各组粗饲料的中性酸性洗涤纤维、酸性洗涤纤维质量分数，试验组纤维含量相对于对照组所减少的部分与对照组纤维含量之比即为中性(酸性)洗涤纤维相对降解率。采用同样方法测定重组菌对小麦秸秆和玉米秸秆相对降解率。
1.3 统计分析所有的试验数据利用Excel 2016作初步整理，再利用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA, LSD)，所有结果均以平均值±标准差(±SD)表示，以P < 0.05作为差异性显著的判断标准。
2 结果与分析 2.1 产CMCase细菌鉴定及其酶活性测定将测序结果在NCBI进行Blast分析，结果见表 3，可知C1、C2菌株分别是枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。将纯化的菌株在发酵培养基上培养，每隔12 h测定酶活性(图 1)。C2(苏云金芽孢杆菌)发酵的96 h内其内切葡聚糖酶活性一直在0.7 U/mL波动，从未超过1 U/mL，而C1(枯草芽孢杆菌)在发酵的4 d内，酶活性相对较高，在36 h达到2.091 U/mL的峰值。因此认定，C1(枯草芽孢杆菌)的CMCase降解能力较强。所以后续试验以枯草芽孢杆菌为研究对象，克隆其内切葡聚糖酶基因进行重组乳酸杆菌的构建。
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表 3 2株桑天牛体内纤维素降解菌的种属鉴定 Table 3 Attribute identification of two cellulose-degrading bacteria in Apriona germari |
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C1：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis；C2：苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis。 图 1 2株菌在不同发酵时间的酶活性 Fig. 1 Enzyme activity of two strains at different fermentation time |
扩增后的目的片段Nqm、P32、SPlp0373进行1%琼脂糖凝胶电泳，分别得到1 490(图 2-A)、120(图 2-B)、120 bp(图 2-C)的目的条带，与预期大小相符。
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M: DL 2000标记DL 2000 marker；A：Nqm基因Nqm gene；B：P32基因P32 gene；C：SPlp0373基因SPlp0373 gene。 图 2 目的片段Nqm、P32、SPlp0373 PCR产物凝胶电泳图 Fig. 2 Gel electrophoretogram of PCR products Nqm, P32 and SPlp0373 |
重组质粒pLEM-P32SPNqm测序结果显示P32基因长度为125 bp，无突变；SPlp0373基因序列长度为123 bp，无突变；Nqm基因长度为1 490 bp，与枯草芽孢杆菌内切-β-1, 4-葡聚糖酶基因(ID:CP021903.1)的相似性为99%。对重组质粒进行SacⅠ、SacⅡ双酶切鉴定，得到约1 500 bp的条带，与预期目的片段大小相符(图 3)。
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M: DL 2000标记DL 2000 marker；1：重组质粒pLEM-P32SPNqm SacⅠ、SacⅡ酶切鉴定pLEM-P32SPNqm digested by SacⅠ and SacⅡ。 图 3 重组乳酸杆菌SacⅠ、SacⅡ双酶切鉴定 Fig. 3 Sac Ⅰand Sac Ⅱdouble enzyme digestion identification of recombinant Lactobacillus |
SDS-PAGE分析显示，重组乳酸杆菌菌体蛋白(图 4-A)和上清蛋白(图 4-B)均在54 ku处显示出条带，与预期大小一致。判定其为重组蛋白产物。
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A：M为蛋白标记，泳道1和2分别为野生型罗伊乳酸杆菌(LR)和重组乳酸杆菌菌体蛋白SDS-PAGE图M was protein marker, and lanes 1 and 2 were LR and the SDS-PAGE of bacterial protein, respectively；B：M为蛋白标记，泳道1和2分别为LR和重组乳酸杆菌上清蛋白的SDS-PAGE图M was protein marker, and lanes 1 and 2 were LR and the SDS-PAGE of supernatant protein, respectively。 图 4 重组蛋白SDS-PAGE分析 Fig. 4 Analysis of recombinant protein SDS-PAGE |
由图 5-A可知，重组乳酸杆菌在37 ℃达到最高酶活性1.97 U/mL，培养温度高于或低于37 ℃产酶量均会降低，所以该重组菌最佳产酶温度为37 ℃。测定重组菌在不同发酵时间的CMCase活性(图 5-B)，重组菌生长至24 h时，酶活性逐渐升高直至2.06 U/mL。之后的18 h酶活呈现下降趋势，在42 h后，CMCase活性维持在1.6 U/mL左右，最佳产酶时间为24 h。
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A：不同温度条件培养30 h后重组菌的CMCase活性CMCase activity of recombinant strain after 30 h culture at different temperature conditions；B:37 ℃不同时间内重组菌的CMCase活性CMCase activity of recombinant strain at 37 ℃ for different time。 图 5 重组乳酸杆菌的产酶特性 Fig. 5 Enzyme production characteristics of recombinant Lactobacillus |
将重组乳酸杆菌在37 ℃、180 rpm的条件下，培养24 h离心获取粗酶液，进行酶促反应，测定最适温度、最适pH、温度耐受性、pH稳定性以及金属离子对酶活性的影响。由图 6-A可知，该酶最适反应温度为60 ℃。该融合CMCase经30~90 ℃保温处理60 min后，再以CMC-Na为底物，测定CMCase活性，可以看出其在60 ℃稳定性最佳，在50~70 ℃，可以保持90%以上活性(图 6-B)。由图 6-C可知，该酶酶促反应最适pH为6.0，将pH降为3.0或者升至10.0时，酶活性下降至最高酶活的68%或63%。将该酶在pH 3.0~10.0处理60 min后，测定其pH稳定性，可知当pH为5.0时，酶活性最高，其稳定性最佳，当pH在4.0~8.0时能维持最高酶活的80%以上活性(图 6-D)。由图 6-E可知，测定的金属离子对酶促反应的影响各不同。其中Na+、K+、Mn2+对酶有激活促进作用，其中Mn2+对酶促反应有较强促进作用，相对活性可达125%。Mg2+、Cu2+对酶活性抑制作用最大，相对活性仅为77%、78%。
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A:最适温度optimum temperature；B:热稳定性thermal stability；C:最适pH optimum pH；D:pH稳定性pH stability；E:金属离子对酶促反应的影响effects of metal ions on enzymatic reaction。数据柱标注*表示与对照组相比差异显著(P < 0.05) data column labeling * indicated significant difference from the control group (P < 0.05)。 图 6 重组乳酸杆菌的酶学性质 Fig. 6 Enzymatic properties of recombinant Lactobacillus |
对发酵5 d后的3种粗饲料进行中性(酸性)洗涤纤维含量测定。如表 4可知，试验组玉米秸秆酸性洗涤纤维含量相较于对照组差异显著(P < 0.05)，虽然其余试验组指标相较于对照组差异不显著(P>0.05)，但试验组所有指标均明显降低。与对照组相比，试验组玉米秸秆、苜蓿秸秆、小麦秸秆的中性洗涤纤维相对降解率分别为10.42%、4.99%、4.57%，其对应的酸性洗涤纤维相对降解率分别为21.12%、7.85%、9.53%。这表明重组乳酸杆菌对秸秆植物性饲料均发挥一定的降解作用。
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表 4 秸秆植物性饲料中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量的测定 Table 4 Determination of neutral detergent fiber and acid detergent fiber contents in straw plant feed |
本研究从桑天牛体内筛选出产内切葡聚糖酶活性较高的枯草芽孢杆菌，克隆酶基因，将其与不受环境影响、不需诱导也能持续表达的外源基因，即在乳酸杆菌中应用较广的组成型启动子P32[16-17]，分泌效率高、受分泌蛋白影响小在乳酸杆菌分泌表达系统中较理想的异源信号肽SPlp0373[12]以及乳酸杆菌质粒pLEM-415共同构建了内切葡聚糖酶基因Nqm的乳酸杆菌分泌表达载体pLEM-P32SPNqm。
重组乳酸杆菌在培养24 h后，酶活性达到2.06 U/mL，当其酶活性进入稳定期后CMCase活性为1.6 U/mL左右，均低于原枯草芽孢杆菌酶活性(2.091 U/mL)。因为纤维素的有效降解需要葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶协同作用[18]，单个CMCase在降解纤维素时可能存在一定局限性[19]；也可能是由于枯草芽孢杆菌自身启动子稳定性更佳、转录能力更强、更能高效表达CMCase[20]，而相比于重组菌外源质粒的表达则会受到多方面的影响[21]。随着对基因组学的开发研究，挑选出高活性的组成型启动子和分泌效率理想的信号肽，进一步优化重组菌的表达载体，能更好地促进外源基因的高效表达。
该重组乳酸杆菌酶促反应最适温度和pH分别是60 ℃、6.0。Mn2+对酶促反应有较强促进作用，而Mg2+、Cu2+对酶活性抑制作用最大。该重组菌可适应较广的温度和pH范围，因此较适合于实际生产应用。丁轲等[9]对筛选的枯草芽孢杆菌产CMCase进行研究，其酶促反应最适温度和pH分别是50 ℃、6.0，Hg2+和Cu2+对CMCase活性具有明显抑制作用。造成这些差异的原因多种多样，比如可能菌株受到不同环境的生长影响，也可能是受体菌自身的酶基因发生了突变[22]，不同的酶结构以及试验方法的区别都可能引起差异。
传统乳酸菌发酵饲料能提高粗饲料品质、适口性，能增强肠道有益菌群，维持菌群平衡，提高动物免疫力，为机体的生长过程提供营养物质[23]，但野生的乳酸菌对粗饲料无纤维素降解能力。本试验利用重组乳酸菌发酵粗饲料，结果表明重组菌对几种常见的秸秆植物性饲料均有一定降解能力，其中玉米秸秆的降解效果最佳。同时该酶无需诱导产生且对温度和pH均有一定的耐受性，在生产实践中能够有效延长保存时间，极大地降低成本，提高饲料营养水平，具有一定的应用价值。
4 结论本研究从桑天牛体内筛选的枯草芽孢杆菌中克隆出内切葡聚糖酶Nqm基因，与启动子P32、信号肽SPlp0373连接构成新载体，使之在乳酸杆菌中表达。重组乳酸杆菌产酶最适条件为37 ℃、24 h。将重组菌进行粗饲料发酵试验，其对几种常见的秸秆植物性饲料均有一定降解效果。
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