动物营养学报    2020, Vol. 32 Issue (3): 1362-1381    PDF    
基于体外仿生消化法筛选适用于肉鸡玉米-豆粕-杂粕型饲粮的非淀粉多糖复合酶
刘胜利1 , 刘示杰2 , 王述柏3 , 刘文龙1 , 马传兴1 , 郭庆文1 , 王兴吉1 , 张明超1 , 陈洪伟1     
1. 山东隆科特酶制剂有限公司, 临沂 276400;
2. 青岛科技大学高分子科学与工程学院, 青岛 266042;
3. 青岛农业大学动物科技学院, 青岛 266109
摘要: 本试验旨在探究响应面法优化筛选6种非淀粉多糖酶(木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、果胶酶)添加于肉鸡玉米-豆粕-杂粕型饲粮中最优组合酶谱。采用第3代单胃动物仿生消化系统(SDS-Ⅲ)进行模拟胃肠液体外消化试验,首先采用单因素完全随机试验设计,在肉鸡玉米-豆粕-杂粕型基础饲粮中分别添加5个水平的6种非淀粉多糖酶,每个水平设5个重复,以还原糖释放量(RS)和干物质消化率提高值(IDMD)为评价指标,确定单酶的最佳添加量;据此结果,进一步利用软件Design-Expert 8.06 Box-Behnken响应面法设计6因子3水平L54(36)试验,对6种单酶进行复配组合,以RS和IDMD为响应值,确定6种单酶的最佳组合酶谱。结果表明:在1~3周龄肉鸡玉米-豆粕-杂粕型饲粮中优选出的6种非淀粉多糖酶酶谱为木聚糖酶11.40 U/g、β-葡聚糖酶3.76 U/g、纤维素酶8.52 U/g、β-甘露聚糖酶8.19 U/g、α-半乳糖苷酶6.24 U/g、果胶酶1.60 U/g,该酶谱催化反应的RS和IDMD分别为9.71 mg/g和2.86%;在此条件下进行3次重复试验,得到RS和IDMD分别为9.59 mg/g和2.81%,与理论最优值的误差分别为1.24%和1.75%,表明所得酶谱能反映出对RS和IDMD的较好结果。在4~6周龄肉鸡玉米-豆粕-杂粕型饲粮中优选出的6种非淀粉多糖酶酶谱为木聚糖酶11.90 U/g、β-葡聚糖酶5.26 U/g、纤维素酶8.32 U/g、β-甘露聚糖酶7.96 U/g、α-半乳糖苷酶6.29 U/g、果胶酶6.17 U/g,该酶谱催化反应的RS和IDMD分别为10.45 mg/g和2.95%;在此条件下进行3次重复试验,得到RS和IDMD分别为10.34 mg/g和2.92%,与理论最优值的误差分别为1.05%和1.02%,表明所得酶谱能反映出对RS和IDMD的较好结果。综上所述,1~3周龄肉鸡饲粮6种非淀粉多糖酶最佳酶谱是木聚糖酶11.40 U/g、β-葡聚糖酶3.76 U/g、纤维素酶8.52 U/g、β-甘露聚糖酶8.19 U/g、α-半乳糖苷酶6.24 U/g、果胶酶1.60 U/g;4~6周龄肉鸡饲粮6种非淀粉多糖酶最佳酶谱是木聚糖酶11.90 U/g、β-葡聚糖酶5.26 U/g、纤维素酶8.32 U/g、β-甘露聚糖酶7.96 U/g、α-半乳糖苷酶6.29 U/g、果胶酶6.17 U/g。
关键词: 肉鸡    玉米-豆粕-杂粕型饲粮    非淀粉多糖酶    还原糖    干物质消化率    酶谱    
Optimization of Non-Starch Polysaccharide Complex Enzymes Added to Corn-Soybean Meal-Miscellaneous Meal Diet for Broilers by Extracorporeal Bionic Digestion Method
LIU Shengli1 , LIU Shijie2 , WANG Shubai3 , LIU Wenlong1 , MA Chuanxing1 , GUO Qingwen1 , WANG Xingji1 , ZHANG Mingchao1 , CHEN Hongwei1     
1. Shandong Lonct Enzymes Co., Ltd., Linyi 276400, China;
2. College of Polymer Science and Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, China;
3. College of Animal Science and Technology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China
Abstract: The purpose of this study was to explore the optimal combination zymogram of 6 kinds of non-starch polysaccharide enzymes (xylanase, β-glucanase, cellulase, β-mannanase, α-galactosidase and pectase) added to broilers' corn-soybean meal-miscellaneous meal diet by response surface method. The in vitro digestion test simulated gastrointestinal fluid by the third generation monogastric animal simulate digestive system (SDS-Ⅲ). Using a single factor completely random design, every 5 levels of 6 non-starch polysaccharide enzymes were added to the corn-soybean meal-miscellaneous meal basal diet for broilers and each level was repeated for 5 times. The best addition level of single enzyme was determined by the reducing sugar release (RS) and improved dry matter digestibility (IDMD). Based on the above results, the software Designed-Expert 8.06 Box-Behnken response surface method was further used to design the 6 factors and 3 level L54 (36) test, and the 6 kinds of enzymes were compounded and combined. RS and IDMD were used as response values to determine the optimal combination enzyme spectrum of 6 kinds of enzymes. The results showed that the optimized zymogram of 6 kinds of non-starch polysaccharide enzymes in corn-soybean meal-miscellaneous meal diet for broilers aged 1 to 3 weeks was 11.40 U/g xylanase, 3.76 U/g β-glucanase, 8.52 U/g cellulase, 8.19 U/g β-manganase, 6.24 U/g α-galactosidase and 1.60 U/g pectase, and the RS and IDMD were 9.71 mg/g and 2.86% respectively by the reaction catalyzed by this zymogram. Under this condition, the experiment was repeated 3 times, the RS and IDMD were 9.59 mg/g and 2.81% respectively, and the error with the theoretical optimal value were 1.24% and 1.75%, respectively. These showed that the zymogram could reflect the good results of RS and IDMD. The optimized zymogram of 6 kinds of non-starch polysaccharide enzymes in corn-soybean meal-miscellaneous meal diet for broilers aged 4 to 6 weeks was 11.90 U/g xylanase, 5.26 U/g β-glucanase, 8.32 U/g cellulase, 7.96 U/g β-manganase, 6.29 U/g α-galactosidase and 6.17 U/g pectase, and the RS and IDMD were 10.45 mg/g and 2.95% respectively by the reaction catalyzed by this zymogram. Under this condition, the experiment was repeated 3 times, the RS and IDMD were 10.34 mg/g and 2.92% respectively, and the error with the theoretical optimal value were 1.05% and 1.02%, respectively. These showed that the zymogram could reflect the good results of RS and IDMD. To sum up, the optimal zymogram of 6 kinds of non-starch polysaccharide enzymes in diet for broilers aged 1 to 3 weeks was 11.40 U/g xylanase, 3.76 U/g β-glucanase, 8.52 U/g cellulase, 8.19 U/g β-manganase, 6.24 U/g α-galactosidase and 1.60 U/g pectase, and in diet for broilers aged 4 to 6 weeks was 11.90 U/g xylanase, 5.26 U/g β-glucanase, 8.32 U/g cellulase, 7.96 U/g β-manganase, 6.29 U/g α-galactosidase and 6.17 U/g pectase.
Key words: broilers    corn-soybean meal-miscellaneous meal diet    non-starch polysaccharide enzyme    reducing sugar    dry matter digestibility    zymogram    

饲用非淀粉多糖(NSP)酶制剂,具有提高饲料利用率、扩大饲料原料应用范围、提高动物生长和生产性能、降低饲养成本和改善环境等作用[1-8],是目前有望作为抗生素替代品的促生长型生物饲料添加剂。大量研究显示,NSP酶可断裂NSP的长链结构形成低聚物,释放营养物质,从而提高饲料的营养价值[9];通过降解植物细胞壁破坏物理屏障结构,释放营养物质使之与肠道消化酶充分接触,从而提高养分的消化率[2];降低排泄量,减少对环境的污染[8];降低NSP在后肠的发酵,抑制有害菌的繁殖,减少疾病的发生[10]。因此NSP酶制剂在养殖领域具有广阔的应用前景。本研究通过体外仿生消化系统模拟胃肠液进行消化试验,对肉鸡玉米-豆粕-杂粕型饲粮的NSP复合酶制剂进行酶谱筛选,旨在为其在玉米-豆粕-杂粕型饲粮中的合理应用提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验所用各种NSP酶制剂(木聚糖酶50 000 U/g、β-葡聚糖酶50 000 U/g、纤维素酶10 000 U/g、β-甘露聚糖酶50 000 U/g、α-半乳糖苷酶2 000 U/g、果胶酶30 000 U/g)均由山东隆科特酶制剂有限公司提供。其中,木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、果胶酶的菌种来源分别是毕赤酵母、长柄木霉、长柄木霉、迟缓芽孢杆菌、黑曲霉、黑曲霉。试验试剂:胃蛋白酶(Sigma P7000),胰蛋白酶(Amresco 0785),糜蛋白酶(Amresco 0164),淀粉酶(Sigma A3306),其他试剂除特殊说明外,均为分析纯,水均为符合GB/T 6682—2008中规定的二级水。主要试验仪器有第3代单胃动物仿生消化系统(SDS-Ⅲ)(湖南中本智能科技发展有限公司)和6400型氧弹量热仪(美国Parr公司)。

参照爱拔益加商品代肉鸡营养建议量配制玉米-豆粕-杂粕型基础饲粮,基础饲粮组成及营养水平见表 1

表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis)  
1.2 试验设计 1.2.1 肉鸡饲粮中6种单酶适宜添加量的体外仿生筛选试验

采用单因素完全随机试验设计,将木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、果胶酶6种单酶添加量分别设定5个水平,每个水平设5个重复,添加在肉鸡玉米-豆粕-杂粕型试验饲粮中,进行模拟胃肠液体外消化试验,试验设计见表 2

表 2 6种单酶的添加量 Table 2 Supplemental levels of the 6 kinds of enzymes  
1.2.2 肉鸡饲粮中6种单酶复配酶谱的体外筛选试验

根据1.2.1的试验结果:1~3周龄肉鸡饲粮中6种单酶木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、果胶酶获得最佳还原糖释放量的添加量分别为7.56、4.63、6.21、6.42、7.88、3.78 U/g,获得最佳干物质消化率提高值的添加量分别为11.50、3.76、8.79、4.55、6.24、5.95 U/g。将6种酶分别设定3个水平,按照6因素3水平L54(36)Box-Behnken响应面分析法进行试验设计,设置54个组合,其因素水平编码表如表 3所示,共有54个试验,其中48个为析因点,6个为零点以估计误差;以还原糖释放量(Y1)和干物质消化率提高值(Y2)为响应值,试验设计及结果如表 4所示。

表 3 肉鸡1~3周龄饲粮试验因素与水平 Table 3 Experimental factors and levels of diets for broilers from 1 to 3 weeks of age  
表 4 肉鸡1~3周龄饲粮Box-Behnken设计方案及响应值结果 Table 4 Design of Box-Behnken and response values of diets for broilers from 1 to 3 weeks of age

根据1.2.1的试验结果:4~6周龄肉鸡饲粮中6种单酶木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、果胶酶获得最佳还原糖释放量和干物质消化率提高值的添加量分别为7.31、11.90 U/g,4.53、3.80 U/g,6.44、8.90 U/g,6.44、4.55 U/g,7.81、6.29 U/g,3.79、6.17 U/g;将6种酶分别设定3个水平,按照6因素3水平L54(36)Box-Behnken响应面分析法进行试验设计,设置54个组合,其因素水平编码表如表 5所示,共有54个试验,其中48个为析因点,6个为零点以估计误差;以还原糖释放量(Z1)和干物质消化率提高值(Z2)为响应值,试验设计及结果如表 6所示。

表 5 肉鸡4~6周龄饲粮试验因素与水平 Table 5 Experimental factors and levels of diets for broilers from 4 to 6 weeks of age  
表 6 肉鸡4~6周龄饲粮Box-Behnken设计方案及响应值结果 Table 6 Design of Box-Behnken and response values of diets for broilers from 4 to 6 weeks of age
1.3 模拟胃肠液体外消化试验

仿生消化法测定还原糖释放量和干物质消化率提高值,仿生消化操作过程中透析袋的型号和前处理、胃缓冲液和小肠缓冲液的配制和仪器运行参数等试验操作参照文献[11]。

1.4 数据处理

用Excel 2016对数据进行初步整理,运用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面分析。其中数据计算公式如下:

式中:DMD为饲粮体外干物质消化率提高值(%);M1为上样饲粮干物质重量(g);M2为未消化残渣干物质重量(g)。

式中:RS为饲粮体外还原糖释放量;a为标准曲线回归系数;b为标准曲线回归系数;OD1为每个重复测定管的吸光度(OD)值;OD2为消化酶空白管的OD值;D为样品稀释倍数;V为定容体积;w为每个重复测定管饲粮样品重量;DM为饲粮样品的干物质含量。

2 结果与分析 2.1 肉鸡玉米-豆粕-杂粕型饲粮中单酶添加量的优选结果

1~3周龄肉鸡饲粮添加6种单酶对还原糖释放量和干物质消化率提高值的影响见表 7。由表可知,还原糖释放量和干物质消化率提高值随木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶添加量的逐步增加而呈现增加趋势;随β-甘露聚糖酶添加量的逐步增加,还原糖释放量呈增加趋势,而干物质消化率提高值呈先增长后降低的趋势,当β-甘露聚糖酶添加量为4.00 U/g时,干物质消化率提高值最高达0.74%;随饲粮α-半乳糖苷酶添加量的增加,还原糖释放量和干物质消化率提高值均呈现先增加后降低的趋势,当α-半乳糖苷酶添加量为6.40 U/g时,还原糖释放量和干物质消化率提高值达最大值分别为4.51 mg/g和0.57%;随饲粮果胶酶添加量的增加,干物质消化率提高值增加,而还原糖释放量呈先增加后降低的趋势,当果胶酶添加量为3.20 U/g时,还原糖释放量达最大值2.84 mg/g。

表 7 1~3周龄肉鸡饲粮添加6种单酶对还原糖释放量和干物质消化率提高值的影响 Table 7 Effects of supplementation with 6 kinds of enzymes on reducing sugar release and improved dry matter digestibility in diets for broilers from 1 to 3 weeks of age

通过6种单酶适宜添加量的体外仿生试验筛选数据建立还原糖释放量和干物质消化率提高值与其单酶添加量间的二次回归方程,通过偏导数法求出获得还原糖释放量最大值和干物质消化率提高值最大值,1~3周龄肉鸡饲粮中6种单酶的最优添加量(表 8表 9)分别为:木聚糖酶7.56、11.50 U/g,β-葡聚糖酶4.27、3.76 U/g,纤维素酶6.21、8.79 U/g,β-甘露聚糖酶6.42、4.55 U/g,α-半乳糖苷酶7.88、6.24 U/g,果胶酶3.78、5.95 U/g。

表 8 1~3周龄肉鸡饲粮中添加酶制剂还原糖释放量的二次回归方程 Table 8 Quadratic regression equation of reducing sugar release with enzyme supplementation in diets for broilers from 1 to 3 weeks of age
表 9 1~3周龄肉鸡饲粮中添加酶制剂干物质消化率提高值的二次回归方程 Table 9 Quadratic regression equation of improved dry matter digestibility with enzyme supplementation in diets for broilers from 1 to 3 weeks of age

4~6周龄肉鸡饲粮添加6种单酶对还原糖释放量和干物质消化率提高值的影响见表 10。由表可知,6种单酶添加到4~6周龄饲粮中对还原糖释放量和干物质消化率提高值的影响规律与1~3周龄大致相同。还原糖释放量和干物质消化率提高值随木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶添加量的逐步增加而呈现增加趋势;饲粮中添加β-甘露聚糖酶,随着添加量逐步增加,还原糖释放量增加,而干物质消化率提高值呈先增长后降低的趋势,β-甘露聚糖酶添加量为4.00 U/g时,干物质消化率提高值最高达0.76%;随饲粮α-半乳糖苷酶添加量的增加,还原糖释放量和干物质消化率提高值均呈现先增加后降低的趋势,当添加量为6.40 U/g时,还原糖释放量为4.79 mg/g,当添加量为3.20 U/g时,干物质消化率提高值为0.59%;随饲粮果胶酶添加量的增加,干物质消化率提高值增加,而还原糖释放量呈先增加后降低的趋势,当果胶酶添加量为3.20 U/g时,还原糖释放量达最大值2.97 mg/g。

表 10 4~6周龄肉鸡饲粮添加6种单酶对还原糖释放量和干物质消化率提高值的影响 Table 10 Effects of supplementation with 6 kinds of enzymes on reducing sugar release and improved dry matter digestibility in diets for broilers from 4 to 6 weeks of age

通过6种单酶适宜添加量的体外仿生试验筛选数据建立还原糖释放量和干物质消化率提高值与其单酶添加量间的二次回归方程,通过偏导数法求出获得还原糖释放量最大值和干物质消化率提高值最大值,4~6周龄肉鸡饲粮中6种单酶的最优添加量(表 11表 12)分别为:木聚糖酶7.31、11.90 U/g,β-葡聚糖酶,4.53、3.80 U/g,纤维素酶6.44、8.91 U/g,β-甘露聚糖酶6.44、4.55 U/g,α-半乳糖苷酶7.81、6.24 U/g,果胶酶3.79、6.17 U/g。

表 11 4~6周龄肉鸡饲粮中添加酶制剂还原糖释放量的二次回归方程 Table 11 Quadratic regression equation of reducing sugar release with enzyme supplementation in diets for broilers from 4 to 6 weeks of age
表 12 4~6周龄肉鸡饲粮中添加酶制剂干物质消化率提高值的二次回归方程 Table 12 Quadratic regression equation of Improved dry matter digestibility with enzyme supplementation in diets for broilers from 4 to 6 weeks of age
2.2 响应面法回归模型及方差分析

利用软件对肉鸡1~3周龄饲粮中的试验结果进行二次多元回归拟合,对表 4的数据进行方差分析后得到模型的二次多元回归方程为:

式中:ABCDEF分别代表木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、果胶酶的添加量。

还原糖释放量的方差分析见表 13,干物质消化率提高值的方差分析见表 14。由表可知,6种NSP酶制剂在1~3周龄肉鸡饲粮中复配的优化与验证可知,2个模型的P值均小于0.000 1,其中失拟项P>0.05,表明失拟不显著,并且回归模型与实际试验拟合程度较好,试验方法可靠。模型的决定系数R2和校正决定系数Radj2均大于0.9,表明模型预测值与实际试验结果具有良好的相关性。2个模型预测残差平方和均小于或接近0.01,数据越小说明拟合程度越好,总体拟合具有统计学意义,可用还原糖释放量和干物质消化率提高值来优选NSP酶复合酶谱。根据还原糖释放量和干物质消化率提高值为优化指标,利用软件Design-Expert 8.06对方程模型进行分析,得到最佳参数条件,优选出的6种NSP酶酶谱是木聚糖酶11.40 U/g、β-葡聚糖酶3.76 U/g、纤维素酶8.52 U/g、β-甘露聚糖酶8.19 U/g、α-半乳糖苷酶6.24 U/g、果胶酶1.60 U/g,此时还原糖释放量为9.71 mg/g、干物质消化率提高值为2.86 %。

表 13 1~3周龄肉鸡饲粮还原糖释放量的回归模型方差分析 Table 13 Regression model variance analysis of reducing sugar release in diets for broilers from 1 to 3 weeks of age
表 14 1~3周龄肉鸡饲粮干物质消化率提高值的回归模型方差分析 Table 14 Regression model variance analysis of improved dry matter digestibility in diets for broilers from 1 to 3 weeks of age

利用软件对对肉鸡4~6周龄饲粮中的试验结果进行二次多元回归拟合,对表 6的数据进行方差分析后得到模型的二次多元回归方程为:

式中:ABCDEF分别代表木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、果胶酶的添加量。

还原糖释放量的方差分析见表 15,干物质消化率提高值的方差分析见表 16。由表可知,酶制剂在4~6周龄饲粮中复配的优化与验证可知,2个模型的P值均小于0.000 1,其中失拟项P>0.05,表明失拟不显著,并且回归模型与实际试验拟合程度较好,试验方法可靠。模型的决定系数R2和校正决定系数Radj2均大于0.9,表明模型预测值与实际试验结果具有良好的相关性。2个模型预测残差平方和均小于0.06,说明拟合程度好,总体拟合具有统计学意义,可用还原糖释放量和干物质消化率提高值来优选NSP酶复合酶谱。根据还原糖释放量和干物质消化率提高值为优化指标,利用软件Design-Expert 8.06对方程模型进行分析,得到最佳参数条件,优选出的6种NSP酶酶谱是木聚糖酶11.90 U/g、β-葡聚糖酶5.26 U/g、纤维素酶8.32 U/g、β-甘露聚糖酶7.96 U/g、α-半乳糖苷酶6.29 U/g、果胶酶6.17 U/g,此时还原糖释放量为10.45 mg/g、干物质消化率提高值为2.95%。

表 15 4~6周龄肉鸡饲粮还原糖释放量的回归模型方差分析 Table 15 Regression model variance analysis of reducing sugar release in diets for broilers from 4 to 6 weeks of age
表 16 4~6周龄肉鸡饲粮干物质消化率提高值的回归模型方差分析 Table 16 Regression model variance analysis of improved dry matter digestibility in diets for broilers from 4 to 6 weeks of age
2.3 回归模型结果分析

表 4表 13表明,在肉鸡1~3周龄饲粮中,各单酶对还原糖释放量的影响顺序是木聚糖酶(A)-纤维素酶(C)-β-葡聚糖酶(B)-α-半乳糖苷酶(E)-果胶酶(F)-β-甘露聚糖酶(D),除β-甘露聚糖酶和果胶酶(DF)交互作用不显著(P>0.05)外(图 1),其余各单酶对于还原糖释放量的相互间交互作用极显著(P < 0.01)。

图 1 β-甘露聚糖酶(D)和果胶酶(F)交互作用对还原糖释放量的影响 Fig. 1 Effect of interaction between β-mannanase (D) and pectase (F) on reducing sugar release

表 4表 14表明,在肉鸡1~3周龄饲粮中,各单酶对干物质消化率提高值的影响顺序是果胶酶(F)-β-甘露聚糖酶(D)-β-葡聚糖酶(B)-纤维素酶(C)-α-半乳糖苷酶(E)-木聚糖酶(A),除β-葡聚糖酶和纤维素酶(BC)、β-葡聚糖酶和β-甘露聚糖酶(BD)、α-半乳糖苷酶和果胶酶(EF)交互作用不显著(P>0.05)外(图 2),纤维素酶和β-甘露聚糖酶(CD)交互作用显著(P < 0.05),其余各单酶对于干物质消化率提高值的相互间交互作用极显著(P < 0.01)。

图 2 β-葡聚糖酶(B)和纤维素酶(C)、β-葡聚糖酶(B)和β-甘露聚糖酶(D)、α-半乳糖苷酶(E)和果胶酶(F)交互作用对干物质消化率提高值的影响 Fig. 2 Effects of interactions between β-glucanase (B) and cellulase (C), β-glucanase (B) and β-mannanase (D), and α-galactosidase (E) and pectase (F) on improved dry matter digestibility

表 6表 15表明,在肉鸡4~6周饲粮中,各单酶对还原糖释放量的影响顺序是果胶酶(F)-β-葡聚糖酶(B)-木聚糖酶(A)-α-半乳糖苷酶(E)-β-甘露聚糖酶(D)-纤维素酶(C),除纤维素酶和果胶酶(CF)交互作用不显著(P>0.05)外(图 3),其余各单酶对于还原糖释放量的相互间交互作用极显著(P < 0.01)。

图 3 纤维素酶(C)和果胶酶(F)交互作用对还原糖释放量的影响 Fig. 3 Effect of interaction between cellulase (C) and pectase (F) on reducing sugar release

表 6表 16表明,在肉鸡4~6周龄饲粮中,各单酶对干物质消化率提高值的影响顺序是果胶酶(F)-纤维素酶(C)-木聚糖酶(A)-β-甘露聚糖酶(D)-β-葡聚糖酶(B)-α-半乳糖苷酶(E),除木聚糖酶和β-甘露聚糖酶(AD)、β-葡聚糖酶和α-半乳糖苷酶(BE)、纤维素酶和β-甘露聚糖酶(CD)、α-半乳糖苷酶和果胶酶(EF)交互作用不显著(P>0.05)外(图 4),其余各单酶对于干物质消化率提高值的相互间交互作用极显著(P < 0.01)。

图 4 木聚糖酶(A)和β-甘露聚糖酶(D)、β-葡聚糖酶(B)和α-半乳糖苷酶(E)、纤维素酶(C)和β-甘露聚糖酶(D)、α-半乳糖苷酶(E)和果胶酶(F)交互作用对干物质消化率提高值的影响 Fig. 4 Effects of interactions between xylanase (A) and β-mannanase (D), β-glucanase (B) and α-galactosidase (E), cellulase (C) and β-mannanase (D), and α-galactosidase (E) and pectase (F) on improved dry matter digestibility
2.4 最优酶谱的预测和验证

根据还原糖释放量和干物质消化率提高值为优化指标,利用软件Design-Expert 8.06对方程模型进行分析,在1~3周龄肉鸡饲粮中优选出的6种NSP酶酶谱是木聚糖酶11.40 U/g、β-葡聚糖酶3.76 U/g、纤维素酶8.52 U/g、β-甘露聚糖酶8.19 U/g、α-半乳糖苷酶6.24 U/g、果胶酶1.60 U/g,此时还原糖释放量为9.71 mg/g、干物质消化率提高值为2.86%;在此条件下进行3次重复试验,得到还原糖释放量为9.59 mg/g、干物质消化率提高值为2.81%,与理论最优值的误差分别为1.24%和1.75%,表明所得酶谱能反映出对还原糖释放量和干物质消化率提高值的较好结果。在4~6周龄肉鸡饲粮中优选出的6种NSP酶酶谱是木聚糖酶11.9 U/g、β-葡聚糖酶5.26 U/g、纤维素酶8.32 U/g、β-甘露聚糖酶7.96 U/g、α-半乳糖苷酶6.29 U/g、果胶酶6.17 U/g,此时还原糖释放量为10.45 mg/g、干物质消化率提高值为2.95%;在此条件下进行3次重复试验,得到还原糖释放量为10.34 mg/g、干物质消化率提高值为2.92%,与理论最优值的误差分别为1.05%和1.02%,表明所得酶谱能反映出对还原糖释放量和干物质消化率提高值的较好结果。

3 讨论

NSP酶是饲料中主要的抗营养因子,能降低饲料的营养价值。饲粮中添加NSP酶能特异性降解NSP,降低其抗营养作用,提高饲料的利用率和动物生长性能,促进肠道健康。NSP酶主要包括:木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、果胶酶等酶制剂,其主要作用机制是能够有效降解饲料中的NSP,降低食糜黏性,增加底物与消化酶的接触,破坏植物细胞壁,释放细胞内养分。影响NSP酶作用的因素有饲粮类型[12]、动物生理阶段、酶制剂的性质(NSP酶的来源、发酵工艺、酶活、耐受温度、pH稳定范围、对底物抑制剂敏感性、动物内源物质的抵抗性等)与配伍[13-14]、饲料加工工艺等。

本试验通过体外模拟法研究了木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、果胶酶对肉鸡玉米-豆粕-杂粕型饲粮中的还原糖释放量和干物质消化率提高值的影响,结果表明,在1~3周龄肉鸡饲粮中优选出的6种NSP酶酶谱是木聚糖酶11.40 U/g、β-葡聚糖酶3.76 U/g、纤维素酶8.52 U/g、β-甘露聚糖酶8.19 U/g、α-半乳糖苷酶6.24 U/g、果胶酶1.60 U/g;在4~6周龄肉鸡饲粮中优选出的6种NSP酶酶谱是木聚糖酶11.90 U/g、β-葡聚糖酶5.26 U/g、纤维素酶8.32 U/g、β-甘露聚糖酶7.96 U/g、α-半乳糖苷酶6.29 U/g、果胶酶6.17 U/g。木聚糖是谷物籽实中主要的NSP,阻碍了禽类对营养物质的消化吸收,降低饲料利用率[4],β-葡聚糖特殊的支链结构增加饲粮持水性,导致肠道食糜黏度增加,改变肠道物理活性,降低养分消化吸收率[15]。而木聚糖酶和β-葡聚糖酶同属于半纤维素酶,饲粮中添加木聚糖酶可高效专一的降解饲粮中木聚糖,降低食糜黏性,减少家禽下痢,提高营养物质消化吸收和饲料转化率[16]。班志彬等[17]研究表明木聚糖酶可显著提高肉鸡的呼吸熵,可提高平均日增重和降低料重比;张芹[18]研究表明饲粮中添加5 mg木聚糖酶,酶解液黏度降低了7.95%,还原糖含量增加了10.85%。廖窨[13]研究表明在玉米、小麦和大麦中,木聚糖酶、葡聚糖酶和β-甘露聚糖酶各添加量的加酶组还原糖释放量显著高于空白对照组。纤维素是植物细胞壁的组成成分,其结构特殊,阻碍禽类对细胞内蛋白质、矿物质和淀粉等营养物质的消化吸收[19]。李岑曦等[19]研究表明添加不同水平的纤维素酶可一定程度上增加肉鸡日增重,提高饲料转化率。同时有研究表明饲粮中同时添加木聚糖酶和纤维素酶可提高肉鸡养分消化率和还原糖含量[18]。单胃动物体内缺乏α-半乳糖苷酶,豆科植物作为饲料原料,其α-半乳糖苷含量丰富,禽类食入后不能被机体消化吸收,且α-半乳糖苷易导致禽类胀气、腹泻、下痢等[20]。马慧慧[20]研究表明在玉米-豆粕型饲粮中添加100 g/t α-半乳糖苷酶能有效提高肉鸡的生产性能、养分消化率、消化道酶活、有益微生物菌群数量及改善免疫机能的作用。果胶酶中原果胶、多聚半乳糖醛酸酶和果胶酯酶三者协同,高效专一降解饲料中的果胶成分。许毅[21]研究表明果胶酶能提高豆粕的干物质消化率提高值和还原糖的释放量,但对黏度无明显的影响,果胶酶的最适添加量为4.6~6.2 U/g,本试验结果符合此范围。

影响酶制剂作用的因素主要包括酶制剂的种类、饲料的加工工艺、饲粮类型、动物种类及生理阶段和酶制剂的添加量等,其中酶制剂的添加量通常是根据作用底物的浓度和生产成本等确定适宜的添加剂量。Wang等[22]研究表明酶制剂的添加量与其作用效果存在线性和二次曲线关系,本试验的还原糖释放量和干物质消化率提高值随着酶制剂添加量呈现先升高后降低的二次曲线规律,与Wang等[22]研究结果一致。由Rebolé等[23]、Cowan等[24]对NSP酶作用机制的研究可知,当NPS酶添加量不足时,细胞壁降解不完全,难以释放出营养物质与消化酶接触,从而导致效果不显著,随着NSP酶添加量的升高,作用效果越明显直至达到峰值,而当酶制剂含量过高时,低剂量已达到底物消化的饱和量,可能会产生负反馈抑制,影响还原糖的生成和营养物质的消化率。

因此要充分发挥酶制剂的作用,必须根据饲料中的具体营养水平选择对应的酶制剂,本试验根据肉鸡玉米-豆粕-杂粕型饲粮的饲料组成并通过体外仿生消化系统,体外模拟法研究了6种NSP酶对肉鸡玉米-豆粕-杂粕型饲粮中的还原糖释放量和干物质消化率提高值的影响,确定了相应的NSP酶组合,提高了还原糖释放量和干物质消化率提高值,为NSP酶在肉鸡饲料玉米-豆粕杂粕型饲粮中的应用提供了研究数据,使得肉鸡通过更好地利用玉米-豆粕-杂粕型饲粮而提高生产性能。

4 结论

从本研究结果来看,响应面法得到在1~3周龄肉鸡饲粮中优选出的6种NSP酶酶谱是木聚糖酶11.40 U/g、β-葡聚糖酶3.76 U/g、纤维素酶8.52 U/g、β-甘露聚糖酶8.19 U/g、α-半乳糖苷酶6.24 U/g、果胶酶1.60 U/g,此时还原糖释放量为9.71 mg/g、干物质消化率提高值为2.86%;在此条件下进行3次重复试验,得到还原糖释放量为9.59 mg/g、干物质消化率提高值为2.81%,与理论最优值的误差分别为1.24%和1.75%,表明所得酶谱能反映出对还原糖释放量和干物质消化率提高值的较好结果。在4~6周龄肉鸡饲粮中优选出的6种NSP酶酶谱是木聚糖酶11.90 U/g、β-葡聚糖酶5.26 U/g、纤维素酶8.32 U/g、β-甘露聚糖酶7.96 U/g、α-半乳糖苷酶6.29 U/g、果胶酶6.17 U/g,此时还原糖释放量为10.45 mg/g、干物质消化率提高值为2.95%;在此条件下进行3次重复试验,得到还原糖释放量为10.34 mg/g、干物质消化率提高值为2.92%,与理论最优值的误差分别为1.05%和1.02%,表明所得酶谱能反映出对还原糖释放量和干物质消化率提高值的较好结果。

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