乳蛋白是人类膳食蛋白质的重要来源以及牛乳品质的关键评定指标，因而促进乳蛋白的合成是奶牛科学的研究热点和重点。传统的蛋白质消化吸收理论认为，蛋白质营养即为氨基酸营养。氨基酸不仅是乳蛋白合成的重要前体物质^[1-2]，其还可作为信号分子参与调控乳蛋白的合成^[3-5]。但进一步的研究发现，氨基酸在乳腺中的吸收因氨基酸结构、极性、氨基酸转运载体数量和活性等的影响而存在竞争性抑制，乳腺吸收的游离氨基酸量不能完全满足乳腺乳蛋白合成的需要，从而降低限制性氨基酸补充提高乳腺游离氨基酸利用率的效用^[6-7]。研究显示，反刍动物对小肽有特殊需要，乳腺乳蛋白的合成过程中，许多必需氨基酸来源于以小肽结合的形式存在，非游离态的氨基酸(血液循环中的肽及肽结合氨基酸)也可作为前体物用于乳蛋白合成^[8-9]。在奶牛乳腺上皮细胞中，含有蛋氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)、苏氨酸(Thr)、苯丙氨酸(Phe)等限制性氨基酸的小肽都表现出促进乳蛋白合成的能力^[10-11]。随着小肽在营养学中的应用与发展，有必要进一步研究小肽调控乳蛋白合成的潜在机制。因此，本文主要从小肽对乳蛋白合成的影响、小肽的吸收与降解、小肽调控乳蛋白合成的机制3个层面，阐述小肽对奶牛乳腺乳蛋白合成的影响及调控机制，为进一步研究小肽促进乳蛋白合成提供思路。

1 小肽对乳蛋白合成的影响

小肽是由2~3个氨基酸组成的具有特定生物功能的小分子物质。在动物生产中，小肽可以通过提高机体对蛋白质、脂肪及矿物质的吸收利用率^[12-13]、增强机体的免疫力^[14]以及提升瘤胃微生物活力等^[15]来提高动物的生产性能。在奶牛营养研究领域，小肽营养对乳蛋白合成的影响是目前的研究热点之一。小肽可以提高乳蛋白的合成效率，小肽的浓度和小肽包含的氨基酸组成也是影响乳蛋白合成的重要因素。

1.1 小肽提高乳蛋白合成效率

奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells，BMEC)能够利用含2或3个氨基酸组成的小肽合成乳蛋白。试验证明，含有Met、Lys的二肽能够显著促进BMEC中乳蛋白的合成。当小肽等量替代相应游离氨基酸时，含有小肽的试验组中乳蛋白基因的表达量显著高于游离氨基酸组，培养液中乳蛋白的实测浓度也有提高^{[10-11, 16-17]}。因此，小肽具有优于游离氨基酸促进BMEC乳蛋白合成的效率。

1.2 小肽浓度对乳蛋白合成的影响

小肽相对于游离氨基酸虽然具有更高的吸收效率，但是只有适宜浓度的小肽具有促进BMEC生长、增殖和分泌乳蛋白的正向调控作用，小肽浓度过低或者过高则可能会抑制其生长且影响其基因的表达^[18]。不同浓度的小肽培养BMEC时，乳腺上皮细胞的细胞活力在小肽浓度较高时会出现一定程度的下降^[19]。培养基中添加不同浓度的小肽，BMEC酪蛋白基因表达量会出现差异较大的低剂量和高剂量的抑制作用^[20-21]。只有在BMEC培养基中添加最适宜浓度的小肽时，酪蛋白基因的表达量最高，如Phe-Phe添加比例为培养基中游离Phe总量的10%，Met-Met添加量为80 μg/mL，最能促进BMEC酪蛋白的合成^{[10, 19, 22-23]}。

1.3 小肽的氨基酸组成对乳蛋白合成的影响

小肽不同氨基酸的组成对BMEC中乳蛋白基因的表达具有调控作用。在比较含Met的不同氨基酸组成的小肽调控乳蛋白合成的试验中，在适宜浓度下，二肽比等量替换的游离氨基酸有更强的促乳蛋白合成能力，其中Met-Met小肽的作用最明显，显著上调小肽转运载体2(oligopeptide transporter 2，PepT2)、酪蛋白基因以及酪蛋白的表达，其次为Met-Lys小肽，也能够显著上调酪蛋白基因的表达；氨基酸组成的其他二肽或三肽，如Met-色氨酸(Trp)、Met-Phe、Met-Thr、Met-异亮氨酸(Ile)不同程度地促进了酪蛋白基因的表达，Met-Ile、Met-亮氨酸(Leu)、Met-缬氨酸(Val)抑制酪蛋白基因的表达，而Met-Met-Met、精氨酸(Arg)-组氨酸(His)-Ile提高酪蛋白基因表达的能力弱于二肽^[24-26]。这些研究表明，二肽相对于游离氨基酸和三肽具有更强的促乳蛋白合成的能力。但是适宜的三肽氨基酸组成对乳蛋白的合成调控仍有必要进一步研究。

2 奶牛乳腺中小肽的吸收和降解

肽是机体内蛋白质消化代谢为氨基酸或氨的中间产物，不同动物以及不同组织对肽吸收和代谢的特点有差异^[27-28]。奶牛乳腺组织中小肽的吸收和降解也有其组织特异性。

2.1 奶牛乳腺对小肽的利用

在1953年，Agar首先观察到肠道能完整地转运双甘肽；1960年，Newey等发现小肽可以完整形式被肠道细胞吸收；Matthews随后在动物体内发现了寡肽的转运系统；以Chen和Webb等为代表的学者还逐渐发现肽营养在反刍动物生产中的重要性^[29-30]。自此，学术界关于小肽影响乳蛋白合成的营养研究也进入更多人的视野。众多研究表明，动物体摄入的蛋白质被胃蛋白酶和胰蛋白酶水解后，以游离氨基酸和小肽的形式直接被胃肠道黏膜吸收进入体循环，血液中存在的肽结合氨基酸(peptide-bound amino acids，PBAA)也作为乳蛋白合成的前体物质^[31-32]。目前公认的乳腺利用肽的机制可能包括3种：1)肽在乳腺细胞外被降解为游离氨基酸，而后被吸收利用；2)乳腺直接吸收完整的肽，在细胞代谢为游离氨基酸后被吸收利用；3)前2种形式协同作用来参与乳腺小肽的吸收^[11]。

2.2 奶牛乳腺对小肽的吸收

小肽和氨基酸转运系统相互独立存在。小肽转运速度快、耗能低、不易饱和，相比氨基酸转运系统，蛋白以肽的形式提供更易被机体吸收。目前，哺乳动物中已经发现的小肽转运载体(oligopeptide transports，PepTs)有4种，即小肽转运载体1(oligopeptide transporter 1，PepT1)、PepT2、小肽组氨酸转运载体1(peptide histidine transporter 1，PhT1)、小肽组氨酸转运载体2(peptide histidine transporter 2，PhT2)，小肽转运载体有着广泛的底物适应性，主要靠主动跨膜转运来完成绝大多数的二肽、三肽、肽的类似物等细胞内外营养离子的平衡交换^[33-35]。

2.2.1 奶牛乳腺中的PepT2

PepT2是奶牛乳腺中参与小肽吸收与代谢最重要的小肽转运载体。PepT2在奶牛乳腺中的表达主要存在于奶牛乳腺的细胞质中，在BMEC摄取小肽中发挥重要作用，至少有一部分的小肽能够通过PepT2摄取进入乳腺上皮细胞影响乳蛋白的合成^[10-11]。敲除PepT2显著减少了小肽的吸收，降低了乳蛋白的合成。此外，当氨基酸以肽的形式提供，PepT2还可以避免部分氨基酸转运载体间的竞争，从而间接地提高乳腺对其他游离氨基酸的吸收^[36]。

2.2.2 奶牛乳腺中的PepT1

PepT1在奶牛乳腺中的作用具有争议性。在一些研究中未检测到PepT1在奶牛乳腺组织中的表达^{[35, 37]}。但是，崔艳^[38]通过转录组检测发现了PepT1在奶牛乳腺存在明显的表达，且还明确了PepT1存在于奶牛乳腺的细胞膜上。其构建的pIRES2-EGFP-PepT1转染到奶牛乳腺上皮细胞后，乳蛋白基因均有了显著的上调表达。此外，其在BMEC培养基中添加Thr-Phe-Phe三肽，PepT1基因的表达显著增强。因此，PepT1具有调控奶牛乳腺酪蛋白基因表达的功能，同时其自身的基因表达也受小肽的调控。

2.2.3 奶牛乳腺中的PhT1和PhT2

近年来的研究发现，PhT1也能在奶牛乳腺组织中表达，但其在奶牛乳腺小肽的摄取中并未发挥作用。Wang等^[39]的研究检测到PhT1在奶牛乳腺中表达，但是进一步敲除PhT1后并未影响BMEC对小肽的摄取。郭静^[40]的研究同样发现，PhT1在奶牛乳腺组织中表达，且明确了PhT1主要定位于细胞膜，干扰PhT1对小肽(β-Ala-Lys-AMCA和Met-Met)摄取量无影响。PhT2在奶牛乳腺组织中可以少量表达，其在奶牛的盲肠、肺脏和胸腺中表达量最高。目前对奶牛乳腺中PhT2的报道较少，PhT2对奶牛乳腺乳蛋白合成的调控作用有待进一步研究。

因此，PepT1、PepT2、PhT1和PhT2均在奶牛乳腺组织中检测到表达，目前PepT2是调控奶牛乳腺摄取小肽中最重要的小肽转运载体，其他3种小肽转运载体的乳蛋白合成调控作用有待进一步研究确定。

2.3 奶牛乳腺中小肽的降解

BMEC中的肽浓度是肽降解、吸收和利用等综合代谢的反映。研究显示，机体中蛋白质被胃胰酶消化后，能够进一步被肽酶从多肽链的N末端切断第2个肽键，酶解产生大量的二肽和三肽，大部分小肽以完整形式被吸收利用；少部分小肽被二肽酶和三肽酶降解为游离氨基酸^[41-42]。氨基肽酶N(aminopeptidase N，APN)受到血浆循环肽的调节，可以从N端切断寡肽^[43]。研究发现，APN可在乳腺组织中表达，敲除或过表达APN可延迟或加速乳腺的发育^[44]。Yang等^[11]在BMEC培养基中添加Met-Met二肽，能够促进APN的表达丰度，加入APN抑制剂后，乳蛋白的合成明显下降。APN可将Met-Met二肽水解为游离氨基酸，用于乳蛋白的合成。因此，APN对小肽的水解可能是乳蛋白合成调控的一种潜在方式。

3 小肽调控乳蛋白合成的分子机制

小肽对乳蛋白合成调控的影响因素较多，目前已证实了肽链的长度、结构和构型、小肽的理化性质等都能影响小肽的吸收进而影响奶牛乳蛋白的合成。小肽还能够通过影响乳腺上皮细胞的数量、PepT2和信号通路等调控奶牛乳蛋白的合成。

3.1 调控乳腺上皮细胞增殖促乳蛋白合成

BMEC的数量和活力决定了奶牛的泌乳量^[45]。同时，一定程度上BMEC的数量和活力也决定了牛奶的品质^[46]。在BMEC的培养基中添加Met二肽后，培养BMEC的时间也与细胞活力有一定关系，BMEC在培养24 h时活力较高，细胞中酪蛋白基因的表达量较高，随着细胞培养时间的延长，BMEC的增殖能力降低^[47]。研究发现，添加80 μg/mL Met-Met可促进BMEC细胞周期从G1期转变到S期，提高细胞周期蛋白D1的表达，促进BMEC的增殖，刺激乳腺上皮细胞乳蛋白的合成^{[23, 36]}。

3.2 小肽转运载体调控乳蛋白的合成

PepT2是目前已明确的具有重要调控作用的小肽转运载体。当BMEC培养基中小肽浓度增加，PepT2的数量也随之增加。研究显示，PepT2的蛋白数量同转运小肽的多少呈正相关关系^{[16, 48]}。有研究通过焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)破坏PepT2蛋白功能，抑制了乳腺中二肽的转运，最终降低乳蛋白基因的表达和乳蛋白的合成^{[11, 22]}。Wang等^[36]用修饰PepT2的组氨酸残基来阻断PepT2的功能，显著降低了Met-Met刺激下奶牛乳腺αs1酪蛋白(CSN1S1)基因表达的增加。保证PepT2的数量和功能对小肽调控乳蛋白合成具有重要作用。

3.3 小肽对乳蛋白合成信号通路的调控

近年研究显示，小肽也可介导信号通路，如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路、Janus激酶2(JAK2)-信号转导和转录激活因子5(STAT5)信号通路、磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)信号通路影响乳蛋白的合成。

3.3.1 JAK2-STAT5信号通路

JAK2-STAT5信号通路是在转录水平介导催乳素和生长因子刺激乳蛋白的合成，催乳素和生长因子与BMEC上相应受体的结合导致JAK2磷酸化，进而磷酸化STAT5，磷酸化的STAT5形成二聚体进入细胞核，通过结合乳蛋白基因的启动子和增强子来诱导表达，在乳腺发育和乳蛋白合成中发挥重要作用^[49-50]。Yang等^[11]的研究显示，肽结合氨基酸是JAK2-STAT5信号通路的关键激活因子，BMEC培养基中添加15% Met-Met二肽显著增加JAK2和STAT5基因的表达丰度，Met-Met可能通过激活JAK2-STAT5信号通路来介导奶牛乳腺CSN1S1的表达。有研究结果显示，80 μg/mL的Met-Met显著增加JAK2和STAT5基因mRNA的丰度，提高了JAK2、STAT5的磷酸化，上调了β酪蛋白(CSN2)基因的表达；抑制JAK2活力后，BMEC细胞的增殖和乳蛋白的合成也随之下降。研究提示Met-Met增加CSN1S1的合成，可能是通过JAK2-STAT5信号通路来介导的^{[23, 36]}。

3.3.2 mTOR信号通路

mTOR是高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其在翻译水平上通过影响mRNA与43S起始复合物的结合以及真核起始因子4E结合蛋白1(eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1，4EBP1)、核糖体S6激酶1(p70 ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1)的磷酸化，调控细胞生长和蛋白质的合成^[51-54]。周苗苗等^[55-56]的研究显示，Lys-Leu、Lys-Lys、Lys-His比游离Lys培养BMEC时，显著提高mTOR和4EBP1基因的表达，Lys-Lys、Lys-His还促进S6K1基因的表达，其研究还发现，mTOR对Lys-Lys组CSN1S1基因的表达丰富无显著影响，但能显著抑制游离Lys组CSN1S1基因的表达，mTOR通过降低mTOR、4EBP1、S6K1的活性进而抑制CSN1S1的合成，而Lys-Lys小肽降低了这种抑制作用。多位学者的研究结果还显示，最适宜浓度的Met-Met二肽，能够显著增加BMEC中mTOR、4EBP1、S6K1基因mRNA的表达丰度，提高其磷酸化水平，促进乳蛋白基因的表达，而抑制mTOR信号通路中关键基因mTOR的活力后，BMEC中乳蛋白的合成也随之下降。因此，BMEC最适宜浓度小肽的促乳蛋白合成作用，可能是通过mTOR信号通路介导的^{[7, 11]}。除此之外，王彩红^[23]的研究发现，PepT2的表达和活性还受到mTOR的调控，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2(mammalian target of rapamycin complex 2，mTORC2)均是其调控因子，神经前体细胞表达发育抑制蛋白4-2(neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated 4-2，Nedd 4-2)调控并介导mTORC1对PepT2表达和功能的调控，进而影响细胞对小肽的吸收。

3.3.3 PI3K-Akt信号通路

PI3K-Akt是调控细胞生长、增殖、凋亡和营养转运的重要信号通路^[57-58]。研究显示，细胞对氨基酸、寡肽的转运是通过PI3K信号通路进行调控^[59-60]。抑制PI3K-Akt信号通路能够调控PepT1和PepT2，降低小肽的转运^[61-62]。Wang等^[39]抑制PI3K和AKT的作用，发现可以减弱BMEC中PepT2的表达以及β-Ala-Lys-AMCA的吸收。这些研究提示，PI3K-Akt信号通路能够调控小肽转运载体的活性，进而调控BMEC中小肽的吸收。

4 小结

小肽对乳蛋白合成具有重要调控作用，其可以弥补因氨基酸比例模式或氨基酸转运载体竞争性抑制等问题导致的乳蛋白合成下降。目前在奶牛乳腺中发现的小肽转运载体为PepT1、PepT2、PhT1和PhT2，其中PepT2的功能作用较为明确，其他3种小肽转运载体在奶牛乳腺的转运功能和乳蛋白合成调控作用还需要进一步研究。调控机制方面，小肽对乳腺乳蛋白合成的研究集中在细胞水平的验证，目前还鲜有奶牛个体水平的小肽调控机制试验报道。小肽的浓度对奶牛乳腺上皮细胞的增殖和活力具有显著影响，但是具体机制仍不清楚。小肽可以通过调控信号通路mTOR、JAK2-STAT5和PI3K-AKT的活性影响奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白的合成，但是小肽对乳蛋白合成相关的其他信号通路的活性调控以及信号通路之间的互作效应仍缺乏了解。因此，有必要结合现代生物分子学技术，依靠转录组学、代谢组学或蛋白组学等技术手段或平台从吸收代谢、基因表达及基因网络构建和功能蛋白活性等层面进一步研究小肽对乳蛋白合成的调控。同时，明确小肽在乳蛋白合成过程中的作用机制后，还需要进一步进行分子营养调控技术提高奶牛乳蛋白合成效率的个体水平验证试验，为提高奶牛生产性能、提升乳品质提供新的研究思路和方法。