2. 广东省农业科学院动物科学研究所, 农业部华南动物营养与饲料重点实验室, 广州 510640
2. Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science in South China of Ministry of Agriculture, Institute of Animal Science, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China
在动物生产中，肠道损伤造成动物营养物质吸收障碍，生长缓慢，导致经济效益受损。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作为革兰氏阴性细菌外膜的组成成分，可透过肠壁引发机体的细菌移位，继而爆发全身性的炎症反应，而肠黏膜屏障作为机体抵抗外界刺激的第1道关卡，其完整性对于维持微环境稳态尤为重要[1]。因此，LPS作为损伤肠黏膜的常见致病因子，其损伤肠黏膜屏障的作用机制的研究就显得十分必要。
1 LPS的结构及特性LPS可分为脂质A区域和碳水化合物区域，其中碳水化合物区域包括核心区、O-特异性链[2]。而脂质A由磷酸化的二葡萄糖胺骨架组成，发挥重要的免疫活性作用，且来自不同细菌的脂质A因为酰基链的数量和长度可自由变换，磷酸盐也可变化，所以其结构具有多样性[3]。在小鼠的饲喂过程中，通过限制摄入能量的方式，可以使肠道微生物菌群的功能发生变化，降低脂质A合成所需关键酶的表达，改善小鼠代谢[4]。碳水化合物区域在免疫受体的识别中仅具有次要作用，通过酸水解的方式去除整个碳水化合物链，对LPS的促炎活性影响很小[5]，然而去除脂质A上的1个磷酸基团则会大大降低LPS的促炎活性，这种被修饰后的LPS被命名为单磷脂酸化脂质A，因为其保留了强大的免疫刺激活性，但失去了LPS的大部分炎症毒性，也成为了疫苗佐剂[6-7]。
研究显示，肠黏膜的损伤程度与LPS的致炎时间以及致炎浓度有一定联系，给小鼠腹腔注射5 mg/kg LPS，观察到小鼠的血液免疫指标和肠黏膜形态在致炎6 h后损伤程度最为明显，随着时间的延长，注射72 h后逐渐恢复到正常的生理水平[8]，而按照100 μg/kg BW给猪注射LPS，一般在3~6 h即可引起肠黏膜的损伤[9-10]。
2 LPS对肠黏膜相关蛋白的影响 2.1 肠道紧密连接蛋白正常生理情况下，完整的肠黏膜屏障及肠道微生物群的多样性可防止细菌及其介质渗透进入体循环[11]。上皮紧密连接(TJ)由闭合蛋白(claudins)、紧密连接蛋白(ZO)、闭锁蛋白(occludin)、连接黏附分子(JAM)等构成，这些紧密连接的复合物结构能够有效封闭细胞间隙，阻止病原体、内毒素、病菌的侵入[12]。claudin-1、occludin是位于细胞膜表面的蛋白，紧密连接蛋白-1(ZO-1)位于细胞质内膜表面[13]，大量研究表明，LPS可增加胃肠黏膜上皮紧密连接的通透性，破坏其完整性，这就使得内毒素可通过细胞旁透作用进入肠内，从而发生内毒素移位，引起细胞因子的失控性表达，加剧肠道炎症[14]。
有研究表明，取小鼠肠道进行免疫组化蛋白定位分析，发现腹腔注射LPS后，小鼠肠黏膜上皮细胞中，claudin-1、occludin、ZO-1从整齐排列的结构变成杂乱结构，且染色变浅[15]。相似的，用LPS刺激肠上皮细胞IPEC-J2后，这3个的蛋白表达量也有了一定程度的下降[16]，研究发现不同的途径均可改善肠上皮屏障功能，刘畅[17]发现经LPS诱导肠黏膜损伤后的小鼠，腹腔注射Toll样受体4(TLR4)单克隆抗体，可有效上调claudin-1、occludin、ZO-1的mRNA和蛋白表达量，这是因为TLR4单克隆抗体对紧密连接蛋白损伤具有拮抗作用。此外，肠上皮细胞用维生素A刺激后，也可增加紧密连接蛋白的表达，降低细胞旁通透性，最终改善肠道黏膜屏障，阻止LPS进入体循环[18]。
2.2 LPS结合蛋白(LBP)、CD14、骨髓分化因子-2(MD-2)LPS可通过与几种蛋白质相互作用引发肠道损伤，包括LBP、CD14、MD-2和TLR4等[19]。其中LBP是一种可溶性的穿梭蛋白，能直接结合LPS并催化LPS与CD14的结合。进入细胞里的LPS与LBP结合，形成的复合物再与CD14分子共同作用，形成LPS-LPB-CD14三体复合物，也可增强TLR4-MD-2复合物对LPS的感知，最终得以更快速地活化TLR4，促进炎症反应的发生。CD14还可和其他微生物产物结合，如肽聚糖、脂磷壁酸、脂蛋白等[20]。因此，它具有广泛的配体特异性，通过识别不同微生物中的结构而起到模式识别受体的作用。
2.3 Toll样受体(TLRs)蛋白模式识别受体是识别和维持免疫功能的特异性分子，肠道黏膜上存在着多种TLRs。这些模式受体最早是在果蝇上发现，并且对果蝇的发育很重要[21]，其对于抗真菌病原体中抗菌肽的产生也是必不可少的。在这个受体家族中，TLRs可以识别细菌、真菌和病毒特有的结构成分，以发出信号并激活炎症反应[22]。每个受体识别不同配体从而发挥不同的作用，Toll样受体2(TLR2)可识别寡聚体，Toll样受体3(TLR3)识别双链，TLR4可识别内毒素[23-24]。TLR4在维持肠道稳态时具有重要的意义，研究发现，与野生小鼠相比，被敲除肠上皮细胞TLR4后的小鼠，肠道微生物群发生紊乱并且维持肠内稳态的能力变弱，对敲除小鼠用广谱抗生素治疗，也不能恢复肠内稳态和微生物群[25]。TLR4作为炎症通路上游重要的受体，TLR4活化后诱导下游的炎症反应，罗敏等[26]用LPS诱导肠上皮细胞IEC-6，成功构建了细胞炎症模型，发现TLR4的mRNA和蛋白表达量增加。
2.4 核因子-κB(NF-κB)NF-κB家族是由5种不同的DNA结合蛋白组成，分别是P50、P52、P65(RelA)、RelB、c-Rel，形成多种同源二聚体和异二聚体[27]。NF-κB是先天性和适应性免疫应答的关键调节剂，其可加速细胞增殖，抑制细胞凋亡，促进细胞迁移和侵袭。NF-κB的激活可以由多种途径诱导，如病毒和细菌感染、DNA损伤、氧化应激、促炎细胞因子等[28]。NF-κB作为下游激发炎症反应的转录调节因子，在正常的生理情况下，NF-κB异源二聚体p50-p65与核因子-κB抑制蛋白(IκB)结合，一旦有LPS刺激时会使得NF-κB活化，在细胞质中的二聚体与IκB解离，p50-p65进入细胞核从而发挥转录调节作用[29]。
3 LPS介导的信号通路进入肠内的内毒素化学本质为LPS，其中的类脂A是LPS的生物活性中心，肠上皮细胞对类脂A的识别是LPS诱导肠黏膜损伤的起始步骤。TLR4细胞外结构域的2个C-末端汇集在中心，N-末端向外伸展，脂质A的酰基链嵌入到MD-2的结构域中，脂质A的2个磷酸基团与TLR4-MD-2带电的残基形成氢键相互作用[30]。如图 1所示，在诱导肠黏膜损伤时，TLR4及其相关的MD-2形成的稳定异二聚体，去感知革兰氏阴性细菌外膜成分LPS，与LPS结合后，TLR4与MD-2形成的复合物二聚化，在细胞表面被激活[31]。TLR4信号的转导也分为了髓样分化因子88(MyD88)依赖途径和MyD88非依赖途径，MyD88依赖途径被证明是促炎性细胞因子表达的重要途径，也是LPS诱导肠道炎症的途径，在LPS诱导后，MyD88募集白细胞介素-1受体相关激酶4(IRAK4)[32]。肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)对MyD88依赖途径也至关重要，其可激活转化生长因子β激活酶1(TAK1)，并使得下游的IκB激酶(IKK)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径激活，导致IκB磷酸化和转录因子NF-κB入核[33]。更有研究显示，TLR4可介导细菌移位，TLR4在肠细胞中对细菌的吞噬起着关键的作用[34]，孙丽等[35]的研究表明，猪肠上皮细胞用LPS诱导后TLR4的表达量增加，且与LPS诱导的浓度呈正比。
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LPS:脂多糖lipopolysaccharide；LBP：LPS结合蛋白LPS binding protein；MD-2：骨髓分化因子-2 bone marrow differentiation factor-2；TLR4：Toll样受体4 Toll like receptor 4；MyD88：髓样分化因子88 myeloid differentiation factor 88；IRAK4：白细胞介素-1受体相关激酶4 interleukin-1 receptor-related kinase 4；IRAK1：白细胞介素-1受体相关激酶1 interleukin-1 receptor-related kinase 1；IRAKM：白细胞介素-1受体相关激酶M interleukin-1 receptor-related kinase M; TRAF6：肿瘤坏死因子受体相关因子6 tumor necrosis factor receptor-related factor 6；IκB：核因子-κB抑制蛋白nuclear factor-κB inhibitors；IKKα：IκB蛋白激酶α IκB protein kinase protein α；IKKβ：IκB蛋白激酶β IκB protein kinase protein β；IKKγ：IκB蛋白激酶γ IκB protein kinase protein γ；NF-κB：核因子-κB nuclear factor-κB；inflammatory cytokines：炎性细胞因子。 图 1 LPS诱导肠损伤下炎症信号通路图 Fig. 1 Inflammatory signaling pathway of intestinal injury induced by LPS |
LPS诱导的NF-κB核易位主要是依赖于MyD88[36]，TLR4信号通过来自细胞膜的MyD88依赖途径，启动促炎转录因子核因子的易位活化B细胞的κ-轻链增强子从细胞质进入细胞核诱导基因转录，新合成的IκB被IKK复合物磷酸化后降解[37]，NF-κB易位进出细胞核有助于炎症基因的表达[38]。NF-κB信号传导分为经典途径和替代途径，经典途径是通过IKKα-IKKβ异二聚体的激活，使得静息状态下p50-p65二聚体与IκB的复合物解离，进入细胞核进行转录。替代途径则是需要IKKα-IKKα同源二聚体参与到NF-κB的活化过程[39]，其涉及到的NF-κB异二聚体则是P52-RelB[40]。大量的研究表明，在LPS诱导肠损伤时，NF-κB是通过经典途径被迅速且短暂的激活，产生肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)等细胞因子，进一步加重并促进炎症性肠病(IBD)的发生[41]。目前，虽没有大量的研究可以表明NF-κB替代途径与IBD的关系，但是该途径在维持肠道免疫系统稳态也具有重要的作用，CD40是替代途径有效的启动子，发炎黏膜的肠黏膜固有层T细胞(LP-T)可检测出功能性的CD40配体，其可诱导单核细胞中的白细胞介素-12(IL-12)和TNF的产生，导致肠道炎症增加[42]。
4 小结长久以来，畜禽肠道健康一直是畜牧业所关注的问题，LPS作为常见的应激源，损伤胃肠道屏障会造成肠道紧密连接蛋白claudins、ZO-1、occludin异常表达，引起肠上皮细胞高度可渗透的细胞旁空间。肠黏膜屏障通透性的增加，使得内毒素、病原体等得以穿过肠壁，诱导活化细胞表面TLR4。TLR4在辅助因子的协助下，激活下游NF-κB信号通路，并合成释放炎性细胞因子，包括IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、环氧合酶-2(COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)。这些细胞因子具有促进炎症细胞募集和激活的作用，继而加重肠道的损伤。虽然LPS诱导肠屏障损伤的途径已经研究的相对透彻，但仍有许多通路值得深究，例如NF-κB的替代途径等，这些通路的进一步探索可以为畜禽微生态营养研究以及产LPS细菌的安全使用提供理论基础。
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