肠道是动物消化和吸收营养素的主要场所，也是保障机体免受病原菌侵害的生理屏障，仔猪肠道的正常运转是机体健康的保证[1]。仔猪断奶等不良因素会引起肠道的结构发生变化，使功能无法正常发挥。肠道结构失衡和功能紊乱是导致仔猪营养不良、腹泻甚至死亡率增加的主要原因。肠道上皮细胞作为一个选择性屏障，允许必需的营养物质、电解质等运至循环系统，抑制有害物质进入内环境，细胞间的紧密连接在维持上皮细胞完整性中发挥关键作用[2]。谷氨酸作为肠上皮细胞的能量物质，在肠道结构和功能的维持中不可或缺。研究发现，肠腔中的菌群以及肠上皮细胞可利用谷氨酸生成谷胱甘肽等活性物质，谷氨酸还可以被转化成天冬氨酸、甘氨酸等其他非必需氨基酸，促进肠上皮细胞增殖[3]。Amagase等[4]研究发现，谷氨酸可逆转氯索洛芬引起的大鼠小肠黏蛋白2(MUC2)基因及蛋白质表达量降低，增加肠道黏膜层厚度。饲粮中添加1.0%的谷氨酸能够有效增加断奶仔猪肠道的抗氧化能力，缓解敌草快这一氧化应激源引起的肠道损伤[5]。本试验以断奶仔猪为研究对象，通过对回肠形态结构、上皮细胞紧密连接相关蛋白表达以及血清中脂多糖(LPS)含量与二胺氧化酶(DAO)活性等相关指标进行检测，探讨谷氨酸对断奶仔猪回肠结构和屏障功能的影响，并初步解析其作用机制。
1 材料与方法 1.1 试验材料谷氨酸为广州某生物科技有限公司产品，纯度为99%。
1.2 试验设计采用单因子试验设计，选择28日龄、健康状况良好、体重[(7.90±0.50) kg]相近的“杜×长×大”三元杂交断奶阉公猪14头，随机分为对照组和谷氨酸组，每组7个重复，每个重复1头猪。将试验仔猪于代谢笼中饲养，试验期为28 d，其中预试期7 d，正试期21 d。对照组饲粮是在玉米-豆粕型基础饲粮基础上添加1.0%的玉米淀粉，谷氨酸组饲粮是在玉米-豆粕型基础饲粮基础上添加1.0%的谷氨酸。玉米-豆粕型基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 玉米-豆粕型基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the corn-soybean meal type diet (air-dry basis) |
试验开展前对猪舍及代谢笼进行清洁消毒，其他管理和免疫程序按照猪场常规程序进行。自由采食和饮水。每天定时喂料，并观察猪群健康状况。
1.4 测定指标及方法 1.4.1 样品采集养殖试验结束当天，12 h空腹后采集仔猪前腔静脉血5 mL，3 000 r/min离心15 min，分离血清，-20 ℃冰箱保存。采血后，将仔猪屠宰并分离回肠，取肠段样品4份，将其中2份分别置于4%多聚甲醛和2.5%戊二醛中4 ℃保存，剩下的2份用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗内容物后，一份保存于-80 ℃冰箱中备用，另一份自然地放在吸水纸上测量长度，吸干水分后称其重量，精确到0.001 g。
1.4.2 回肠形态学观察将保存于2.5%戊二醛中的回肠样品取出，经漂洗、固定、漂洗、乙醇逐级脱水、干燥、喷金后进行电镜(Phenom ProX，飞纳)扫描，观察拍照。
将保存于4%多聚甲醛中的回肠样品取出，经乙醇逐级脱水、二甲苯透明、透蜡、包埋、切片(厚度为7 μm)和苏木精-伊红(HE)染色后，光镜下观察回肠黏膜形态结构。每头猪取3张HE染色切片，每张切片选5个视野拍照，用Image-Pro Plus 6.0软件测量每张照片中5根最长绒毛处的绒毛高度及隐窝深度，计算绒毛高度/隐窝深度。绒毛高度指从肠腺绒毛联结处到绒毛顶端的距离，隐窝深度指从肠腺基部到肠腺绒毛联结处的距离。
1.4.3 蛋白质免疫印迹取适量保存于-80 ℃冰箱中的回肠样品，加入RIPA裂解液提取总蛋白质，消煮后分装，于-20 ℃保存备用。消煮后的蛋白质样品经电泳、转膜、封闭、显色、一抗孵育[闭合蛋白(occludin，#331500，Thermo Fisher)、封闭蛋白-1(claudin-1，#374900，Thermo Fisher)、增殖细胞核抗原(PCNA，#200947，成都正能)、酪氨酸激酶2(JAK2，#3230S，成都正能)、信号转导与转录激活子3(STAT3，#A1719，成都正能)、磷酸化酪氨酸激酶2(p-JAK2，#3771S，成都正能)、磷酸化信号转导与转录激活子3(p-STAT3，#G2617，成都正能)及β-肌动蛋白(β-actin，#C1919，成都正能)，用抗体稀释液1 : 1 000稀释]、洗脱、二抗孵育[鼠抗(#E030110，成都正能)、兔抗(#E030120，成都正能)，用抗体稀释液1 : 5 000稀释]、洗脱后，在Fluor Chem M Apparatus凝胶成像仪中捕捉膜上条带信息，并用Image J2x软件统计条带灰度值。蛋白质相对表达量呈现为总蛋白质/β-actin或者磷酸化蛋白质/总蛋白质。
1.4.4 血清LPS含量及DAO活性检测取保存于-20 ℃冰箱中的血清，冰上静置融化后3 000 r/min离心15 min，双抗体夹心法测定血清中LPS含量，试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；酶学分光光度法测定血清中DAO活性，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。按照试剂盒说明书检测血清中LPS含量和DAO活性。
1.5 数据处理采用SPSS 17.0软件对试验数据进行统计分析，数据用平均值±标准误(mean±SE)表示。采用独立样本t检验分析组间差异显著性，P＜0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 谷氨酸对断奶仔猪回肠单位长度重量及回肠单位长度黏膜重量的影响由表 2可知，与对照组相比，饲粮中添加1.0%的谷氨酸可显著增加断奶仔猪回肠单位长度重量及回肠单位长度黏膜重量(P＜0.05)。
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表 2 谷氨酸对断奶仔猪回肠单位长度重量及回肠单位长度黏膜重量的影响 Table 2 Effects of Glu on ileal weight per unit length and ileal mucosal weight per unit length of weaned piglets |
图 1-A为回肠HE染色切片，图 1-B为回肠扫描电镜拍照结果。由图 1-A和图 1-B可知，与对照组相比，饲粮中添加1.0%的谷氨酸可使肠绒毛结构更加完整。由图 1-C、图 1-D和图 1-E可知，与对照组相比，谷氨酸组断奶仔猪回肠绒毛高度显著增加(P＜0.05)，绒毛高度/隐窝深度也显著增加(P＜0.05)。
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谷氨酸组数据柱标注*表示与对照组差异显著(P＜0.05)。下图同。 Date columns of Glu group with * mean significant difference compared with control group (P < 0.05). The same as below. 图 1 谷氨酸对断奶仔猪回肠黏膜形态结构的影响 Fig. 1 Effects of Glu on ileal mucosal morphology of weaned piglets |
由图 2可知，与对照组相比，饲粮中添加1.0%谷氨酸可显著增加断奶仔猪回肠中occludin、caudin-1和PCNA的相对表达量(P＜0.05)。
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图 2 谷氨酸对断奶仔猪回肠上皮细胞中occludin、claudin-1和PCNA表达的影响 Fig. 2 Effects of Glu on expression of occludin, claudin-1 and PCNA in ileal epithelial cells of weaned piglets |
由表 3可知，与对照组相比，饲粮中添加1.0%的谷氨酸显著降低了断奶仔猪血清中LPS含量及DAO活性(P＜0.05)。
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表 3 谷氨酸对断奶仔猪血清中LPS含量及DAO活性的影响 Table 3 Effects of Glu on serum LPS content and DAO activity of weaned piglets |
由图 3可知，与对照组相比，饲粮中添加1.0%的谷氨酸显著增加了断奶仔猪回肠组织中JAK2/STAT3信号通路相关蛋白p-JAK2和p-STAT3的相对表达量(P＜0.05)。
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图 3 谷氨酸对断奶仔猪回肠组织中JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达的影响 Fig. 3 Effects of Glu on expression of proteins related to JAK2/STAT3 signaling pathway in ileal tissue of weaned piglets |
断奶仔猪肠道发育尚未成熟，难以应对早期断奶及饲养环境改变等应激，导致其腹泻率和死亡率增加。饲粮中的谷氨酸被吸收进入肠上皮细胞后可通过转氨等作用转化成α-酮戊二酸，经三羧酸循环为肠上皮细胞的有序运转提供能量[3]。有研究表明谷氨酸可作为一种功能性氨基酸，通过提高肠道干细胞的活性[6]，加快隐窝绒毛轴的再生速度，进而促进肠道发育[7]。与此相似，本研究发现，饲粮中添加谷氨酸可显著增加回肠单位长度重量及回肠单位长度黏膜重量。
3.2 谷氨酸对断奶仔猪回肠黏膜形态结构的影响肠道作为机体与外界直接接触的器官，时刻受到毒素和致病菌的侵袭，从而导致肠道结构和功能的损伤。肠道结构完整性的降低会引起营养物质吸收障碍，大量营养物质在后肠部位异常发酵，引起腹泻[8]。因此，维持肠道功能的正常运转需依靠完整的肠道结构来实现。研究证明饲粮中添加谷氨酸可以增加肠黏膜厚度，促进肠道黏液分泌，改善肠道完整性，缓解有害因素对肠道的损伤[9]。谷氨酸的高效利用有助于肠上皮更新或损伤修复，进而维持肠道结构及功能的完整性，提高机体对饲粮中营养物质的利用率，减少肠道疾病的发生[10]。本研究结果表明，饲粮中添加谷氨酸可显著增加断奶仔猪回肠绒毛高度及绒毛高度/隐窝深度，使其回肠绒毛排列更加致密，形态与结构更加完整。
3.3 谷氨酸对断奶仔猪肠道屏障功能及肠上皮细胞增殖标志蛋白表达的影响肠道屏障是由单层肠上皮细胞排列连接构成的，能够有效防止有害微生物及毒素等物质通过肠腔进入血液。肠上皮细胞间的紧密连接可通过调节肠道屏障的通透性，维持肠道屏障的完整性[11]。研究发现，谷氨酸可增加肠上皮细胞跨膜电阻值，降低肠道通透性，维持肠道结构的完整性[10]。与该研究结果相似，本试验中，谷氨酸有效增加了回肠组织中紧密连接相关蛋白(occludin、claudin-1)及增殖标志蛋白PCNA的表达，使回肠结构与屏障功能更加完整。
3.4 谷氨酸对断奶仔猪血清中LPS含量及DAO活性的影响肠道屏障能够有效阻止LPS吸收进入血液，肠道屏障功能受到损害后会导致LPS大量吸收进入血液。LPS作为主要的血清内毒素，其含量会随着肠道屏障功能的减弱而增高[10-11]。DAO是所有哺乳动物肠上皮细胞胞质中具有高度活性的细胞内酶，正常情况下，DAO在血清中活性较低，当肠道黏膜层受到损伤以后，形态结构发生改变，胞质内DAO释放量增加，进入肠细胞间隙、淋巴管和血液，使血清中DAO活性升高[12]。血清LPS含量及DAO活性的改变是肠道结构完整性和肠道通透性变化的结果，测定血清LPS含量及DAO活性可间接地反映肠黏膜的完整性及损伤程度，可有效判断肠道屏障功能的完整性。由本试验结果可知，谷氨酸显著降低断奶仔猪血清中LPS含量及DAO活性，表明谷氨酸可有效降低断奶仔猪回肠通透性，改善回肠屏障功能。
3.5 谷氨酸对断奶仔猪回肠组织中JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达的影响STAT3作为一种转录因子，是酪氨酸激酶信号转导和转录活化因子家族的重要成员。STAT3是联系细胞外信号与细胞应答的桥梁因子，能在细胞核中发挥转录激活作用，参与多种细胞因子的信号转导过程，对细胞的生长和存活具有重要的调控作用[13]。STAT3在接受细胞外信号刺激后发生酪氨酸磷酸化，被激活的STAT3分子进入细胞核，利用其DNA结合域与细胞核内特定的DNA序列结合，调节靶基因转录[14]。
STAT3的转录活性增强能够抑制肠道炎症反应的发生，具有促进肠上皮细胞增殖的作用[15]。Welte等[16]构建的骨髓造血系统中STAT3转录活性缺失小鼠在出生后4~6周即死亡，病理解剖显示在肠道内出现炎性细胞浸润、肠壁增厚以及肉芽肿瘤。有研究报道，p-STAT3可以直接结合闭锁小带蛋白-1(ZO-1)和occludin的启动子区域，调控ZO-1和occludin的转录，从而维护肠道屏障功能的完整性[17]。在小鼠肠道及人结肠癌细胞系的研究中发现，乳酸菌胞外多糖可通过调控STAT3信号通路增加紧密连接相关蛋白(ZO-1、occludin和claudins)的表达量，改善肠上皮屏障功能[18]。在以眼角膜为模型的研究中发现，ZO-1的启动子区域直接受STAT3激活调控，可通过STAT3信号通路调控眼角膜的屏障功能[19]。
由以上研究结果推测，饲粮中添加谷氨酸可上调断奶仔猪回肠组织中JAK2/STAT3信号通路相关蛋白的表达，促进回肠上皮细胞增殖，并上调紧密连接相关蛋白occludin、claudin-1的表达。
4 结论饲粮中添加1.0%的谷氨酸可改善断奶仔猪回肠结构的完整性，增强回肠屏障功能，该作用可能与谷氨酸上调回肠组织中JAK2/STAT3信号通路相关蛋白的表达，促进回肠上皮细胞增殖有关。
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