生产高品质的牛肉产品符合人们日益提高的消费需求, 但在我国现有养殖条件下, 肉牛易因管理、环境、运输等不可控因素造成应激反应。应激往往引起机体自由基水平升高, 氧化还原状态失衡, 影响肌肉组织中能量代谢, 脂肪和蛋白质等发生氧化修饰, 导致肌肉酸度升高、风味变差、肉色暗沉、持水力下降等, 造成品质降低, 影响经济效益[1-2]。目前, 国内外很多学者围绕提高动物抗应激能力、改善肌肉品质等开发相关产品, 并在生产中开展应用研究。但是, 由于动物机体内新陈代谢过程复杂, 难以准确阐明作用机理, 导致部分产品研发存在盲目性, 限制了其推广利用。与体内试验相比, 开展体外细胞试验具有研究对象更直接、省时、成本低、可重复性强等诸多优点。随着细胞培养技术的快速发展, 以离体细胞为对象开展的营养调控、疾病控制的机理研究越来越多, 在鼠[3]、奶牛[4]、猪[5]、家禽[6]等动物上均有报道。在肉牛方面, 本课题组前期成功分离获得皮下和肌间脂肪细胞, 并围绕其开展肉牛脂肪沉积规律及营养调控机制研究[7-8]。但是, 目前国内外在肉牛肌肉细胞上的研究还鲜见报道, 有待进一步研究。细胞氧化应激模型是一种重要的细胞模型, 广泛应用于氧化损伤机制、抗氧化药物的筛选评价、疾病预防控制等研究中[9]。构建细胞氧化应激模型的手段主要包括辐射、紫外照射、过氧化氢(H2O2)处理以及(次)黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶法等, 其中H2O2处理法因具有造模效果理想、稳定性高、可操作性强等优点而广泛应用于模型建立中。目前, 在肠上皮细胞系[10]、鼠原代心肌细胞[11]、奶牛乳腺上皮细胞[12]等多种类型细胞上已成功构建氧化应激模型, 而在肉牛肌肉细胞上的研究还比较滞后。鉴于牛肉品质的关注度日益提高, 构建肉牛肌肉细胞氧化应激模型对于深入开展肌肉方面的机理研究具有重要意义。基于此, 本研究通过采集肉牛背最长肌, 利用组织块法分离培养肌肉细胞, 并对细胞进行鉴定, 建立肉牛原代肌肉细胞株; 然后, 利用H2O2构建肉牛肌肉细胞氧化应激模型, 以期为牛肉品质的调控、性状的形成、相关功能性产品的开发提供理论基础和技术支撑。
1 材料与方法 1.1 试验动物在山东省肉牛生产性能测定中心挑选1头体重为252 kg的健康利鲁杂交公牛(利木赞×鲁西黄牛)进行屠宰, 采集背最长肌, 用无菌生理盐水冲洗2~3遍后, 迅速放入装有1%青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液(PBS)的无菌样品瓶中, 冰浴保存, 1 h内带回实验室, 准备培养肌肉细胞。试验经山东省农业科学院动物保护和使用委员会的许可(IACUC20060101)进行, 并符合相关试验动物福利的规则和制度。
1.2 主要试剂DMEM/F12培养基购自Gibco公司; 胎牛血清(FBS)购自Biological Industries公司; 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)、血清白蛋白(BSA)、3%H2O2溶液购自Sigma公司; 青链霉素混合液、4', 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液, 超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒, 丙二醛(MDA)和蛋白质羰基(PC)含量检测试剂盒, 二喹啉甲酸(BCA)蛋白含量测定试剂盒购自Solarbio公司; Triton X-100购自Alladin公司; 生肌决定因子1(MyoD1)抗体(bs-2442R)、配对盒基因7(PAX7)抗体(bs-2413R)购自博奥森公司; Alexa Fluor 555抗兔(H+L)免疫球蛋白G(IgG)购自Cell Signaling Technology公司; Alexa Fluor 488驴抗兔(H+L)IgG购自Abcam公司; 八肽胆囊收缩素(CCK-8)检测试剂盒购于Med Chem Express公司; 活性氧自由基(ROS)检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司; 8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.3 试验方法 1.3.1 细胞的分离培养与鉴定参考卢靖坤[13]的方法, 利用组织块贴壁法进行肌肉细胞的分离培养。在无菌超净台中, 将背最长肌肌肉组织从样品瓶中取出置于无菌培养皿中, 仔细剔除筋膜及多余脂肪组织, 用PBS冲洗3~5遍, 之后用眼科剪刀将肌肉组织剪碎至乳糜状。用无菌吸管吸取乳糜组织均匀放在培养瓶底壁, 然后翻转培养瓶加入配制好的细胞培养液, 将培养瓶平放入培养箱中, 30~40 min后待乳糜贴于培养瓶上后, 缓慢翻转培养瓶, 让培养液慢慢浸没培养瓶底壁的乳糜组织, 然后将培养瓶重新放回培养箱继续培养38~48 h后细胞开始贴壁生长, 每天观察细胞生长情况, 5~6 d后有80%~90%细胞贴壁, 采用光学显微镜(TS100, Nikon)观察并记录细胞形态, 之后收集细胞冻存备用。
参考Hindi等[14]的方法, 利用免疫荧光法对获得的细胞进行鉴定。将细胞按1×106个/mL接种于6孔板中, 置于细胞培养箱中37℃培养, 当细胞融合至70%以上时弃去培养液, 采用4%多聚甲醛固定30 min, PBS冲洗细胞3次。PBS洗涤后, 用含有0.1% Triton X-100的PBS进行细胞的透化处理, 置于冰上透化10 min。透化处理后再用PBS冲洗细胞3次, 用含有3% BSA的PBS封闭处理30 min, 弃去后不洗, 加入一抗(MyoD1或PAX7), 4℃过夜后用PBS洗涤3次, 然后加入二抗, 37℃恒温孵育1 h, PBS洗3次后, 最后加入DAPI染核10 min, PBS洗3次后, 采用荧光显微镜(Dmil LED, Leica Microsystems)观察。
参考Mitchell等[15]方法, 采用流式细胞仪(C6, Becton Dickinson)对细胞阳性率进行检测。将细胞解冻后置于37℃培养箱中培养, 培养传代至T25细胞瓶中, 当细胞数长至约1×106个/mL后用胰蛋白酶消化后离心弃去上清, 用PBS冲洗, 后加入流式固定液固定30 min, 离心后弃上清。用含有5% BSA的0.1% PBS-Triton X-100透化10 min后弃上清。然后加入一抗(MyoD1或PAX7)或对照IgG吹打均匀, 室温下孵育60 min后更换为二抗孵育30 min。离心后弃去上清, 将细胞重悬于200~500 μL PBS中, 利用流式细胞仪检测阳性率。
1.3.2 细胞氧化应激模型的建立参考Facchinetti等[16]、金鹿[12]的方法构建细胞氧化应激模型, 确定H2O2适宜作用浓度和作用时间。根据不同检测指标要求, 将细胞按5×104个/mL接种于96孔板或T25细胞瓶中, 置于37℃培养箱中培养24 h, 然后去掉原有培养液, 更换为现配制的分别含0、50、100、150、200、250、300、350、400、450 μmol/L的H2O2培养液处理24 h, 之后分别用光学显微镜观察细胞形态、测定细胞存活率、氧化还原状态相关指标。根据检测结果, 筛选确定适宜的H2O2浓度。最后, 采用该浓度H2O2分别处理细胞0.75、1.5、3、6、12、24 h, 检测细胞存活率、氧化还原状态等指标, 确定适宜作用时间。
1.3.2.1 细胞存活率检测将经H2O2处理的细胞更换为基础培养液, 在每孔中各加入10 μL的CCK-8溶液, 将培养板置于37℃培养箱内孵育1~4 h, 用酶标仪测定450 nm处的吸光度, 每个处理浓度和时间均设6个重复, 测定细胞存活率。
1.3.2.2 氧化还原状态检测根据ROS检测说明书步骤, 将处理的细胞进行消化, PBS洗涤2次, 加入1 mL 2', 7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)染液重悬细胞, 37℃避光孵育30 min, PBS洗2次, 利用流式细胞仪检测荧光强度, 计算ROS水平。将处理后的细胞用0.25%胰蛋白酶进行消化, PBS洗涤2次, 离心弃上清, 重悬于500 μL PBS中, 利用超声波细胞破碎仪(IID, Scientz), 在冰浴条件下破碎细胞, 离心收集细胞裂解液保存于-80℃条件下待测。严格按照试剂盒说明书进行指标测定, 利用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性, 用H2O2分解法测定CAT活性; 采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量, PC含量测定采用2, 4-二硝基苯肼法测定, 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定8-OHdG含量; 利用BCA检测试剂盒测定各样本蛋白含量。每个处理浓度和时间均设3个重复。
1.4 数据分析数据经Excel 2016初步整理后, 采用SPSS 20.0软件中的单因素方差分析(one-way ANOVA)进行统计分析, 多重比较采用Tukey法进行, 结果以平均值和平均值标准误(SEM)表示, P < 0.05为差异显著。
2 结果 2.1 细胞的体外培养、形态观察及鉴定分离获得的细胞长势较快, 形状细长, 呈纺锤体形和梭形, 整体较一致, 当细胞密度较高时, 具有明显的方向性(图 1)。利用免疫荧光方法, 采用肌肉细胞特异性表达蛋白(MyoD1和PAX7)对分离的细胞进行鉴定。结果表明, MyoD1和PAX7蛋白几乎在所有细胞中均得到阳性表达(图 2), 说明分离得到的细胞为肌卫星细胞, 且具有较高纯度。利用流式细胞仪对MyoD1和PAX7阳性率进行检测(图 3), 发现二者的阳性率均为93%以上, 进一步说明细胞的纯度较高。
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图 1 肉牛肌肉细胞的形态学观察 Fig. 1 Morphological observation of beef cattle muscle cells (A:100×, B:200×) |
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A:生肌决定因子1 MyoD1;B:配对盒基因7 PAX7。 图 2 肉牛肌肉细胞的免疫荧光鉴定 Fig. 2 Immunofluorescence identification of beef cattle muscle cells (100×) |
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A:对照 control; B:生肌决定因子1 MyoD1;C:配对盒基因7 PAX7;FITC-A:异硫氰酸荧光素-A fluorescein isothiocyanate-A。 图 3 流式细胞仪检测细胞MyoD1和PAX7阳性率 Fig. 3 Positive rate of MyoD1 and PAX7 by flow cytometry |
由图 4可见, 随着H2O2浓度由0提高至450 μmol/L, 处理24 h以后, 视野内细胞形态逐渐发生变化, 细胞缩小, 数量减少, 到450 μmol/L时细胞从壁上脱落, 发生明显死亡现象。由图 5可见, 随着H2O2浓度的升高, 存活率持续降低, 与0浓度H2O2处理相比, 当浓度提升至300 μmol/L时, 存活率降为65.4%(P < 0.05), 浓度为450 μmol/L时, 仅剩6.7%(P < 0.05)。如表 1所示, 随着H2O2浓度的升高, ROS水平先略微降低后显著升高(P < 0.05), 当H2O2浓度超过300 μmol/L时显著高于浓度为0时(P < 0.05), 浓度升至450 μmol/L时, ROS水平较浓度为0时提升近4倍(P < 0.05)。抗氧化酶活性结果表明, SOD和CAT活性均随H2O2浓度升高, 呈先升高后降低的变化趋势。其中SOD活性在H2O2浓度为300 μmol/L后显著低于浓度为0时(P < 0.05), CAT活性在H2O2浓度为450 μmol/L时显著低于浓度为0时(P < 0.05)。MDA和PC含量均随H2O2浓度升高逐渐升高, MDA含量在H2O2浓度为250 μmol/L后显著高于浓度为0时(P < 0.05), PC含量在H2O2浓度为300 μmol/L后显著高于浓度为0时(P < 0.05)。随着H2O2浓度的升高, 8-OHdG含量呈先升高后降低的趋势, 在H2O2浓度为200 μmol/L后显著高于浓度为0时(P < 0.05), 浓度超过350 μmol/L后与浓度为0时无显著差异(P>0.05)。
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表 1 不同浓度H2O2处理24 h对肌肉细胞氧化还原状态的影响 Table 1 Effects of different concentrations of H2O2 on redox status of muscle cells for 24 h |
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图 4 不同浓度H2O2对肌肉细胞形态的影响 Fig. 4 Effects of different concentrations of H2O2 on morphology of muscle cells (100×) |
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数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。图 6同。 Value columns with different small letter superscrits mean significant difference (P < 0.05). The same as Fig. 6. 图 5 不同浓度H2O2对肌肉细胞存活率的影响 Fig. 5 Effects of different concentrations of H2O2 on cell viability of muscle cells |
综合上述结果, 选用以300 μmol/L H2O2为适宜浓度, 进一步对肌肉细胞处理0.75、1.5、3、6、12、24 h, 筛选适宜作用时间。由图 6可见, 随着H2O2作用时间的延长, 细胞存活率显著降低, 与0 h时相比, 至6 h时降至61.2%(P < 0.05), 至12 h时, 存活率最低, 为47.4%(P < 0.05), 但当作用时间继续延长至24 h时, 存活率开始升高, 但仍显著低于0 h时(P < 0.05)。由表 2可知, 与0 h时相比, H2O2处理0.75 h后ROS水平显著升高约18倍(P < 0.05), 随后缓慢下降, 当超过6 h后, 降至与0 h时无显著差异(P>0.05)。抗氧化酶方面, SOD和CAT活性均呈先升高后降低的变化趋势。其中, SOD活性在0.75~6 h显著升高(P < 0.05), 12 h后与0 h时无显著差异(P>0.05);CAT活性在0.75~12 h显著升高(P < 0.05), 24 h时与0 h时无显著差异(P>0.05)。氧化产物方面, MDA含量在加入H2O2 1.5 h后开始显著升高(P < 0.05), 24 h时最高; PC含量在加入H2O2 0.75 h后显著升高(P < 0.05), 6 h时最高; 8-OHdG含量在6 h后显著升高(P < 0.05), 24 h时达最高。
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表 2 300 μmol/L H2O2不同处理时间对肌肉细胞氧化还原状态的影响 Table 2 Effects of different treatment time of 300 μmol/L H2O2 on redox status of muscle cells |
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图 6 H2O2不同处理时间对肌肉细胞存活率的影响 Fig. 6 Effects of different treatment time of H2O2 on cell viability of muscle cells |
肌肉细胞是开展肌肉性状形成、品质调控及疾病控制等机理研究的重要素材。本试验选用体重为250 kg左右、处于快速生长期的青年公牛, 采集背最长肌, 利用组织块培养法进行肌肉细胞的分离培养。形态学观察结果表明, 分离获得的细胞长势速度快, 光镜下观察细胞呈纺锤体形、梭形, 符合肌肉细胞的一般形态[17]。当生长密度培养至较高时, 细胞具有明显的按方向排列生长和融合的倾向, 这与肌肉卫星细胞的功能特性相一致[18]。随后, 选用MyoD1和PAX7这2个肌肉细胞的特异性蛋白对细胞进行鉴定。其中, MyoD1参与肌细胞的定型, 其表达说明细胞处于活化状态, 是肌肉细胞增殖的标记蛋白[19], PAX7是肌卫星细胞生长和增殖的重要基因, 是卫星细胞特异表达的蛋白[20]。本研究采用免疫荧光方法检测MyoD1、PAX7蛋白的表达, 发现几乎所有细胞均明显表达上述2种蛋白; 用流式细胞仪检测阳性率, 发现二者表达阳性率均在93%以上, 进一步说明本研究分离获得的细胞为肌卫星细胞, 且具有较高纯度[14-15]。
3.2 肌肉细胞氧化应激模型的建立采用H2O2处理是建立细胞氧化应激模型普遍采用的一种方式, 作为活性氧的一种, H2O2具有稳定性高、造模效果理想等诸多优点[10]。同时, 在畜禽正常生理过程中即有H2O2产生, 且在应激条件下水平更高[21]。因此, 本研究选用H2O2构建氧化应激模型不仅稳定, 更具现实意义。细胞氧化应激模型的建立关键在于确定H2O2的适宜作用浓度和时间, 剂量过小或作用时间不足时不易产生显著性差异, 剂量过大或作用时间较长则会导致细胞大量死亡, 无法满足试验需求或对细胞状态做出准确评价[22]。
3.2.1 不同浓度H2O2对肌肉细胞氧化损伤的影响本研究表明, 视野内的细胞数量随H2O2浓度的升高逐渐减少, 直至从壁上脱落, 表明H2O2对细胞具有损伤作用且可致细胞死亡。细胞存活率数据表明, H2O2浓度升至300 μmol/L时存活率降至60%左右, 到450 μmol/L时仅剩6.7%。Cai等[23]研究表明, IPEC-J2细胞的存活率随H2O2浓度升高显著降低, 当浓度超过2 000 μmol/L时出现细胞死亡现象, 选择1 000 μmol/L(存活率为70%左右)为最佳造模浓度。Jin等[24]报道, 奶牛乳腺上皮细胞存活率随H2O2浓度的升高显著降低, ROS水平最高升至3倍左右, 到500 μmol/L时存活率降至66%, 1 000 μmol/L时降至30%, 并选择以500 μmol/L H2O2组为氧化应激模型组。戴青里等[25]研究发现, 随着H2O2浓度由100升至1 000 μmol/L, 人脐静脉内皮细胞形态缩小、间隙增大, 存活率显著降至30%左右, 推荐800 μmol/L(存活率为65%左右)为适宜浓度。据报道, 细胞氧化应激模型的适宜H2O2浓度在100~2 000 μmol/L[22], 尽管不同类型的细胞对H2O2的反应敏感程度不一致, 但多数研究均以细胞存活率在60%~70%之间为参考推荐适宜作用浓度, 因此初步判断本研究以300 μmol/L H2O2为宜。
为了进一步确定H2O2适宜浓度, 对细胞的氧化还原状态进行了系统评价。H2O2是ROS的一种, 极易透过细胞膜, 引起ROS水平升高, 同时H2O2在体内亚铁离子环境下可通过Fenton反应生成更高活性的羟自由基(·OH), 从而对细胞造成更加剧烈的氧化损伤[10]。本研究发现, 当H2O2的浓度较低时, 细胞的ROS水平略微降低, 随后逐渐升高, 当H2O2浓度超过300 μmol/L时显著提高, 最高升至对照组的近4倍。维持氧化还原状态平衡是细胞发挥生理功能的基础, 细胞在正常代谢过程中即产生自由基, 如线粒体的呼吸作用等。但当受外界刺激时, 自由基水平急剧升高, 抗氧化系统即启动。抗氧化系统包括酶系统和非酶系统, 其中抗氧化酶系统是机体对抗自由基介导的氧化损伤的重要防御系统。SOD和CAT是保护细胞免受氧化损伤的主要抗氧化酶, 且二者存在协同关系。SOD可催化超氧阴离子自由基歧化生成H2O2[23], CAT又可将H2O2分解成水与氧气[26], 从而协同降低ROS水平。抗氧化酶活性分析结果发现, 当H2O2浓度较低时, SOD和CAT的活性显著升高, 说明ROS激活了细胞的抗氧化系统, 抗氧化酶有效清除了ROS, 从而略微降低了ROS的总体水平。但是, 随着H2O2浓度的继续升高, ROS水平居高不下, 过量的ROS超出抗氧化系统的清除能力, 抗氧化酶活性开始降低[6]。本研究发现, SOD活性在H2O2浓度大于250 μmol/L后显著降低, CAT活性在450 μmol/L后显著降低, 抗氧化系统的破坏导致氧化还原状态失衡, 引起氧化损伤。MDA是脂质过氧化反应的终产物, PC是蛋白质发生氧化的标志物, 8-OHdG常用于反映核酸的氧化程度, 3种产物共同反映细胞的氧化损伤程度[27]。本研究中, MDA、PC和8-OHdG含量均在H2O2浓度超过一定量后显著升高, 这与已有报道结果[28-30]一致, 说明细胞的氧化还原状态平衡被打破后, 转而快速向氧化损伤方向发展, 细胞的功能性物质如脂质、蛋白质和核酸等均会被ROS攻击, 最终引起细胞功能紊乱和死亡, 这也与8-OHdG含量在高浓度H2O2时降低相一致。通过评价细胞氧化应激模型的各项判断指标, 确定以300 μmol/L H2O2为适宜造模浓度。
3.2.2 H2O2不同处理时间对肌肉细胞氧化损伤的影响细胞氧化应激模型中, H2O2的处理时间同样也是一个重要的参数。Young等[31]在Caco-2细胞系上构建的氧化应激模型为1 000 μmol/L H2O2处理6 h。Quincozes-Santos等[32]选用以1 000 μmol/L H2O2处理0.5 h来构建的C6星形细胞系的氧化应激模型。金晓露[33]通过比较H2O2不同作用时间对奶牛乳腺上皮细胞的存活率、自由基水平和抗氧化能力, 推荐以500 μmol/L H2O2处理24 h为氧化应激模型。大量研究报道, 在H2O2造模中, 处理时间的跨度较大(0.5~24 h), 这可能与细胞类型和研究目的不同有关(如急性损伤、慢性损伤等)[22]。在本研究中, 细胞存活率随着H2O2作用时间的延长逐渐降低, 6 h时降至60%左右, 与上述报道一致。但当H2O2作用时间延长至24 h时, 存活率反而开始升高, 推测细胞虽然受到氧化损伤, 但并未全部凋亡, 随着H2O2逐渐被消耗或分解, 细胞增殖数量开始提高[12]。氧化还原状态分析表明, H2O2作用短时间内, ROS水平大幅度提高, 激活了细胞的抗氧化系统[34], 表现为SOD和CAT活性的升高。但当H2O2作用时间继续延长, 破坏了细胞的抗氧化系统, 导致抗氧化酶活性降低, 氧化程度开始加剧, 这也与检测到的各种氧化产物(MDA、PC和8-OHdG)含量不断升高相一致。综合各项指标变化规律, 推荐以6 h为肉牛肌肉细胞造模的适宜时间。
4 结论本研究以肉牛背最长肌为材料, 采用组织块法成功分离培养肉牛肌肉细胞, 免疫荧光法及流式细胞仪鉴定表明细胞为肉牛肌卫星细胞。利用H2O2成功建立肉牛肌肉细胞氧化应激模型, 适宜作用浓度为300 μmol/L, 作用时间为6 h。
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