2. 浙江农业科学院省部共建农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室, 杭州 310021;
3. 浙江农业科学院农产品质量标准研究所, 杭州 310021;
4. 金华市农业科学研究院畜牧兽医研究所, 金华 321017
2. State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-Products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China;
3. Institute of Quality and Standard for Agro-Products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China;
4. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Jinhua Academy of Agricultural Sciences, Jinhua 321017, China
饲粮纤维指不能被哺乳动物消化酶所消化的所有饲料成分,包括纤维素、半纤维素、木质素、果胶和β-葡聚糖等[1],来源于植物,主要存在于植物的细胞壁。植物细胞壁越成熟,角质成分含量越高,越难以消化,因此饲粮纤维能稀释饲粮能量水平,降低营养物质的消化吸收率,但其刺激肠道健康、增加饱腹感、影响动物行为以及总体上改善动物健康[2]。饲粮纤维作为肠道后端细菌发酵的主要物质,其发酵的主要产物是短链脂肪酸(short chain fatty acids, SCFA),SCFA能够通过刺激肠上皮细胞的增殖来促进肠道的发育[3];同时,SCFA产生的酸性环境能够抑制肠道中病原菌的生长,如沙门氏菌和大肠杆菌等[4]。肠道菌群对SCFA的产生有重要影响,菌群结构的变化可相应地改变SCFA含量[5]。
猪肠道内栖息着种群庞杂的微生物,这些肠道微生物在参与物质代谢、营养转化、抵御外来致病菌的侵入以及调节免疫等方面发挥着重要作用[6-7]。小肠中的优势菌是乳酸杆菌(Lactobacillus)和链球菌(Streptococcus);大肠中的优势菌是拟杆菌(Bacteroides)、梭菌属(Clostridia)、链球菌、乳酸杆菌、普雷沃氏菌(Prevotella)、光岗菌属(Mitsuokella)、巨型球菌(Megasphaera)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)和真细菌(Eubacteria)等[8]。饲粮中添加不同水平或不同类型的纤维可影响猪肠道菌群结构与组成。顾宪红等[9]研究发现,饲粮中添加1%菊粉可提高仔猪盲肠内乳酸杆菌和双歧杆菌属(Bifidobacterium)的数量。Han等[10]发现在公猪饲粮中添加猕猴桃纤维可改变其结肠群落结构,增加结肠细菌总数和拟杆菌属(Bacteroides)细菌数量,降低肠杆菌属(Enterobacteria)和大肠埃希菌(Escherichia coli)数量。张玲等[11]在“杜长大”育肥阉公猪中分别添加7.14%燕麦β-葡聚糖(可溶饲粮纤维组)和5.05%微晶纤维素(不可溶饲粮纤维组),发现可溶饲粮纤维组猪直肠细菌香农(Shannon)指数降低,不可溶饲粮纤维组则相反;可溶饲粮纤维组厚壁菌门(Firmicutes)细菌数量显著降低,总SCFA含量也降低。金华猪是我国优良的地方品种,具有肉质好和耐粗饲等特征,但是目前金华猪的饲养主要参照NRC标准配制饲粮,导致饲粮中的纤维含量较低,生长潜能受到限制。因此,本文重点研究不同饲粮纤维水平对金华猪生长性能、盲肠菌群结构和SCFA含量的影响,为金华猪在生产中选择合理饲粮纤维水平提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 试验设计、饲粮组成及饲养管理选取初始平均体重为54.27 kg的育肥期金华猪45头,随机分为3组,分别为低纤维组(LF组)、中纤维组(MF组)和高纤维组(HF组),每组5个重复,每个重复3头猪。LF组饲喂基础饲粮(参考国家标准GB/T 2417—2008《金华猪》配制),MF组和HF组分别饲喂在基础饲粮中添加7.5%和15.0%苜蓿粉的饲粮;LF组、MF组和HF组饲粮中的纤维水平分别为3.86%、4.55%和5.92%。试验期为60 d,试验过程猪只自由饮水和采食,饲养结束后称重。饲养地点为金华农科院试验牧场。饲粮组成及营养水平见表 1。
试验结束后,每个重复选取接近平均体重的1头猪进行屠宰,采集盲肠内容物,液氮速冻置于干冰中转运至实验室,-80 ℃保存。
1.2 DNA提取用QIAamp DNA Stool Mini Kit(QIAGEN,CA,美国)试剂盒提取金华猪盲肠内容物微生物基因组DNA,操作参照试剂盒使用说;使用NanoDrop 2000紫外分光光度计测定提取的DNA纯度和含量,并采用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。
1.3 细菌和功能基因丰度的实时荧光定量PCR分析参照Xu等[12]的引物序列(表 2)对金华猪盲肠的总菌、厚壁菌门、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、乳酸杆菌、梭菌群Ⅰ(Clostridium cluster Ⅰ)、梭菌群Ⅳ(Clostridium cluster Ⅳ)、梭菌群ⅩⅣa(Clostridium cluster ⅩⅣa)、丁酰辅酶A乙酸辅酶A转移酶和丁酸激酶基因的相对丰度进行实时荧光定量PCR分析。实时荧光定量PCR在ABI 7500型定量PCR仪(ABI,美国)中进行。反应体系为10 μL,其中包含了5.0 μL SYBRTM Green qPCR mix,上、下游引物各0.5 μL,ddH2O 4.0 μL。条件设置成95 ℃,2 min;95 ℃,15 s;58 ℃,45 s;72 ℃,1 min;共35个循环,每个样品做3个重复。最终依据测得的Ct值与标准曲线比较计算样品中DNA拷贝数(基因丰度)。
高通量测序由明科生物技术(杭州)有限公司完成。使用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)对细菌16S rRNA基因V4~V5区进行PCR扩增,采用Illumina Hiseq高通量测序平台进行测序。
1.5 SCFA含量测定参照Xiao等[13]的方法,取0.1 g左右金华猪盲肠内容物,置于1.5 mL离心管中,加入9倍体积(mL)的超纯水,混匀后12 000 r/min离心10 min,取上清液0.5 mL装于1.5 mL离心管中,再加入0.1 mL的25%(质量体积分数)偏磷酸与巴豆酸混合溶液,-20 ℃过夜保存。上样前使用0.22 μm滤膜进行过滤,滤液12 000 r/min离心10 min,然后取500 μL上清液于气相色谱仪测定SCFA含量,色谱柱为毛细管色谱柱(InertCap FFAP)。色谱条件为:柱温110 ℃,汽化室温度180 ℃;使用氢火焰离子化检测器(FID),检测温度180 ℃;载气为氮气,压力为60 kPa,氧气压力为50 kPa,氢气压力为50 kPa,灵敏度为10-1,衰减3.0。
1.6 统计分析试验数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),采用Duncan氏法进行组间比较,P < 0.05为显著性差异,结果用平均值和SEM表示。
2 结果 2.1 不同饲粮纤维水平对金华猪生长性能的影响由表 3可知,随着饲粮纤维水平的升高,金华猪体重呈现上升的趋势(P>0.05),HF组平均日增重显著高于LF组(P < 0.05),说明较高的饲粮纤维水平(5.92%)有益于育肥期(体重55~90 kg)金华猪体重的增加。
随机抽到的序列数与观测到的操作分类单元(OTU)数量构建的稀释曲线结果如图 1所示。各样品曲线逐渐趋于平缓,说明有效测序数量已经能够较好地覆盖菌群的多样性。
3组样品的有效序列数均较高,在57 804~65 995(表 4)。用Mothur软件计算在97%相似水平上各样品的OTU数量,并进行α多样性分析发现,纤维处理对育肥期金华猪盲肠菌群结构的α多样性无显著影响(P>0.05)。
对金华猪盲肠中的菌群结构进行分析发现,在门水平上,优势菌门分别是厚壁菌门、拟杆菌门、软壁菌门(Tenericutes)和变形菌门(Proteobacteria),其占盲肠菌群的90%以上(图 2)。随着饲粮中纤维水平的升高,金华猪盲肠中拟杆菌门的相对丰度显著升高(P < 0.05)。
在属水平上,相对丰度最高的10个菌属分别是拟杆菌目S24-7菌属(Bacteroidales S24-7 group norank)、拟普雷沃氏菌属(Alloprevotella)、普雷沃氏菌科UCG-003菌属(Prevotellaceae UCG-003)、毛螺菌科XPB1014菌属(Lachnospiraceae XPB1014 group)、瘤胃球菌科UCG-005菌属(Ruminococcaceae UCG-005)、理研菌科肠道RC9菌属(Rikenellaceae RC9 gut group)、普雷沃氏菌科NK3B31菌属(Prevotellaceae NK3B31 group)、未分类毛螺菌科菌属(Lachnospiraceae unclassified)、未分类普雷沃氏菌科菌属(Prevotellaceae unclassified)和拟杆菌属。其中,拟杆菌目S24-7菌属和拟普雷沃氏菌属的相对丰度随着饲粮纤维水平的升高而升高。各样品中相对丰度最高的50个菌属热点图见图 3。
用实时荧光定量PCR对金华猪盲肠菌群和功能基因进行定量分析结果见表 5。不同饲粮纤维水平对总菌、厚壁菌门、肠杆菌科、拟杆菌门、梭菌群Ⅳ、梭菌簇ⅩⅣa、丁酸激酶基因丰度无显著影响(P>0.05)。金华猪盲肠中乳酸杆菌、梭菌群Ⅰ和丁酰辅酶A乙酸辅酶A转移酶的基因丰度随着饲粮纤维水平的升高而升高(P < 0.05)。
由表 6可知,饲粮纤维水平对金华猪盲肠中乙酸、丙酸、异丁酸、戊酸和异戊酸含量无显著影响(P>0.05),但丁酸和总SCFA含量随着饲粮纤维水平的升高而增加(P < 0.05)。
目前关于饲粮纤维水平对猪生长性能的研究较多。李晶等[14]在肥育期荣昌猪的饲粮中添加15%米糠降低了荣昌猪平均日增重,但对猪平均日采食量和料重比无显著影响。Herfel等[15]在仔猪饲粮中添加10%米糠,提高了饲料转化率,但对平均日采食量及平均日增重无显著影响。张玲等[11]研究发现添加7.14%的燕麦β-葡聚糖或5.05%微晶纤维素对生长猪的平均日增重无显著影响,料重比有降低趋势。张叶秋等[16]在试验中添加34.8%的米糠替代部分玉米,发现苏淮猪平均日采食量降低,对平均日增重和料重比均无显著影响。蒲广等[17]试验发现,苏淮猪平均日增重、粗蛋白质消化率随饲粮纤维水平升高而降低。在本研究中,随着饲粮纤维水平的升高,育肥期金华猪体重呈现上升的趋势,平均日增重显著升高,说明饲粮中纤维水平适当升高对育肥期金华猪的生长性能提高有促进作用。综上所述,因试猪的品猪、生长阶段、饲粮组成和营养水平不同,尤其是不同的猪种和生长阶段对饲粮粗纤维利用能力和适宜水平不同,导致饲粮纤维对猪生长性能结果产生一定的差异。
猪肠道微生物多样性越高,肠道菌群结构越趋于稳定,肠道则更健康[18]。Liu等[19]研究发现,与对照组相比,饲喂含5%玉米麸的仔猪具有更高的菌群Shannon指数,表明玉米麸可增加仔猪肠道菌群多样性。王鹏[20]研究表明,随着饲粮纤维水平提高,猪盲肠菌群Shannon指数呈先增加后降低的趋势,但均高于对照组,也证实了饲粮纤维对猪肠道微生物多样性具有促进作用。但Liu等[21]研究结果表明,小麦麦麸饲粮会刺激猪回肠乳酸菌的生长并产生多种抗菌化合物,抑制其他微生物生长,使猪肠道菌群多样性降低。在本研究中,饲粮纤维水平对育肥期金华猪盲肠菌群的α多样性无显著影响。
饲粮纤维水平提高会诱导大肠内相关纤维分解菌数量增加[22]。本试验通过高通量测序发现,育肥期金华猪盲肠中拟杆菌目S24-7菌属和拟普雷沃氏菌属的相对丰度随着饲粮纤维水平的升高而升高,而拟杆菌属和拟普雷沃氏菌属是重要的降解纤维产生SCFA细菌[23]。通过实时荧光定量PCR进一步对金华猪盲肠中的特定菌群进行定量分析显示,乳酸杆菌、梭菌群Ⅰ基因丰度随饲粮纤维水平的升高而增加。Berrocoso等[24]研究表明,与对照组相比,补充纤维组猪的盲肠中乳酸杆菌数量增加而大肠杆菌数量减少;Wang等[25]研究表明,给阉割公猪饲喂补充了15%的苜蓿纤维饲粮可使其盲肠乳酸杆菌属、脱硫弧菌属数量显著增加;Laitat等[26]研究也指出,饲粮补充24%的甜菜渣能够显著提高生长猪肠道双歧杆菌和乳酸杆菌数量,降低大肠杆菌数量,与本研究中结论一致。纤维改变肠道菌群结构和数量的可能原因是:纤维可作为菌群发酵的底物,促进纤维分解菌的增殖,同时纤维酵解产生SCFA,形成酸性环境抑制部分致病菌的生长,提高有益菌的数量。与之相对应的是,本试验中HF组金华猪盲肠中丁酸及总SCFA含量以及微生物产丁酸关键酶丁酰辅酶A乙酸辅酶A转移酶的基因丰度显著高于LF组。
4 结论① 育肥期金华猪体重随着饲粮纤维水平的升高呈现上升的趋势,平均日增重显著升高,说明适当提高育肥期金华猪的饲粮纤维水平可改善金华猪的生长性能。
② 育肥期的金华猪盲肠中的优势菌门拟杆菌门的相对丰度随饲粮中纤维水平的升高而升高;在属水平上,优势菌属拟杆菌目S24-7菌属和拟普雷沃氏菌属等分解纤维产SCFA菌的相对丰度也升高。相应地,产丁酸关键酶丁酰辅酶A乙酸辅酶A转移酶基因丰度也随着纤维水平的升高而升高,从而提高丁酸等SCFA含量。
[1] |
陈瑾, 邹成义, 杨加豹, 等. 日粮纤维对猪肠道微生态环境的影响研究进展[J]. 中国饲料, 2014(3): 37-41. |
[2] |
王志博, 陆东东, 倪冬姣, 等. 纤维对猪的营养和肠道健康的影响[J]. 国外畜牧学(猪与禽), 2018, 38(6): 93-96. |
[3] |
陈福, 何邵平, 田科雄, 等. 短链脂肪酸的生理功能及其在畜禽生产中的应用[J]. 动物营养学报, 2019, 31(7): 3039-3048. |
[4] |
LINDBERG J E. Fiber effects in nutrition and gut health in pigs[J]. Journal of Animal Science and Biotechnology, 2014, 5(1): 15. |
[5] |
赵秀英, 县怡涵, 李晨博, 等. 灌喂植物乳杆菌和干酪乳杆菌增加仔猪肠道菌群多样性及短链脂肪酸生成[J]. 微生物学报, 2016, 56(8): 1291-1300. |
[6] |
张柏林, 秦贵信, 孙泽威, 等. 仔猪胃肠道微生物菌群定植规律及其功能的研究进展[J]. 中国畜牧杂志, 2009, 45(19): 66-69. |
[7] |
O'HARA A M, SHANAHAN F. The gut flora as a forgotten organ[J]. EMBO Reports, 2006, 7(7): 688-693. |
[8] |
HÖGBERG A, LINDBERG J E. Influence of cereal non-starch polysaccharides and enzyme supplementation on digestion site and gut environment in weaned piglets[J]. Animal Feed Science and Technology, 2004, 116(1/2): 113-128. |
[9] |
顾宪红, 张名涛, 杨琳, 等. 菊粉对断奶仔猪大肠微生物区系及生产性能的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2005, 36(4): 333-336. |
[10] |
HAN K S, BALAN P, GASA F M, et al. Green kiwifruit modulates the colonic microbiota in growing pigs[J]. Letters in Applied Microbiology, 2011, 52(4): 379-385. |
[11] |
张玲, 李华, 赵瑶, 等. 短期饲喂两种类型纤维对生长猪后肠菌群结构和主要代谢产物的影响[J]. 四川农业大学学报, 2019, 37(1): 70-77. |
[12] |
XU J, VERBRUGGHE A, LOURENÇO M, et al. The response of canine faecal microbiota to increased dietary protein is influenced by body condition[J]. BMC Veterinary Research, 2017, 13: 374. |
[13] |
XIAO Y P, LI K F, XIANG Y, et al. The fecal microbiota composition of boar Duroc, Yorkshire, Landrace and Hampshire pigs[J]. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, 2017, 30(10): 1456-1463. |
[14] |
李晶, 周勤飞, 何胜强, 等. 米糠和抗氧化剂对肥育猪生产性能和胴体品质的影响[J]. 饲料工业, 2009, 30(24): 45-47. |
[15] |
HERFEL T, JACOBI S, LIN X, et al. Stabilized rice bran improves weaning pig performance via a prebiotic mechanism[J]. Journal of Animal Science, 2013, 91(2): 907-913. |
[16] |
张叶秋, 郝帅帅, 高硕, 等. 米糠高纤维日粮对苏淮猪生长性能及肠道功能的影响[J]. 南京农业大学学报, 2016, 39(5): 807-813. |
[17] |
蒲广, 黄瑞华, 牛清, 等. 日粮脱脂米糠替代玉米水平对苏淮猪生长性能、肠道发育及养分消化率的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(4): 758-770. |
[18] |
张奇, 杨海天, 孔祥杰, 等. 日粮纤维对猪肠道微生物影响的研究进展[J]. 中国畜牧杂志, 2019, 55(2): 11-14. |
[19] |
LIU P, ZHAO J B, WANG W, et al. Dietary corn bran altered the diversity of microbial communities and cytokine production in weaned pigs[J]. Frontiers in Microbiology, 2018, 9: 2090. |
[20] |
王鹏.发酵玉米秸秆对育肥猪生产性能及盲肠微生物区系的影响[D].硕士学位论文.长春: 吉林农业大学, 2015.
|
[21] |
LIU H Y, IVARSSON E, DICKSVED J, et al. Inclusion of chicory (Cichorium intybus L.) in pigs' diets affects the intestinal microenvironment and the gut microbiota[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(12): 4102-4109. |
[22] |
JHA R, BERROCOSO J F D. Dietary fiber and protein fermentation in the intestine of swine and their interactive effects on gut health and on the environment:a review[J]. Animal Feed Science and Technology, 2016, 212: 18-26. |
[23] |
ZHAO L P, ZHANG F, DING X Y, et al. Gut bacteria selectively promoted by dietary fibers alleviate type 2 diabetes[J]. Science, 2018, 359(6380): 1151-1156. |
[24] |
BERROCOSO J D, MENOYO D, GUZMÁN P, et al. Effects of fiber inclusion on growth performance and nutrient digestibility of piglets reared under optimal or poor hygienic conditions[J]. Journal of Animal Science, 2015, 93(8): 3919-3931. |
[25] |
WANG J W, QIN C F, HE T, et al. Alfalfa-containing diets alter luminal microbiota structure and short chain fatty acid sensing in the caecal mucosa of pigs[J]. Journal of Animal Science and Biotechnology, 2018, 9: 11. |
[26] |
LAITAT M, ANTOINE N, CABARAUX J F, et al. Influence of sugar beet pulp on feeding behavior, growth performance, carcass quality and gut health of fattening pigs[J]. Biotechnologies, 2015, 19(1): 20-31. |