养殖和野生水生动物通常面临因栖息地破坏、季节变化和短期食物资源匮乏而导致的饥饿胁迫[1-3]。蜕皮、繁殖以及外界温度的变化同样使得很多动物减少食物的摄食量[4]。饥饿胁迫后，水生动物会采取相应的活动行为、生理生化代谢，以降低在饥饿条件下的维持代谢[2]。然而，不同物种在饥饿期间对营养物质的代谢利用存在一定的差异。饥饿胁迫下大多数动物主要消耗机体储存的糖原和脂类物质来维持其基础代谢，其中甘油三酯中的脂肪酸是饥饿期间水生动物能量需求的主要来源之一[5-6]。研究发现，饥饿期间不同物种对机体脂肪酸的利用顺序不同[7]。革胡子鲶(Clarias gariepinus)饥饿导致C14 : 0、C16 : 1n-9和C18 : 1n-9等脂肪酸的相对含量下降，C20 : 5n-3(eicosapentaenoic acid, EPA)和C22 : 6n-3(docosahexaenoic acid, DHA)的相对含量升高[8]。大西洋鲑(Salmo salar)[9]、罗非鱼(Oreochromis mossambicus×O. niloticus)[10]和鱼(Miichthys miiuy)[11]在饥饿期间首先利用饱和脂肪酸(saturated fatty acids, SFA)，然后利用单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acids, MUFA)供应能量，且以n-9>n-6>n-3顺序利用各种单体脂肪酸，多不饱和脂肪酸(poly unsaturated fatty acids, PUFA)尤其是C20 : 4n-6(arachidonic acid, ARA)、EPA和DHA等被优先选择性保留下来。
彭泽鲫(Carassius auratus var. Pengze)隶属鲤形目鲤科鲫属，为鲫鱼的一个品种，是江西省水产科学研究所和九江市水产科学研究所经过7年6代从野生鲫鱼中选育获得的一个优良养殖品种，1989年通过农业部水产原种和良种审定委员会的审定。它具有生长快、耐低氧、抗病力强、病害少、不易脱鳞、肉质鲜美等诸多优良性状[12]，已成为我国重要的鲫鱼养殖品种之一。饲养条件下饲养密度过大、投饲不均、投喂不及时等原因均会造成彭泽鲫饥饿现象，尤其是冬季野外活饵不足的情况下。但有关饥饿胁迫对彭泽鲫脂肪酸代谢和代谢酶基因表达的影响尚未见报道。本文探讨了饥饿胁迫对彭泽鲫幼鱼形体指标、肌肉脂肪酸组成和脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)基因表达的影响，旨在丰富彭泽鲫生理学基础知识，为其健康养殖提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验鱼及饲料彭泽鲫由江西省水产科学研究所育种室提供，正式试验前在循环水系统中驯养14 d，投喂鲫鱼商品饲料，主要营养水平见表 1。每日投喂2次，饱食投喂。试验设置饥饿时间分别为0(对照组)、14(S14组)、28 d(S28组)的3组，每组设3个重复，以重复为单位养殖于9个圆形养殖桶(规格为直径800 mm×高650 mm)内，每桶放养健康无病、规格、体质量基本一致的彭泽鲫幼鱼20尾，初始体质量约为(14.35±0.59) g。
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表 1 鲫鱼商品饲料的主要营养水平(干物质基础) Table 1 Proximate nutrient levels of commercial feed of Carassius auratus (DM basis) |
饥饿试验开始后，每天吸污1次并监测水温和水质状况，24 h充氧，确保养殖水质的清新。整个试验期间水质监测情况为:水温(26.0±1.5) ℃，溶解氧浓度不低于7 mg/L，pH 7.53±0.12，氨氮和亚硝酸浓度不高于0.1 mg/L。光周期为自然周期。
1.3 样品采集与分析按照试验设计，对照组、S14组、S28组分别在饥饿0、14、28 d时采集样本，每个重复采集6尾幼鱼，经MS-222麻醉，称体质量后采血，测量体长和全长；冰上解剖，称取内脏总质量、肝脏质量，迅速剪取米粒大小肝脏组织，放入液氮中用于分析LPL基因表达；取侧线背侧的肌肉，于-20 ℃冰箱保存，分析肌肉水分、粗蛋白质、粗脂肪和脂肪酸等营养成分的含量。
饲料、肌肉常规营养成分含量的测定参照AOAC(2016)[13]的方法进行，其中水分、粗脂肪和粗蛋白质含量分别采用恒温(105 ℃)干燥法、索氏抽提法和凯氏定氮法测定，粗灰分含量采用550 ℃马福炉灼烧法测定，粗纤维含量采用酸碱消煮法测定。采用气质联用(GC-MS)技术分析脂肪酸组成，参考Zuo等[14]的方法检测各脂肪酸含量。
按照Trizol试剂(北京全式金生物技术有限公司)说明书提取彭泽鲫肝脏总RNA，分别用ND-2000核酸定量检测仪(NanoDrop，美国)和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度和质量。按照One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金生物技术有限公司)试剂盒说明书进行RNA反转录，合成cDNA第1链。
根据已知的彭泽鲫LPL(GenBank序列号：FJ204474)[15]cDNA序列采用Primer Premier 5.0软件设计实时荧光定量PCR引物，检测引物特异性及扩增效率，筛选后每个基因各得到1对特异性引物，引物序列见表 2，引物由深圳华大基因科技有限公司合成。
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表 2 实时荧光定量PCR引物序列 Table 2 Primer sequences of real-time quantitative PCR |
定量检测仪器为实时荧光定量PCR仪(LightCyclerⓇ 96，Roche，瑞士)，反应体系为20 μL，上、下游引物各1.0 μL，10 μL 2×conc SYBR Green Ⅰ Master(罗氏，瑞士)，1 μL cDNA模板和7 μL DEPC水。反应条件为：95 ℃ 2 min，紧接着95 ℃ 15 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共45个循环。以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因[15]，以对照组目的基因mRNA表达量为1，采用2-ΔΔCt法[16]得到各组目的基因的mRNA相对表达量。
1.4 计算公式
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试验所得数据用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析，差异达到显著水平(P＜0.05)时，采用Turkey’s法进行组间的多重比较。试验结果以平均值±标准误(mean±SE)表示。
2 结果 2.1 饥饿胁迫对彭泽鲫幼鱼形体指标的影响饥饿胁迫对彭泽鲫幼鱼形体指标的影响见表 3。随着饥饿胁迫时间的延长，彭泽鲫幼鱼的体质量、HSI、VSI和CF均呈下降的趋势，S28组幼鱼的体质量、HSI、VSI、CF均显著低于对照组(P < 0.05)；S14组幼鱼仅CF显著低于对照组(P < 0.05)，其他指标与对照组差异不显著(P>0.05)。
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表 3 饥饿胁迫对彭泽鲫幼鱼形体指标的影响 Table 3 Effects of starvation stress on physical indices of juvenile Carassius auratus var. Pengze |
饥饿胁迫对彭泽鲫幼鱼肌肉营养成分含量的影响见表 4。彭泽鲫幼鱼肌肉粗脂肪和粗蛋白质含量随饥饿时间的延长急剧下降，S28组显著低于对照组(P < 0.05)，与S14组无显著差异(P>0.05)；肌肉水分含量随饥饿时间的延长而上升，S28组显著高于对照组(P < 0.05)，与S14组无显著差异(P>0.05)。
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表 4 饥饿胁迫对彭泽鲫幼鱼肌肉营养成分含量的影响 Table 4 Effects of starvation stress on muscle nutritional component contents of juvenile Carassius auratus var. Pengze |
饥饿胁迫对彭泽鲫幼鱼肌肉脂肪酸组成的影响见表 5。S28组幼鱼肌肉中C16 : 0、C18 : 1n-9、总SFA和总MUFA的相对含量显著低于对照组、S14组(P < 0.05)，DHA、ARA、总PUFA、总高不饱和脂肪酸(highly unsaturated fatty acids，HUFA)、n-3PUFA和n-6PUFA相对含量显著高于对照组、S14组(P < 0.05)；S28组、S14组幼鱼肌肉中EPA的相对含量显著低于对照组(P < 0.05)。
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表 5 饥饿胁迫对彭泽鲫幼鱼肌肉脂肪酸组成的影响(占脂肪酸的百分比) Table 5 Effects of starvation stress on fatty acid composition in muscle of juvenile Carassius auratus var. Pengze (percentage of total fatty acids) |
如图 1所示，随着饥饿时间的延长，幼鱼肝脏中LPL mRNA相对表达量呈先增后降的趋势，S14组显著高于对照组和S28组(P < 0.05)。
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图 1 饥饿胁迫对彭泽鲫幼鱼肝脏脂蛋白脂酶基因表达的影响 Fig. 1 Effects of starvation stress on LPL gene expression in liver of juvenile Carassius auratus var. Pengze |
自然生态条件下，鱼类面临季节性饥饿的现象普遍存在，导致鱼体消耗自身储备的能量物质，出现机体负增长[17-18]。本试验中，彭泽鲫饥饿28 d时，体质量显著下降，这与吉富罗非鱼(GIFT，Oreochromis niloticus)[19]、南乳鱼(Galaxias maculatus)[20]、虹鳟(Oncorhynchus mykiss，Walbaum，1792)[21]等的研究结果一致。CF和HSI的变化在一定程度上反映了鱼体在饥饿状态下自身营养物质的消耗与积累[22]，是对长期和短期营养方式非常敏感的形态学指标[23]。彭泽鲫幼鱼在饥饿28 d时，HSI显著下降，这表明彭泽鲫幼鱼在饥饿过程中会大量动用肝脏中储存的能量物质，特别是脂肪，导致饥饿幼鱼的HSI显著下降。对银鲳(Pampus argenteus)幼鱼的研究发现，饥饿致死时的幼鱼CF是正常鱼的59%~75%[24]，而在本试验中，饥饿使彭泽鲫幼鱼的CF逐渐降低，饥饿28 d时，幼鱼的CF只有对照组的55%，但未致死，说明不同种类的鱼对饥饿的耐受力存在较大的差异。对金头鲷(Sparus aurata)[25]、刀鲚(Coilia nasus)[26]等鱼类的研究发现，饥饿胁迫导致CF和HSI显著降低。
鱼类面对食物不足或饥饿等营养限制时，需利用自身贮存的营养物质如碳水化合物、脂肪和蛋白质等来提供能量[21, 27]；通常鱼类先消耗脂肪和糖原，再利用蛋白质作为能量维持生长代谢和正常生命活动的需要[28]。本试验观察到，彭泽鲫幼鱼肌肉粗脂肪和粗蛋白质含量在饥饿28 d时显著下降，但粗脂肪含量的降幅大于粗蛋白质含量的降幅，表明彭泽鲫幼鱼在饥饿过程中可同时消耗体内的脂肪和蛋白质来维持代谢活动，但以脂肪为主，类似的结果在吉富罗非鱼[19]、刀鲚[26]、大西洋鲑(Salmo salar)[29]和杂交鳢(Channa argus♂×C. maculate ♀)[30]的研究中也有报道。彭泽鲫在饥饿过程中肌肉水分含量不断增加，这主要是由于肌肉粗脂肪含量下降导致的[31]。
3.2 饥饿胁迫对彭泽鲫幼鱼肌肉脂肪酸组成的影响脂肪酸的氧化在能源供应中起着非常重要的作用[32]。鱼类对自身脂肪酸的利用存在一定的规律性，一般首先利用SFA，其次利用低不饱和脂肪酸，最后才利用HUFA[33]。本研究中，彭泽鲫幼鱼饥饿28 d时，肌肉中总SFA和部分MUFA的相对含量显著下降，总PUFA和总HUFA的相对显著上升，表明彭泽鲫幼鱼对脂肪酸的氧化利用具有高度选择性。其可能的原因是，彭泽鲫组织中的SFA和MUFA易通过线粒体β-氧化为其提供能量[34]，虽然PUFA和HUFA同样可经β-氧化途径分解，但需差向酶和异构酶的参与[35-36]。彭泽鲫这样有选择性的利用SFA和MUFA氧化供能，主要是因为PUFA和HUFA，尤其是ARA和DHA等脂肪酸是磷脂生物膜、视觉和神经系统等的结构组分，具有比供能更加重要的生物功能，被优选保存下来[37-39]。对大黄鱼(Larimichthys crocea)的研究发现，饥饿导致幼鱼肌肉中SFA含量降低，PUFA含量升高，并以此认为，通过适当的饥饿处理，可以较好地改善大黄鱼的肉质[40]。
3.3 饥饿胁迫对彭泽鲫幼鱼肝脏中LPL基因表达的影响在银鲳、金钱鱼(Scatophagus argus)、异育银鲫中科3号(Carassius auratus gibelio var. CAS Ⅲ)等鱼类上的研究表明，鱼类处于短期饥饿状态缺乏外来能源供应时，可通过激活脂肪代谢相关基因[LPL、脂肪酸转运蛋白(FATP)、脂肪酸结合蛋白(FABP)、激素敏感脂肪酶(HSL)、过氧化物酶体增生物激活受体(PPARs)等]的表达，增加脂质的动员和利用，用于机体氧化供能[18, 41-42]。LPL基因的表达量不仅与肌内脂肪沉积有关，而且显著影响血浆中脂质水平，与脂质代谢密切相关[43-44]。目前，LPL的主要功能被认为是催化血浆中乳糜微粒和低密度脂蛋白中的甘油三酯水解，产生甘油和游离脂肪酸为组织提供能量，或再酯化为甘油三酯储存在脂肪组织中[45-46]。本试验中，彭泽鲫幼鱼饥饿14 d时，肝脏中LPL mRNA的相对表达量显著增加，这与在银鲳[41]、金钱鱼[18]、花鲈(Lateolabrax maculatus)[47]和家兔(Oryctolagus cuniculus)[48]上的研究结果一致，暗示饥饿过程中加速了甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油，满足机体能量需求。然而，当彭泽鲫饥饿到28 d时，LPL mRNA的相对表达量又显著下降，这可能是由于肝脏中输出的脂类降低，造成了氧化底物的不足，引起LPL的表达下调，使得能量供应不足，生长代谢受阻。有研究发现，混合营养期的圆斑星鲽(Verasper variegatus)仔鱼因摄食及消化器官发育均不完善，摄食和消化能力较弱，使LPL缺乏底物，从而导致LPL mRNA表达下调[49]。
4 结论① 饥饿胁迫使彭泽鲫幼鱼形体指标如体质量、HSI、VSI和CF发生显著变化。
② 随着饥饿时间的延长，彭泽鲫幼鱼在饥饿过程中可同时消耗体内的脂肪和蛋白质来维持代谢，以动用体内的脂肪为主。
③ 彭泽鲫幼鱼对脂肪酸的氧化利用具有高度选择性，主要利用SFA和MUFA氧化供能，对DHA和ARA有较强的选择性保留能力。
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