动物营养学报    2020, Vol. 32 Issue (6): 2904-2910    PDF    
酵母β-葡聚糖对脂多糖诱导的绵羊淋巴细胞氧化应激损伤的保护作用
于春微1 , 李冬芳1 , 刘世雄1 , 郝凌魁1 , 高民2 , 胡红莲2 , 刘大程1     
1. 内蒙古农业大学兽医学院, 呼和浩特 010018;
2. 内蒙古农牧业科学院动物营养与饲料研究所, 呼和浩特 010031
摘要: 本试验旨在研究酵母β-葡聚糖对绵羊淋巴细胞抗氧化能力的影响。在建立体外脂多糖(LPS)诱导绵羊淋巴细胞氧化应激模型的基础上,通过在培养液中添加不同浓度[0(对照)、5、10、20、50、100 μg/mL]的酵母β-葡聚糖,运用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定酵母β-葡聚糖对细胞活性的影响,用生物化学法测定酵母β-葡聚糖对绵羊淋巴细胞抗氧化指标变化的影响。结果表明:0~20 μg/mL酵母β-葡聚糖作用于淋巴细胞,细胞存活率无显著变化(P>0.05),当使用50 μg/mL酵母β-葡聚糖处理淋巴细胞后,细胞存活率显著降低(P < 0.05);在LPS作用于淋巴细胞后,与对照组相比较,丙二醛(MDA)含量极显著增多(P < 0.01),超氧化物歧化酶(SOD)和氧化氢酶(CAT)活性显著下降(P < 0.05),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性极显著下降(P < 0.01);添加10 μg/mL酵母β-葡聚糖作用6 h后,与LPS组相比较,淋巴细胞内SOD和CAT活性极显著增强(P < 0.01),GSH-Px活性显著增强(P < 0.05),MDA和ROS含量极显著降低(P < 0.01)。综上,LPS可诱导绵羊淋巴细胞氧化应激,酵母β-葡聚糖可抑制LPS诱导的淋巴细胞氧化损伤,对LPS诱导的绵羊淋巴细胞氧化损伤有良好的保护作用,存在剂量依赖效应。
关键词: 酵母β-葡聚糖    淋巴细胞    脂多糖    活性氧    抗氧化    
Protective Effects of β-Glucan from Saccharomyces cerevisiae on Lipopolysaccharide Induced Oxidative Stress Injury in Sheep Lymphocyte
YU Chunwei1 , LI Dongfang1 , LIU Shixiong1 , HAO Lingkui1 , GAO Min2 , HU Honglian2 , LIU Dacheng1     
1. College of Veterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China;
2. Research Institute of Animal Nutrition and Feed, Inner Mongolia Academy of Animal Sciences, Hohhot 010031, China
Abstract: This experiment was conducted to study the effects of β-glucan from Saccharomyces cerevisiae on the antioxidant capacity of sheep lymphocytes. Based on the establishment of lipopolysaccharide (LPS)-induced oxidative stress in sheep lymphocytes, the effects of β-glucan on cell viability were determined by MTT assay by adding different concentrations [0(control), 5, 10, 20, 50 and 100 μg/mL] of β-glucan to the culture medium. The biochemical method was used to determine the effects of β-glucan on the changes of antioxidant indexes in sheep lymphocytes. The results showed as follows: β-glucan showed no cytotoxicity after being applied to lymphocytes at a concentration of 0 to 20 μg/mL, when the concentration of β-glucan was 50 μg/mL, the cell viability decreased significantly (P < 0.05); compared with the control group, the malonaldehyde (MDA) content extremely significantly increased (P < 0.01), superoxide dismutase (ROS) and catalase (CAT) activities extremely significantly decreased (P < 0.05), and glutathion peroxidase (GSH-Px) activity decreased extremely significantly (P < 0.01) in lymphocytes treated by LPS. After adding 10 μg/mL β-glucan for 6 h, compared with the LPS group, the activity of SOD and CAT in lymphocytes extremely significantly increased (P < 0.01), the activity of GSH-Px significantly increased (P < 0.05), and the contents of MDA and ROS extremely significantly decreased (P < 0.01). In conclusions, LPS can induce oxidative stress in sheep lymphocytes. β-glucan can inhibit LPS-induced oxidative injury of lymphocytes and has a good protective effect on LPS-induced oxidative injury of sheep lymphocytes, and there is a dose-dependent effect.
Key words: yeast β-glucan    lymphocyte    lipopolysaccharide    reactive oxygen species    antioxidant    

动物断奶或饮食的变化可导致自由基去除和产生不平衡而引发氧化应激。氧化应激会对动物健康产生许多负面影响,如脂质氧化和代谢性疾病,最终导致家畜生产性能和繁殖性能降低,严重时甚至造成死亡[1-2]。在现代畜牧养殖中,补充饲料是一种常见的做法,目的是防止断奶前和断奶后幼畜氧化应激及其导致的代谢性疾病的发生[1]。对天然饲料添加剂的应用已经获得了普遍推广,特别是抗生素生长促进剂在欧盟被禁止之后。研究发现,氧化应激造成仔猪血清中免疫球蛋白(Ig)A、IgG和IgM含量显著降低,同时发现脾脏中淋巴细胞数量显著减少,这表明氧化应激可造成机体免疫功能降低[3-4]。因此,增强羔羊机体抗氧化能力是保证羔羊免疫系统成熟的关键环节。

酵母β-葡聚糖已被发现是促进反刍动物生长和改善胃肠道形态的良好选择,它是由β-糖苷键组成的葡萄糖聚合体,不存在于动物体内,发现于真菌细胞壁、细菌和植物中,包括蘑菇、海洋植物和酵母[5]。酵母β-葡聚糖像其他多糖和膳食纤维一样,不但可以作为小肠内微生物发酵的来源,产生益生效应,而且可以增强宿主免疫应答能力。Sandvik等[6]研究表明,给雄性Wistar鼠口服和静脉注射酿酒酵母β-葡聚糖后,可防止脂多糖(LPS)诱导的休克和器官损伤,血浆中促炎细胞因子白细胞介素-6(IL-6)含量显著降低, 说明酵母β-葡聚糖具有抗炎功能,未描述对LPS诱导的氧化应激的影响,但提取于燕麦的β-葡聚糖具有抗炎和抗氧化功能[7]。不同来源的β-葡聚糖因其结构和分子大小不同,导致其具有不同的生理功能[8]

氧化应激主要是由于自由基过量产生或清除过慢,氧化/抗氧化失衡所导致,其中丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、活性氧(ROS)等参与氧化应答[9-11],而一些酶类则参与抗氧化过程,如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽转移酶(GST)[12-13]。在所有的生物中,氧化是产生能量维持生物进程必不可少的过程。但是ROS及氧化应激标志性物质的过量产生会导致一些疾病的发生,如癌症、类风湿性关节炎及心血管疾病等。氧化反应产生自由基,引发破坏细胞的连锁反应。然而,机体防御系统则可以通过上调抗氧化酶基因的表达,消除自由基来抵御氧化应激,从而保护细胞免受毒性氧化产物的侵害。因此,抗氧化剂的应用将有助于缓解氧化损伤。酵母β-葡聚糖作为抗炎类物质,关于其是否具有抗氧化功能的研究较少。LPS表达于革兰氏阴性菌的外膜,通过激活免疫细胞在氧化应激的发生中起关键作用,LPS常用于体外诱导氧化应激反应。本研究以绵羊淋巴细胞为研究对象,深入探讨酵母β-葡聚糖对LPS诱导淋巴细胞氧化应激的影响,为实现酵母β-葡聚糖在饲料添加剂中的应用提供参考。

1 材料与方法 1.1 材料和仪器

酵母β-葡聚糖和LPS购自Sigma公司;淋巴细胞分离液(Ficoll)购自GE医疗公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)购自凯基生物;瑞氏染色液购自海博生物;MDA含量及GSH-Px、CAT活性测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所;Western及IP细胞裂解液、SOD活性和ROS含量测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司;胎牛血清和RPMI-1640培养基购自Gibco公司;Synergy H4酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司;荧光倒置显微镜购自奥林巴斯。

1.2 绵羊外周血淋巴细胞的分离

选取60日龄羔羊,用肝素钠抗凝管在颈静脉采血,将血液与Hanks平衡盐溶液按体积1 : 1混匀进行稀释血液,移取淋巴细胞分离液3 mL于15 mL离心管中,缓慢地加入稀释过的血液4 mL在淋巴细胞分离液上面,800×g离心30 min。取中间白膜层细胞约0.5 mL于新的15 mL离心管中,加入3~5倍Hanks平衡盐溶液,洗涤2次,每次400×g离心10 min,弃上清。然后将细胞悬浮于含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640培养基中,置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养2 h,贴壁细胞为单核细胞,未贴壁细胞重悬于培养液中,即得到淋巴细胞。瑞氏染色观察形态,使淋巴细胞纯度>95%。用台盼蓝染色,细胞存活率>95%,调整细胞浓度为1×106个/mL,备用。

1.3 瑞氏染色

取少量细胞涂抹于载玻片上,干燥,用瑞氏染色液A液固定1 min,再滴加瑞氏染色液B液混匀,染色3 min,蒸馏水冲洗,干燥,光学显微镜观察。

1.4 酵母β-葡聚糖对淋巴细胞的毒性测定

采用MTT法检测酵母β-葡聚糖对淋巴细胞的毒性。取淋巴细胞100 μL,4×104个/孔接种于96孔培养板,加入酵母β-葡聚糖,使其终浓度分别为0(对照)、5、10、20、50、100 μg/mL,作用6 h,每个浓度设3个重复。离心,弃上清,每孔加50 μL 1×MTT溶液,37 ℃孵育4 h,使MTT还原为甲臜,500×g离心4 min,弃上清,然后每孔加150 μL二甲基亚砜(DMSO),使甲臜溶解,用平板摇床混匀,用酶标仪在490 nm波长处检测吸光度(OD)值。

1.5 ROS含量检测

淋巴细胞以每孔1×106个/mL接种于24孔培养板。加入不同浓度[0(对照)、5、10、20 μg/mL]酵母β-培葡聚糖,每个浓度设3个重复,作用6 h,再加入终浓度为2 μg/mL的LPS,作用12 h,离心收集细胞,按照ROS含量检测试剂盒的方法检测细胞内ROS含量。

1.6 细胞活力测定

取淋巴细胞100 μL,4×104个/孔接种于96孔培养板,按1.5所述方法处理细胞,离心,弃上清,按照MTT检测试剂盒的方法检测细胞活力。

1.7 细胞中SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量的检测

将淋巴细胞以密度1×106个/mL接种于12孔板,2 mL/孔,按1.5所述方法处理细胞,离心,收集细胞。在细胞中加入200 μL细胞裂解液,冰上作用1 h,14 000×g,4 ℃离心,收集上清,按照相应试剂盒的方法检测细胞内SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量。

1.8 数据处理

使用SPSS 17.0统计软件的单因素方差(one-way ANOVA)和LSD多重比较分析数据,试验数据用平均值±标准误(mean±SE)表示,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析 2.1 淋巴细胞鉴定

图 1所示,显微镜结果表明淋巴细胞分离纯度>95%,胞核圆形,被染成紫蓝色,胞浆极少,呈透明的淡蓝色。

图 1 绵羊外周血淋巴细胞 Fig. 1 Peripheral blood lymphocyte of sheep (100 0×)
2.2 酵母β-葡聚糖对淋巴细胞的毒性测定

图 2所示,不同浓度的酵母β-葡聚糖处理淋巴细胞6 h后,酵母β-葡聚糖浓度在0~20 μg/mL时无细胞毒性,在50和100 μg/mL时,细胞存活率显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01)。结果表明,酵母β-葡聚糖作用淋巴细胞的最佳浓度为5、10和20 μg/mL。

与对照组相比,*为P<0.05,* *为P<0.01。 Compared with the control group, * was P < 0.05, * * was P < 0.01. 图 2 酵母β-葡聚糖对淋巴细胞存活率的影响 Fig. 2 Effects of yeast β-glucan on viability of lymphocyte
2.3 酵母β-葡聚糖对淋巴细胞活力的影响

图 3所示,与对照组相比,LPS刺激淋巴细胞后,细胞活力极显著降低(P<0.01),可能由氧化应激导致;而经过终浓度为10 μg/mL酵母β-葡聚糖预处理后,能显著升高LPS抑制的淋巴细胞活力(P<0.05),具有浓度依赖性。结果表明,酵母β-葡聚糖能够增强LPS诱导的淋巴细胞活力,可能具有抗氧化作用。

与对照组相比,*为P<0.05,* *为P<0.01;与LPS组相比,#为P<0.05,##为P<0.01。下图同。 Compared with the control group, * was P < 0.05, * * was P < 0.01; compared with LPS group, # was P < 0.05, ## was P < 0.01. The same as below. 图 3 酵母β-葡聚糖对LPS诱导淋巴细胞活力的影响 Fig. 3 Effects of yeast β-glucan on viability of LPS-induced lymphocyte
2.4 酵母β-葡聚糖抑制LPS诱导的淋巴细胞内ROS的产生

通过荧光显微镜观察到LPS刺激淋巴细胞后,细胞内绿色荧光明显增加,添加酵母β-葡聚糖后,细胞内荧光强度逐渐减弱(图 4-ABC),另外,荧光酶标仪结果表明,LPS极显著增强淋巴细胞内ROS含量(P < 0.01),经过终浓度为10 μg/mL酵母β-葡聚糖预处理后,酵母β-葡聚糖显著抑制LPS诱导的细胞内ROS产生(P < 0.05),且具有浓度依赖性(图 4-D)。

图 4 酵母β-葡聚糖对淋巴细胞内ROS含量的影响 Fig. 4 Effects of yeast β-glucan on ROS content in lymphocytes
2.5 酵母β-葡聚糖抑制LPS诱导的淋巴细胞氧化损伤

图 5所示,与对照组比较,LPS刺激淋巴细胞后,淋巴细胞内SOD和CAT活性显著下降(P<0.05),GSH-Px活性极显著下降(P<0.01),而细胞内MDA含量极显著增加(P<0.01);与LPS组相比较,10 μg/mL酵母β-葡聚糖+LPS组中,淋巴细胞内SOD和CAT活性极显著增强(P<0.01),GSH-Px活性显著增强(P<0.05),MDA含量显著减少(P<0.05)。这些数据表明酵母β-葡聚糖可逆转LPS诱导的淋巴细胞氧化损伤,可能增强细胞免疫机能。

图 5 酵母β-葡聚糖对LPS诱导淋巴细胞氧化应激的影响 Fig. 5 Effects of yeast β-glucan on LPS-induced oxidative stress in lymphocytes
3 讨论

新生幼畜免疫系统的不成熟是其发病率高的重要原因[14]。在出生后的第1个14 d内,幼畜最易患肠炎、腹泻、败血症和肺炎[15-16]。此外,健康的幼畜甚至在90 d时也无法达到完成先天免疫反应成熟所需的稳定性[17]。维持幼畜的健康是免疫系统的重要功能,淋巴细胞在这一过程中起着基础性作用,免疫系统的成熟需要大量能量,健康羔羊突发氧化应激,加剧机体能量不足,可能造成淋巴细胞的氧化损伤。

幼畜断奶后产生生理性应激,造成机体的氧化应激及胃肠功能的紊乱,在此过程中,特异性免疫细胞——淋巴细胞的免疫机能(分泌炎性因子、抗体、补体等)受到显著抑制,淋巴细胞氧化损伤是导致机体免疫机能抑制的一个重要诱因。免疫营养是近年来营养与免疫学研究相结合的一个新的科学研究方向,营养性抗氧化剂的使用已成为调控羔羊免疫机能的重要措施[18]。断奶后犊牛分群处理,淋巴细胞至少要在70 d后恢复正常,这说明断奶对幼畜免疫机能产生重要影响[19]。Bacha等[20]研究者发现酵母β-葡聚糖具有抗炎、抗氧化和免疫调节功能,可作为营养性食物提高机体免疫功能,改善机体代谢。本研究中,LPS诱导的氧化应激模型中,酵母β-葡聚糖显著逆转LPS抑制的淋巴细胞活性,因此推测酵母β-葡聚糖可能具有增强细胞抗氧化能力的作用。

适当的ROS参与多种细胞内的生理调控过程,包括激活和调节信号转导通路、防御感染因子、诱导有丝分裂反应和调节线粒体凋亡过程[21-22]。相反,过量的ROS对细胞有毒害作用,会对脂类、蛋白质和核酸等大分子造成损害[23-24]。MDA是脂质过氧化的标志物,可诱导细胞核和组织氧化损伤,而细胞免疫机能降低显著增加氧化应激,长期氧化应激可导致细胞凋亡[25-26]。正常细胞内的抗氧化酶具有清除超氧阴离子自由基的能力,如SOD、GSH-Px和CAT,有助于维持细胞内还原型谷胱甘肽和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的含量,以达到最佳抗氧化防御功能[27]。临床试验表明,细胞脂质过氧化和GSH耗竭显著增加,会造成体内的酮体含量增加,是增加代谢性疾病的主要危险因素[28-29]。有体内试验证明,β-葡聚糖可通过增强抗氧化酶SOD和GSH-Px活性,降低MDA释放,来抑制嗜水气单胞菌诱导的大鳞副泥鳅机体氧化损伤,表明β-葡聚糖具有抗氧化功能[30]。Wang等[31]研究者使用大肠杆菌(Escherichia coli)O141 : K99诱导断奶犊牛氧化应激,β-葡聚糖能提高28日龄断奶犊牛的抗氧化功能,降低Escherichia coli O141 : K99感染后氧化应激的发生率。因此,本研究中以绵羊淋巴细胞为研究对象,选取LPS作为免疫细胞的氧化损伤诱导剂,荧光酶标仪定量结果表明酵母β-葡聚糖抑制淋巴细胞内ROS产生;生化检测指标表明,在LPS诱导的淋巴细胞氧化损伤模型中,酵母β-葡聚糖抑制MDA释放,显著提高了SOD、GSH-Px和CAT活性,这些数据充分证明酵母β-葡聚糖具有抗氧化能力,可降低淋巴细胞氧化损伤。

4 结论

本研究证明,酵母β-葡聚糖能逆转LPS诱导的淋巴细胞氧化应激损伤,具有抗氧化功能,为酵母β-葡聚糖可增强细胞免疫功能提供新的论据,也为酵母β-葡聚糖对淋巴细胞免疫调控作用的深入研究及临床应用提供理论基础。

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