2. 西北师范大学新农村发展研究院, 兰州 730070;
3. 西北民族大学生命科学与工程学院, 兰州 730030
2. Institute of Rural Development of Northwest Normal University, Lanzhou 730070, China;
3. Life Science and Engineering College of Northwest Minzu University, Lanzhou 730030, China
随着畜牧业的迅速发展,饲料原料的供给很难跟上畜牧业发展的步伐[1-2]。虽然我国水稻、小麦和玉米等粮食作物的产量较为丰富,但作为副产品的作物秸秆由于其粗纤维含量高、适口性差,在动物生产中的应用受到较大的限制,要想提高其营养价值必须经过合理的加工[3-5]。近年来,饲用酶制剂已成功引起人们的关注,成为研究热点之一,它在提高动物生产性能、改善粗纤维利用率、减少环境污染等方面发挥着至关重要的作用[6-8]。将外源淀粉酶添加到幼畜饲粮中,不但能补充内源酶的不足,而且能刺激内源酶的分泌,通过将淀粉分解成麦芽糖、糊精和葡萄糖等,将蛋白质分解成氨基酸、寡肽和多肽等,有利于幼畜对淀粉和蛋白质的消化和吸收[9]。研究发现,添加不同组合的外源消化酶于羔羊饲粮中,可以提高羔羊的日采食量、日增重以及饲料转化率[10];并且,添加外源酶不仅能够刺激动物体内内源酶的分泌,还可以改善幼龄动物胃肠道、肝脏及胰腺的发育[11]。本试验拟通过体外发酵法研究外源纤维素酶对发酵指标的综合影响效果,探讨外源纤维素酶对断奶羔羊的营养调控作用,为外源酶制剂在断奶羔羊生产中的应用提供理论指导。
1 材料与方法 1.1 供体动物及饲养管理在甘肃省定西市安定区定西旺盛养殖有限公司选择4只60日龄断奶杂交公羔(萨福克×小尾寒羊)作为瘤胃液供体羊。根据日增重300 g肉羊的营养需要量配制基础饲粮,精粗比为36.45 : 63.55,其组成及营养水平见表 1。饲养期间自由饮水,每天06:30和17:30各饲喂1次。
试验所用纤维素酶为分析纯,固体粉末状,其活性实测值为50 000 U/g。
1.3 试验设计采用单因素完全随机试验设计,设定4个纤维素酶添加量,分别为0(CON组,作为对照)、280 000(T1组)、300 000(T2组)、320 000 U/kg精料(T3组),每个添加量设置24个发酵瓶。在体外批次培养条件下,测定不同发酵时间的干物质降解率(DMD),发酵液pH与氨氮(NH3-N)、微生物蛋白(MCP)、挥发性脂肪酸(VFA)(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸等短链脂肪酸)浓度以及蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶活性。
1.4 体外发酵及样品采集于晨饲后2 h通过口腔采集瘤胃内容物,混合后装于提前充满CO2的保温瓶中迅速带回实验室,用4层纱布过滤(同时通入CO2),整个操作于39 ℃水浴中进行。体外产气装置采用ANKOM RFS(美国ANKOM Technology Corporation)体外发酵系统。按照试验设计,在精料中加入对应质量的纤维素酶,混合均匀,按照供体动物基础饲粮配方配制成饲粮。将烘干后的饲粮通过高速粉碎机(XFB-200)粉碎至约1 mm,准确称取约500 mg饲粮样品作为发酵底物投入250 mL厌氧发酵瓶中,然后迅速在每个发酵瓶中加入100 mL预热的人工瘤胃缓冲液(按Menke等[12]方法配制)和50 mL过滤后的瘤胃液,并向瓶中持续通入CO2 30 s后,立即加上瓶塞,于39 ℃下连续培养72 h。发酵前(作为发酵0 h)先测定发酵液中发酵参数及消化酶活性,然后分别在不同发酵时间(1、2、4、8、12、24、48和72 h)随机选取3个发酵瓶在冰水中终止发酵,收集15 mL发酵液测定发酵参数及消化酶活性,将剩余发酵液离心收集发酵残渣,测定DMD。
1.5 测定指标及测定方法将饲粮和发酵残渣在105 ℃烘箱中烘5 h至恒重后测定干物质含量,然后根据Tilley等[13]的方法计算DMD。
发酵液pH用pH 211型精密pH计(HAN-NA)测定;NH3-N浓度使用苯酚-次氯酸钠比色法[14]测定;MCP浓度采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)配合WD-2102B型全自动酶标仪(北京六一生物科技有限公司)测定,测定方法按照试剂盒说明书进行;VFA浓度采用气相色谱仪(岛津GC-2010 Plus, 日本)测定[15]。
将发酵液与匀浆介质(0.86%的生理盐水)按体积比1 : 9混合,制成10%的样品稀释液,然后将稀释液用低温低速离心机离心10 min(2 500 r/min),取上清液,采用试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)配合WD-2102B型全自动酶标仪(北京六一生物科技有限公司)测定蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶活性,测定方法按照试剂盒说明书进行。
1.6 数据统计与分析利用Excel 2007软件进行数据整理,数据采用SPSS 19.0软件的一般线性模型进行方差分析,并采用Duncan氏法进行多重比较。以P < 0.05作为差异显著的判断标准。
2 结果 2.1 外源纤维素酶对断奶羔羊瘤胃体外发酵参数的影响外源纤维素酶对断奶羔羊瘤胃体外发酵参数的影响如表 2所示。与CON组相比,T1、T2、T3组DMD分别显著升高12.01%、13.35%、9.24%(P < 0.05),处理和发酵时间对DMD均有显著影响(P < 0.05),但二者的互作效应不显著(P>0.05)。图 1可以看出,随着发酵时间的延长,各组DMD均呈现逐渐升高趋势,且CON组DMD均处于较低水平,除发酵12 h时与3个试验组差距较小外,其余发酵时间均明显低于3个试验组。T2组NH3-N浓度分别比CON、T1、T3组低0.70、0.51、0.28 mg/dL,CON组MCP浓度分别比T1、T2、T3组低1.31、1.41、1.32 mg/dL(P < 0.05),差异均达到显著水平(P < 0.05),处理和发酵时间对NH3-N、MCP浓度均有显著影响(P < 0.05),但二者的互作效应不显著(P>0.05)。由图 2和图 3可以看出,随着发酵时间的延长,NH3-N和MCP浓度变化趋势相反,NH3-N浓度在发酵2、8 h时出现峰值,而MCP浓度在发酵2、8 h时出现谷值。T1组总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度显著高于CON组和T3组(P < 0.05),但处理和发酵时间的互作效应不显著(P>0.05)。由图 4可以看出,随着发酵时间的延长,TVFA浓度整体呈现先升高后降低的趋势,发酵24 h时上升到最大,之后逐渐降低。不同处理和发酵时间对各VFA浓度及乙丙比(A/P)均无显著影响(P>0.05),且发酵时间和处理的互作效应不显著(P>0.05)。
外源纤维素酶对断奶羔羊瘤胃体外发酵消化酶活性的影响如表 3所示。T2组淀粉酶、纤维素酶活性分别比CON组高12.40、10.59 μg/(min·mL)(P < 0.05),发酵时间和处理对淀粉酶活性有显著互作效应(P < 0.05)。由图 5、图 6、图 7可以看出,随着发酵时间的延长,各组淀粉酶活性呈现波动变化趋势,在发酵4、12 h时出现峰值,在发酵2、8、24 h出现谷值;蛋白酶活性在发酵前4 h呈逐渐降低趋势,之后呈现波动变化趋势;T3组纤维素酶活性在发酵4 h时低于其他组,T2组在发酵8 h时高于其他组,T1组在发酵24 h时低于其他组。
体外DMD不仅能够反映饲料在发酵体系中被微生物的降解程度,还能反映其被动物消化利用的难易程度[16]。测定体外培养液中DMD已经被广泛应用于评价饲料的营养价值,这是由于体外法与体内法存在高度的相关性[17]。DMD越高,说明瘤胃内的环境越适合微生物发酵,越有利于提高饲料中营养物质的利用率[18]。有研究表明,添加不同来源的纤维素酶能够有效提高粗饲料在瘤胃体外发酵的DMD,而且粗饲料体外发酵程度还受酶的来源的影响[19-20]。本试验中,T2组的DMD显著高于CON组,在整个体外发酵过程中,CON组DMD均处在较低水平。在动物试验中发现,外源酶添加量与动物反应有一定的关系[21]。外源酶制剂对反刍动物没有产生作用或产生副作用,往往是由酶的添加量不够[22]或过高[20]造成的。张苏江等[23]研究发现,在体外发酵培养中,酶添加量过高时DMD反而下降。纤维素酶是多组分的混合蛋白质,在适当的条件下,能使不溶性纤维素水解成可溶性糖。饲粮中添加外源纤维素酶可以促进酶与底物紧密结合,外源酶可以从底物中释放出可溶性碳水化合物,有时是部分溶解的中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)。Morgavi等[24]研究发现,外源纤维素酶可以有效改变纤维素结构,从而使饲料更容易降解。本研究中,添加中等剂量(300 000 U/kg精料)的纤维素酶时饲粮DMD最高,即此时干物质降解效果最佳,这充分表明添加外源纤维素酶有利于饲料的降解。
3.2 外源纤维素酶对断奶羔羊体外瘤胃发酵参数的影响瘤胃pH对于反刍动物而言至关重要,其变动范围为5.4~7.5[25],本试验中各组pH均在此范围内。瘤胃pH的变化受多种因素影响,一般情况下,pH在采食后降低,随着反刍的开始和大量唾液的混入而逐渐升高[26];同时,pH也受饲料特性的影响[27]。本试验中,各组的发酵液pH变化趋势相似,故此认为添加外源纤维素酶对体外瘤胃发酵pH几乎没有影响。这主要是由于体外发酵液中存在大量缓冲物质[28],因此对pH影响较小。
反刍动物瘤胃中NH3-N是瘤胃微生物降解饲粮中蛋白质、氨基酸等含氮成分产生的,是合成MCP的重要原料,是反映反刍动物氮代谢的主要指标,综合反映了瘤胃内氮代谢的过程[29]。NH3-N浓度的变化主要受2个因素的影响:一是饲粮中蛋白质的含量和种类,主要是可消化蛋白质的比例;二是瘤胃微生物合成MCP时的速度。瘤胃中分泌蛋白酶的菌主要有厌氧真菌和细菌,可利用蛋白质合成NH3-N。NH3-N浓度过高表明造成了氨损失,即氨的释放速率高于利用速率,浓度过低则会影响MCP的合成。Owens等[30]提出NH3-N浓度在0.35~29.00 mg/dL时可以满足MCP的合成。Clark等[31]研究发现瘤胃液中NH3-N浓度在1~2 mg/dL就能够满足反刍动物瘤胃微生物合成MCP的需要及细菌对纤维降解的需要。本试验中,添加中等剂量(300 000 U/kg精料)的外源纤维素酶可以显著提高MCP浓度,显著降低NH3-N浓度,并且随着发酵时间的推移,NH3-N、MCP浓度的变化趋势相反。MCP是反刍动物重要的蛋白质来源,其浓度是衡量瘤胃发酵最重要的指标,而且碳水化合物的种类、数量、结构与MCP的浓度密切相关。本试验中,在发酵8 h时,NH3-N浓度升高,这可能是由于饲粮降解速率较快,而MCP的合成速率较低,导致NH3-N浓度积累升高,而在发酵12 h时,NH3-N浓度降低,此时可能是由于微生物处于最为活跃的阶段,微生物的种类和数量都达到了最高水平,提高了MCP的合成速度[32]。因此,外源纤维素酶可以促进瘤胃微生物的增殖,饲粮经过大量微生物的降解产生了更多的NH3-N,使得NH3-N浓度在短期内积累升高,随着NH3-N浓度不断升高,微生物活性也将不断增强,将产生的氨作为氮源进一步合成了更多的MCP[33],有效地提高了NH3-N的利用率。
碳水化合物被瘤胃微生物降解为VFA、二氧化碳和甲烷,其中75%的VFA通过瘤胃壁扩散进入血液。碳原子含量影响着VFA的吸收速度,其中丁酸吸收速度最快,其次是丙酸,乙酸最慢[34]。另外,反刍动物瘤胃液中的VFA是微生物降解碳水化合物的产物,是反刍动物机体能量和碳的主要来源,瘤胃液中的VFA为反刍动物提供60%~80%的能量[35]。本试验中,外源纤维素酶对乙酸、丙酸、丁酸等VFA的浓度无显著影响。纤维素在瘤胃微生物产生的纤维素酶的作用下生成丙酮酸,而丙酮酸经过各种代谢途径进行发酵产生乙酸、丙酸、丁酸等。瘤胃中乙酸的产生主要是由丙酮酸氧化脱羧产生的乙酰辅酶A与磷酸作用,生成乙酰磷酸,再在乙酸激酶催化下产生乙酸。瘤胃VFA产量与饲粮的类型密切相关[35]。有研究表明饲粮精粗比为3 : 7时,添加纤维复合酶对VFA浓度、pH等瘤胃代谢指标的影响不显著[37]。王安等[38]研究显示添加纤维复合酶对瘤胃液各VFA浓度无显著影响,这与本研究结果一致。当添加外源纤维素酶时,一方面,外源纤维素酶可以打断纤维素中的化学键,从而使得饲料表面变得脆弱,去除了阻止微生物吸附的一些物理障碍;另一方面,外源纤维素酶可以直接作用于饲料中的纤维素,促进纤维素水解释放出还原糖,这些水解产物聚集在饲料颗粒的表面,会促进类似的水解反应,从而使得瘤胃微生物对饲料颗粒的附着能力增强[39],因而对瘤胃发酵有改善作用。但是VFA的形成还需要一系列代谢途径,外源纤维素酶并不能直接影响VFA的浓度,对VFA浓度的影响机制还有待于进一步研究。
3.3 外源纤维素酶对断奶羔羊体外瘤胃发酵液消化酶活性的影响幼龄动物由于消化机能发育不完善,机体所分泌的内源性消化酶活性低,不足以维持正常生理需要,因此需额外补充外源性消化酶[40]。有研究表明,添加多糖酶于生长母牛瘤胃中对提高瘤胃内木聚糖酶与内切葡聚酶活性[41]以及绵羊瘤胃液中内切葡聚酶与木聚糖酶活性[42]有一定的效果。奚刚等[43]研究显示,添加的外源酶制剂与畜禽体内的内源性消化酶的关系较为复杂,受到动物品种和饲粮类型等多种因素的影响,其中饲粮类型对其影响较大。本研究表明,添加中等剂量(300 000 U/kg精料)的外源纤维素酶可以提高体外瘤胃发酵液中纤维素酶和α-淀粉酶的活性,但对蛋白酶活性无显著影响,且处理和发酵时间对α-淀粉酶的活性具有显著的互作效应。瘤胃对饲料的降解作用都是通过瘤胃微生物分泌的一系列酶协同作用完成的。Feng等[44]和Russell等[45]用体内法和体外法进行研究的结果表明,添加外源酶可以使纤维物质的降解率有所提高。宋桂经[46]研究表明,外源酶的添加不仅对内源酶的活性无抑制作用或负效应,反而能促进动物对养分的消化吸收。蒋正宇等[47]研究认为,在肉鸡饲粮中添加低剂量(250~750 mg/kg)的纤维素酶可有效提高肉鸡体内内源性消化酶活性,而在高剂量(2 250 mg/kg)添加组中,某些内源性蛋白酶(如总蛋白酶和淀粉酶)的活性呈下降趋势,同时蔗糖酶和麦芽糖酶的活性也降低了。大部分研究结果显示添加外源性消化酶对刺激或促进动物体内内源酶的分泌有一定的作用[48-49],但也有些研究结果显示添加低剂量的外源酶比添加高剂量的外源酶对动物消化道内源酶的分泌更有效[44]。这种作用可能是由于动物消化道内的内源酶和添加的外源酶之间存在协同效应[24]。外源纤维素酶可以促进饲粮中纤维物质的降解,从而刺激瘤胃纤维降解菌,促使瘤胃纤维降解菌分泌更多的纤维素酶,其与瘤胃微生物产生协同作用降解饲粮。通常认为,淀粉的降解会导致pH下降,pH下降到6.2以下时不利于瘤胃内纤维分解菌的生长[50],从而会使纤维酶活性降低。而本研究结果表明,外源纤维素酶的添加不仅有利于纤维素酶活性的提高,而且对淀粉酶活性也有增强作用,这也表明外源纤维素酶活性受瘤胃pH的影响较小,在添加适量外源纤维素酶的情况下,有利于瘤胃发酵,增强饲粮中营养物质的消化利用,同时淀粉酶活性相应增强;但是外源纤维素酶的添加对蛋白酶活性无显著影响,这可能是由于外源纤维素酶对纤维降解菌和淀粉降解菌都有直接或间接的调控作用,但是对蛋白降解菌无显著调控作用。瘤胃中消化酶活性主要依赖于瘤胃微生物的种类和数量,因此,外源纤维素酶对瘤胃中消化酶活性的影响机制还需要通过瘤胃微生物区系的变化来深入研究。
4 结论① 添加外源纤维素酶可以提高断奶羔羊饲粮的体外DMD,促进体外瘤胃发酵,增强MCP的合成,提高NH3-N的利用率。
② 添加外源纤维素酶可以增强断奶羔羊体外瘤胃发酵液中纤维素酶、α-淀粉酶活性,但对蛋白酶活性无显著影响。
③ 综合认为,体外条件下外源纤维素酶的最佳添加量为300 000 U/kg精料。
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