2. 湖南师范大学生命科学学院, 动物肠道功能调控湖南省重点实验室, 长沙 410081
2. Hunan Provincial Key Laboratory of Animal Intestinal Function and Regulation, College of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha 410081, China
低蛋白质饲粮饲喂技术可以降低养殖成本,提高氮的利用率,减少污染物的排放和保护环境,因此成为畜牧养殖领域研究的重点[1]。然而,饲粮中蛋白质含量的减少往往会给动物带来一定的负面影响,如生长性能降低、氧化应激增强等[2]。因此,如何在发挥低蛋白质饲粮饲喂技术优点的同时,减少其的负面影响,成为低蛋白质饲粮在生长实践应用中亟待解决的问题。
研究证实,作为非必需氨基酸,丝氨酸和甘氨酸是谷胱甘肽合成的重要前体物质,在机体抗氧化过程中发挥重要作用[3-4]。此外,研究还证实丝氨酸和甘氨酸还是代谢网络调节的关键枢纽,可以将碳循环和糖酵解联系起来,以支持机体氧化还原平衡和细胞增殖等[5-6]。丝氨酸和甘氨酸可以直接互相转化,但丝氨酸向甘氨酸转化产生1个甲基,而甘氨酸向丝氨酸转化消耗1个甲基。因此,本试验通过在饲粮中添加丝氨酸和甘氨酸,使低蛋白质饲粮中丝氨酸和甘氨酸达到一定的比例,探究其对育肥猪背最长肌氧化应激的影响,并试图揭示其可能存在的调节机制,为我们进一步优化低蛋白质饲粮在养猪生产实践中的应用提供一定的科学参考和理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料与试验设计本试验方案经中国科学院亚热带农业生态研究所动物实验方案管理与评审委员会批准,按照动物保健和福利委员会的指导对所有猪进行照料和屠宰。试验选择96头体重相似(约59.50 kg)的杂交(杜洛克×大白×长白)健康公猪,随机分为4组,每组分为6栏(重复),每栏4只猪。猪只在生长育肥期间自由采食和饮水,试验期43 d。参考NRC(2012)猪营养标准,设计正常蛋白质饲粮用于满足生长育肥猪对营养的需求。4个组的丝氨酸与甘氨酸比例如下:1.18 : 1.00(正常蛋白质对照组,NPC组,16%粗蛋白质)、1.20 : 1.00(低蛋白质对照组,LPC组,12%粗蛋白质,低蛋白质饲粮主要是通过降低饲粮中豆粕含量而实现)、2.00 : 1.00(S2G1组,12%粗蛋白质,通过降低豆粕含量并添加0.49%丝氨酸和0.08%甘氨酸而实现)、1.00 : 2.00(S1G2组,12%粗蛋白质,通过降低豆粕含量并添加0.57%甘氨酸而实现)。丝氨酸和甘氨酸(纯度≥99.0%)购自张家港市思普生化有限公司。饲粮组成及营养水平见表 1,饲粮中必需氨基酸的含量见表 2。
试验结束后,分别从每组每个重复挑选1头猪,共计24头,电击晕后进行宰杀,收集血液和左半部分最后1根肋骨处的背最长肌样本,用于后续的基因和其他指标分析。
1.3 测定指标与方法 1.3.1 肌红蛋白含量参考Honikel[7]的方法,取5 g肌肉,添加25 mL浓度为0.04 mol/L且pH=6.8的磷酸钠缓冲液,并在(22±2) ℃使用匀浆机匀浆;将匀浆后的溶液在4 ℃的冰箱中放置1 h,然后在4 500×g、2~4 ℃下离心20 min。用滤纸过滤收集的上清液,使用分光光度计在525、545、565和572 nm处测量滤液的吸光度。计算公式如下:
式中:R1、R2、R3分别是572 nm处吸光度/525 nm处吸光度(A572/A525)、565 nm处吸光度/525 nm处吸光度(A565/A525)、545 nm处吸光度/525 nm处吸光度(A545/A525)。
1.3.2 血清抗氧化和生化指标所采集的血液样品用于测定血清抗氧化和生化指标,将血液在3 000×g、2~4 ℃下离心10 min,吸取上层血清,按照试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)说明书,测定血清丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。采用全自动系列化分析仪(瑞士)检测血清乳酸脱氢酶(LDH)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)的活性以及葡萄糖(Glu)、甘油三酯(TG)、尿素氮(UN)和总蛋白(TP)的含量,详细步骤参照试剂盒说明书。
1.4 实时荧光定量PCR分析从背最长肌样品中提取RNA,使用反转录试剂盒(TaKaRa,北京)进行转录,得到cDNA,采用实时荧光定量PCR分析以获得相关抗氧化物酶以及炎性因子mRNA相对表达量,扩增引物序列见表 3。
称取2.5 g背最长肌样品,用5 mL 0.01 mol/L盐酸匀浆,超声提取30 min。将上清液转移至25 mL容量瓶中,重复超声提取2次,合并上清液,并稀释至25 mL;摇匀后,将2 mL滤液移入离心管中,并加入2 mL正己烷进行脱脂(摇匀,分层,弃去上层,取下层);下层滤液取1 mL,加入1 mL的8%磺基水杨酸,充分混匀。静置过夜后,将混合物以8 000×g离心10 min并收集上清液;上清液经0.22 μm滤膜过滤后,用氨基酸分析仪(L8900,日本)测定游离氨基酸的含量。
1.6 数据分析采用SPSS 22.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA),用Duncan氏法和LSD法进行多重比较,以P<0.05作为显著性判断标准,结果以“平均值±标准差”表示。
2 结果 2.1 饲粮丝氨酸和甘氨酸比例对育肥猪背最长肌中肌红蛋白含量的影响饲粮丝氨酸和甘氨酸比例对育肥猪背最长肌中肌红蛋白含量的影响如图 1所示。与NPC组相比,LPC组育肥猪最长肌中OxyMb含量降低(P>0.05),而最长肌中MetMb含量显著提高(P < 0.05)。与LPC组相比,S2G1组育肥猪最长肌中OxyMb含量显著提高(P < 0.05),而最长肌中MetMb含量则显著降低(P < 0.05);而S1G2组育肥猪最长肌中OxyMb含量显著提高(P < 0.05),最长肌中MetMb含量也降低,但差异不显著(P>0.05)。
如图 2所示,各组育肥猪血清中MDA含量无显著差异(P>0.05);与NPC组相比,LPC组育肥猪血清中SOD的活性显著降低(P < 0.05),而S2G1组和S1G2组育肥猪血清中SOD活性无显著差异(P>0.05)。
由表 4可知,各组育肥猪血清中LDH、AST和ALP的活性以及血清中Glu、TG和TP的含量无显著差异(P>0.05);NPC组育肥猪血清中ALT活性显著高于其他组(P < 0.05);与NPC组相比,LPC组、S2G1组和S1G2组育肥猪血清中UN含量显著降低(P < 0.05)。
如图 3所示,S1G2组育肥猪背最长肌中谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的mRNA相对表达量显著高于NPC组和LPC组(P < 0.05);此外,S1G2组育肥猪背最长肌中谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸醌氧化还原酶1(NQO1)的mRNA相对表达量显著高于NPC组(P < 0.05),但与其他2个低蛋白质饲粮组无显著差异(P>0.05)。
如图 4所示,LPC组育肥猪背最长肌中白细胞介素-8(IL-8)的mRNA相对表达量显著高于其他组(P < 0.05);与LPC组相比,S1G2组育肥猪背最长肌中白细胞介素-6(IL-6)的mRNA相对表达量显著降低(P < 0.05);各组育肥猪背最长肌中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05)。
由表 5可知,各组育肥猪背最长肌中丝氨酸含量无显著差异(P>0.05);与NPC组和LPC组相比,S1G2组育肥猪背最长肌中甘氨酸和半胱氨酸含量显著增加(P < 0.05);NPC组和LPC组育肥猪背最长肌中天冬氨酸含量显著低于S2G1和S1G2组(P < 0.05);NPC组和S2G1组育肥猪背最长肌中鸟氨酸含量显著高于LPC组(P < 0.05);NPC组、LPC组和S2G1组育肥猪背最长肌中亮氨酸含量显著高于S1G2组(P < 0.05);NPC组、S2G1组和S1G2组育肥猪背最长肌中脯氨酸含量显著高于LPC组(P < 0.05)。
丝氨酸和甘氨酸在一碳代谢、嘌呤合成、糖酵解和谷胱甘肽合成等代谢过程中发挥重要作用。丝氨酸和甘氨酸可以显著提高机体抗氧化能力。本试验研究表明,相比于正常蛋白质饲粮(16%粗蛋白质),降低4百分点的低蛋白质饲粮会在一定程度上引起育肥猪的氧化应激(肌肉中氧合肌红蛋白含量降低,高铁肌红蛋白含量升高)。然而,我们发现通过添加一定量的丝氨酸和甘氨酸,改变低蛋白质饲粮中丝氨酸和甘氨酸比例,可以改善育肥猪背最长肌氧化应激状态。育肥猪宰后肌肉中铁离子的氧化价态发生了显著的变化。之前报道称动物屠宰后,机体氧化还原状态被打破,氧化造成肌肉中含Fe2+的肌红蛋白被氧化为Fe3+(图 5)[8]。本试验结果发现,与NPC组相比,LPC组育肥猪背最长肌中OxyMb(Fe2+)含量降低,而MetMb(Fe3+)含量升高;而当低蛋白质饲粮中丝氨酸和甘氨酸的比例为2 : 1或1 : 2时,育肥猪背最长肌OxyMb含量升高,MetMb的含量降低。铁离子价态转化的这一变化说明该丝氨酸和甘氨酸比例下的低蛋白质饲粮可能使机体宰后肌肉的氧化程度得到一定的缓解。
研究发现,丝氨酸在多个动物模型中可以发挥缓解氧化应激的作用,例如敌草快诱导的肝脏氧化应激[9]、高脂诱导的肝脏氧化应激[4]以及脂多糖诱导的肠道氧化应激[10]等。而甘氨酸可直接转化为丝氨酸,因此也具有抗氧化作用。在本试验中,我们发现饲喂低蛋白质饲粮在一定程度上造成育肥猪血清中MDA的含量升高,而血清中SOD的活性显著降低,这揭示机体氧化应激水平加剧,这与肌肉中OxyMb和MetMb含量变化趋势相一致。而当饲喂通过额外添加丝氨酸和甘氨酸使其比例为2 : 1或1 : 2的低蛋白质饲粮时,育肥猪血清中MDA的含量有降低的趋势,而血清中SOD的活性则显著升高。这一结果进一步说明低蛋白质饲粮中丝氨酸和甘氨酸比例可影响机体的氧化应激程度。机体可以通过调节许多抗氧化信号通路下游的抗氧化物酶基因(GPX1、GPX4和SOD)、NQO1以及谷氨酰半胱氨酸连接酶(还原性谷胱甘肽合成的限速酶)亚基的基因(GCLC和GCLM)表达来提高机体的抗氧化性能[11-12],减缓机体的氧化应激。本试验结果发现,当饲喂丝氨酸和甘氨酸比例为1 : 2的低蛋白质饲粮时,育肥猪背最长肌中GPX1和GPX4的mRNA相对表达量显著高于NPC组和LPC组。这一结果说明低蛋白质饲粮中丝氨酸和甘氨酸比例可影响肌肉中抗氧化信号通路下游的某些抗氧化物酶基因的表达。当机体出现氧化应激的时候,往往会伴随着炎症反应[13],而丝氨酸和甘氨酸都具有抗炎作用[10, 14]。本试验结果表明,相比于NPC组,LPC组育肥猪背最长肌中炎性因子(IL-6和IL-8)的mRNA相对表达量提高,而饲喂丝氨酸和甘氨酸比例为1 : 2的低蛋白质饲粮使得育肥猪最长肌中IL-6和IL-8的mRNA相对表达量显著降低。这一结果提示该丝氨酸和甘氨酸比例下的低蛋白质饲粮在缓解氧化应激的同时还可能抑制炎症反应。
前期研究结果发现,饲粮中添加丝氨酸可以显著提高血液和肝脏中丝氨酸、甘氨酸和半胱氨酸含量[9]。因此,本试验进一步分析了育肥猪背最长肌中游离氨基酸的含量。结果发现,与对照组相比,额外添加丝氨酸或甘氨酸的低蛋白质饲粮饲喂的育肥猪其背最长肌中丝氨酸含量虽无显著变化,但是甘氨酸和半胱氨酸含量都有不同程度的提高。甘氨酸和半胱氨酸不仅自身具有抗氧化作用[15],还可以作为机体重要抗氧化物质谷胱甘肽的合成底物。因此,本试验的结果提示额外添加丝氨酸或甘氨酸的低蛋白质饲粮可能提高肌肉抗氧化能力。
4 结论综上所述,通过添加丝氨酸和甘氨酸而改变低蛋白质饲粮中丝氨酸和甘氨酸的比例,可在一定程度内缓解由于饲喂低蛋白质饲粮而引起的育肥猪背最长肌的氧化应激。当饲喂丝氨酸和甘氨酸比例为1:2的低蛋白质饲粮时,育肥猪背最长肌中氧化应激和炎症反应得到显著缓解。
[1] |
GLOAGUEN M, LE FLOC'H N, CORRENT E, et al. The use of free amino acids allows formulating very low crude protein diets for piglets[J]. Journal of Animal Science, 2014, 92(2): 637-644. DOI:10.2527/jas.2013-6514 |
[2] |
DENG D, YAO K, CHU W Y, et al. Impaired translation initiation activation and reduced protein synthesis in weaned piglets fed a low-protein diet[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry, 2009, 20(7): 544-552. DOI:10.1016/j.jnutbio.2008.05.014 |
[3] |
HE L Q, ZHANG H W, ZHOU X H. Weanling offspring of dams maintained on serine-deficient diet are vulnerable to oxidative stress[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2018, 2018: 8026496. |
[4] |
ZHOU X H, HE L Q, ZUO S N, et al. Serine prevented high-fat diet-induced oxidative stress by activating AMPK and epigenetically modulating the expression of glutathione synthesis-related genes[J]. Biochimica et Biophysica Acta:Molecular Basis of Disease, 2018, 1864(2): 488-498. DOI:10.1016/j.bbadis.2017.11.009 |
[5] |
DUCKER G S, RABINOWITZ J D. One-carbon metabolism in health and disease[J]. Cell Metabolism, 2017, 25(1): 27-42. |
[6] |
MATTAINI K R, SULLIVAN M R, VANDER HEIDEN M G. The importance of serine metabolism in cancer[J]. Journal of Cell Biology, 2016, 214(3): 249-257. DOI:10.1083/jcb.201604085 |
[7] |
HONIKEL K O. Reference methods for the assessment of physical characteristics of meat[J]. Meat Science, 1998, 49(4): 447-457. DOI:10.1016/S0309-1740(98)00034-5 |
[8] |
樊路杰, 窦鸣乐, 王小宇, 等. 宰后肌肉抗氧化能力与肉品质的关系[J]. 动物营养学报, 2018, 30(5): 1676-1680. DOI:10.3969/j.issn.1006-267x.2018.05.010 |
[9] |
ZHOU X H, HE L Q, WU C R, et al. Serine alleviates oxidative stress via supporting glutathione synthesis and methionine cycle in mice[J]. Molecular Nutrition & Food Research, 2017, 61(11). DOI:10.1002/mnfr.201700262 |
[10] |
ZHOU X H, ZHANG Y M, HE L Q, et al. Serine prevents LPS-induced intestinal inflammation and barrier damage via p53-dependent glutathione synthesis and AMPK activation[J]. Journal of Functional Foods, 2017, 39: 225-232. DOI:10.1016/j.jff.2017.10.026 |
[11] |
曹玲娟, 龚慧, 颜苗, 等. Nrf2-ARE信号通路参与肝脏疾病病理机制研究进展[J]. 中国药理学通报, 2015, 1(8): 1057-1060, 1061. DOI:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.08.006 |
[12] |
廖霞, 郑少杰, 卢可可, 等. 植物多酚通过Nrf2/ARE信号通路抗氧化作用研究进展[J]. 食品科学, 2016, 37(7): 227-232. |
[13] |
HUSSAIN T, TAN B, YIN Y L, et al. Oxidative stress and inflammation:what polyphenols can do for us?[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2016, 2016: 7432797. |
[14] |
ZHONG Z, WHEELER M D, LI X, et al. L-glycine:a novel antiinflammatory, immunomodulatory, and cytoprotective agent[J]. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care, 2003, 6(2): 229-240. DOI:10.1097/00075197-200303000-00013 |
[15] |
包显颖, 杨青, 李藏兰, 等. 日粮中添加不同水平胱氨酸对矮小型蛋鸡生产性能和蛋品质及抗氧化性能的影响[J]. 中国畜牧杂志, 2014, 50(1): 35-39. DOI:10.3969/j.issn.0258-7033.2014.01.008 |