2. 南京农业大学动物科技学院, 南京 210095;
3. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193;
4. 北京奶牛中心首农集团, 北京 100085
2. Institute of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
3. Beijing Institute of Animal Husbandry and Veterinary Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China;
4. Beijing Cow Center Shounong Group, Beijing 100085, China
随着我国奶业的发展和人们对食品安全愈发的重视[1]，以及畜牧行业的法律法规及奶业行业标准日益完善[2]，使得牛奶收购企业对牛奶的质量要求越来越高[3]。奶牛的健康与牛奶的产量及品质直接决定着奶农的经济效益，且牛奶中的多种乳成分(乳糖、乳脂、乳蛋白和体细胞数)是决定乳品质量的关键性指标，同时也是衡量奶牛能量平衡和乳腺生理及健康情况的重要指征[4]。研究表明，牛奶中乳成分的含量受泌乳量、季节、胎次、泌乳阶段、挤奶次数、饲粮类型、饲粮组成以及奶牛健康状况等各种因素的影响[5]。因此，了解乳成分随泌乳时间、泌乳量等因素的变化规律，对提高奶牛乳品品质、保障奶牛生理健康至关重要。
随着农业现代化的发展，高新的数字化、自动化的检测设备正逐步应用于养殖业当中，使得养殖场的管理更加智能化和信息化[4]。阿菲金在线乳成分分析仪是一个可以统计每头牛每班次泌乳量，并实时检测其乳成分变化的工具，其中的电磁阀可以对当前栏位挤奶奶牛牛奶的电导率进行检测，并将所得数值存入系统。该系统可直接对相关的乳成分进行检测，从而避免了牛奶装置分离、人员采集、样品运输、奶牛牛群改良(DHI)分析(测试的标样校正、奶样预热、奶样混合)等诸多环节的污染和误差的产生[6-7]；并且，其每天所产生的大量实时数据，也是DHI技术每周或是每月采集样本进行分析所不能比拟的。因此，阿菲金在线乳成分分析仪可以更为准确地拟合奶牛泌乳量和乳成分的变化规律，对奶牛的饲养管理、遗传育种及经济效益分析具有非常重要的作用。
本研究旨在运用阿菲金在线乳成分分析仪，探究北京地区不同泌乳水平中国荷斯坦奶牛乳成分的变化规律，并对比分析泌乳量和电导率与各项乳成分之间的相关性，以期为保障奶牛健康、提高乳品品质提供科学依据和理论支持。
1 材料与方法 1.1 试验仪器在线乳成分分析仪32台(AfiFarm3.X，阿菲金，以色列)。
1.2 试验动物及饲养管理按牛场正常饲养条件进行，每天饲喂3次，自由采食，自由饮水，每天06:00、13:00和20:00利用阿菲金管道式挤奶系统挤奶3次，牛群为散栏式饲养。所采用的奶牛饲粮参照NRC(2001)配制，以全混合日粮(TMR)形式饲喂，其组成及营养水平见表 1。饲粮部分营养水平的测定方法如下：参照GB/T 6432—1994测定粗蛋白质含量，参照GB/T 6433—2006测定粗脂肪含量，参照GB/T 6434—2006测定酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量，参照GB/T 6435—2002测定钙含量，参照GB/T 6436—2002测定磷含量。
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表 1 TMR组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the TMR (DM basis) |
利用阿菲金在线乳成分分析仪测定的日泌乳量、电导率、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、乳脂率/乳蛋白率(脂蛋比)的每日数据，分别对2016—2019年北京地区的2 455头平均体重为(626.25±113.37) kg、平均胎次为(2.8±0.6)胎(胎次范围为1~9胎)、干物质采食量为(23.65±6.23) kg/d(干物质采食量范围为8.34~36.15 kg/d)的中国荷斯坦奶牛的剔除兽医诊断疾病的异常数值后的每项308 327条数据进行分析，将牛只按泌乳期内的日平均泌乳量分为高产组(日平均泌乳量大于40 kg/d)、中产组(日平均泌乳量30~40 kg/d)和低产组(日平均泌乳量小于30 kg/d)，拟合分析不同泌乳水平奶牛在整个泌乳期内的数据并建立相关模型。数据采集标准如下：排除泌乳天数小于200 d和大于305 d的数据，并去除体细胞数过高的异常值之后进行相关性分析和模型建立，其中泌乳量范围为6.9~75.3 kg/d，乳脂率范围为1.95%~9.67%，乳蛋白率范围为2.01%~4.21%，乳糖率范围为4.16%~5.70%，脂蛋比范围为0.21~6.00，电导率范围为5.71~17.40 ms/cm。
1.4 统计与分析数据采用Excel 2007和SPSS 22.0软件分别进行初步处理和回归曲线估计模型建立；采用LSD法进行多重检验，决定系数(R2)越接近1拟合度越好。P < 0.01表示差异极显著；P < 0.05表示差异显著。
2 结果与分析 2.1 不同泌乳水平奶牛乳成分之间的差异性不同泌乳水平奶牛乳成分分析如表 2所示。各组之间的泌乳量、电导率、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、乳脂产量、乳糖产量、乳蛋白产量和脂蛋比均具有极显著的差异(P < 0.01)。低产组奶牛的乳蛋白率、乳脂率、乳糖率以及脂蛋比均极显著高于高产组和中产组奶牛(P < 0.01)，同时中产组奶牛极显著高于高产组奶牛(P < 0.01)；低产组奶牛的电导率、乳糖产量、乳脂产量、乳蛋白产量极显著低于中产组和高产组奶牛(P < 0.01)，同时中产组奶牛极显著低于高产组奶牛(P < 0.01)。
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表 2 不同泌乳水平奶牛乳成分分析 Table 2 Milk compositon analysis of dairy cows with different lactation levels |
不同泌乳水平奶牛泌乳量和泌乳天数的拟合曲线如图 1所示。对比分析各泌乳量-泌乳天数曲线模型发现，全群、低产组、中产组和高产组拟合较好的均为三次方模型，R2分别为0.907、0.920、0.884和0.812，且各模型均极显著(P < 0.01)，拟合方程分别为：全群，y=3.526×10-6x3-0.002x2+0.263x+30.46；低产组，y=3.229×10-6x3+0.002x2+0.234x+22.591；中产组，y=3.207×10-6x3-0.002x2+0.247x+29.776；高产组，y=4.807×10-6x3-0.003x2+0.336x+38.887。上述模型中的b1、b2、b3及常数都不同，证明不同泌乳水平奶牛的拟合分析具有意义；同时，从R2可以看出低产组比中产组及高产组具有更好的拟合性。此外，全群、低产组、中产组和高产组奶牛分别于第57、56、58和47天到达了泌乳量最高峰(泌乳量分别达到41.3、32.5、40.2和52.6 kg/d)且维持后缓慢下降。
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a：全群；b：低产组；c：中产组；d：高产组；e：汇总。下图同。 a: total dairy cows; b: low yield group; c: middle yield group; d: high yield group; e: total. The same as below.< 图 1 泌乳量与泌乳天数的拟合曲线 Fig. 1 Fitting curve of lactation yield and lactation days |
不同泌乳水平奶牛电导率与泌乳天数的拟合曲线如图 2所示。对比分析各电导率-泌乳天数曲线模型发现，全群、低产组、中产组以及高产组拟合较好的均为三次方模型，R2分别为0.860、0.854、0.847和0.873，且各模型均极显著(P < 0.01)，拟合方程分别为：全群，y=-1.324×10-8x3+2.457×10-6x2+0.002x+8.627；低产组，y=-8.078×10-8x3+3.136×10-5x2-0.001x+8.623；中产组，y=-1.545×10-9x3-8.928×10-7x2+0.002x+8.622；高产组，y=1.954×10-8x3-1.490×10-5x2+0.005x+8.643。上述模型中的b1、b2、b3及常数都不同，证明不同泌乳水平奶牛的电导率拟合分析具有意义；同时，从R2可以看出高产组比中产组及低产组具有更好的拟合性。
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图 2 电导率与泌乳天数的拟合曲线 Fig. 2 Fitting curve of conductivity and lactation days |
此外，由图 2可知，高产组、中产组和低产组奶牛的电导率到达最低点的时间明显不同，高产组在第9天时就到达了最低点，中产组在第13天，而低产组则在第38天到达电导率的最低点。在第17天之前，高产组电导率低于低产组和中产组，中产组低于低产组。而在第17天后高产组的电导率则高于低产组和中产组。在泌乳后期，高产组电导率在第266天到达高峰后开始下降，中产组在第294天前后到达高峰并保持至第305天，低产组在第245天达到高峰后下降在第283天到达低值后又上升。
2.2.3 泌乳天数对不同泌乳水平奶牛乳脂率的影响及模型建立不同泌乳水平奶牛乳脂率与泌乳天数的回归分析如图 3所示。对比分析各乳脂率-泌乳天数曲线模型发现，全群、低产组、中产组以及高产组拟合较好的均为三次方模型，R2分别为0.801、0.770、0.789和0.831，且各模型均极显著(P < 0.01)，拟合方程分别为：全群，y=-2.509×10-7x3-0.019x+4.379 7；低产组，y=-2.111×10-7x3-0.016x+4.43；中产组，y=-2.293×10-7x3-0.017 2x+4.346；高产组，y=-3.488×10-7x3-0.027x+4.426。模型中的b1、b2、b3及常数都不同，证明不同泌乳水平奶牛的乳脂率拟合分析具有意义；同时，从R2可以看出高产组比中产组及低产组具有更好的拟合性。此外，各泌乳水平奶牛乳脂率随泌乳天数的延长均为先下降后上升的趋势，且各泌乳时间点高产组均低于中产组奶牛和低产组。全群奶牛乳脂率于第54天到达最低值，为3.59；低产组于第46天到达最低值，为3.69；中产组于第47天到达最低值，为3.64；高产组于第68天到达最低值，为3.26。
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图 3 乳脂率-泌乳天数的拟合曲线 Fig. 3 Fitting curve of milk fat percentage and lactation days |
不同泌乳水平奶牛乳蛋白率与泌乳时间的拟合曲线如图 4所示。对比分析各乳蛋白率-泌乳天数曲线模型发现，全群、低产组、中产组以及高产组拟合较好的均为三次方模型，R2分别为0.685、0.721、0.620和0.785，且差异极显著(P < 0.01)，拟合方程分别为：全群, y=-9.885×10-8x3+5.675×10-5x2-0.009x+4.052;低产组, y=-1.114×10-7x3+6.097×10-5x2-0.009x+4.063；中产组, y=-1.036×10-7x3+5.626×10-5x2-0.008x+4.039；高产组, y=-7.577×10-8x3+5.408×10-5x2-0.01x+4.076。模型中的b1、b2、b3及常数都不同，证明不同泌乳水平奶牛的乳蛋白率拟合分析具有意义。在泌乳开始前5 d，高产组奶牛的乳蛋白率高于中产组和低产组，之后开始快速下降，低于低产组和中产组，并且所有泌乳水平奶牛的乳蛋白率都有先下降再上升再趋于稳定后再上升的趋势。其中，全群奶牛的乳脂率于第65天到达最低值，为3.63；低产组于第59天到达最低值，为3.63；中产组于第74天到达最低值，为3.65；高产组于第90天到达最低值，为3.49。
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图 4 乳蛋白率与泌乳天数的拟合曲线 Fig. 4 Fitting curve of milk protein percentage and lactation days |
不同泌乳水平奶牛乳糖率与泌乳天数的拟合曲线如图 5所示。对比分析各乳糖率-泌乳天数曲线模型发现，全群、高产组、中产组以及低产组均无较为符合的函数关系，但我们可以看出中、低产组奶牛的乳糖率随泌乳天数的延长先上升后趋于稳定；高产组奶牛则呈现先升高然后下降再升高的趋势。
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图 5 乳糖率与泌乳天数的拟合曲线 Fig. 5 Fitting curve of lactose percentage and lactation days |
不同泌乳水平奶牛脂蛋比与泌乳天数的拟合曲线如图 6所示。对比分析各乳蛋白率-泌乳天数曲线模型发现，全群、低产组、中产组以及高产组拟合较好的均为三次方模型，R2分别为0.902、0.723、0.893和0.899，且各模型均极显著(P < 0.01)，拟合方程分别为：全群，y=-4.482×10-8x3+2.282×10-5x2-0.003x+1.162；低产组，y=-3.950×10-8x3+2×10-5x2-0.002x+1.215；中产组，y=-3.600×10-8x3+1.875×10-5x2-0.002x+1.167；高产组，y=-7.677×10-8x3+3.732×10-5x2-0.004x+1.107。模型中的b1、b2、b3及常数都不同，证明不同泌乳水平奶牛脂蛋比的拟合分析具有意义。在整个泌乳周期中，低产组的脂蛋比始终高于中产组和高产组；并且，所有泌乳水平奶牛的脂蛋比都有先下降然后上升，再趋于稳定后再上升的趋势。低产组奶牛的脂蛋比于第30天到达最低值，为1.10，中产组于第53天到达最低值，为1.07，高产组于第68天到达最低值，为0.93。
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图 6 脂蛋比与泌乳天数的拟合曲线 Fig. 6 Fitting curve of fat to protein ratio and lactation days |
本研究中将泌乳量分为1~60 d、61~305 d 2个阶段进行对比分析。在1~60 d阶段，泌乳量呈现上升的趋势；在61~305 d阶段，泌乳量则呈现下降的趋势。对1~60 d、61~305 d 2个阶段的泌乳量与乳成分进行了相关性分析和差异性分析，结果如表 3所示。在1~60 d阶段，泌乳量在高产组与电导率呈极显著正相关(P＜0.01)，在中产组和低产组与电导率呈极显著负相关(P＜0.01)，在全群与电导率呈显著负相关(P＜0.05)；泌乳量在全群组、高产组、中产组和低产组均与乳脂率、乳蛋白率、脂蛋比呈极显著负相关(P＜0.01)，与乳糖率在高产组和低产组呈极显著正相关(P＜0.01)，在全群组呈显著正相关(P＜0.05)，在中产组则无相关关系(P>0.05)。在61~305 d阶段，泌乳量与全群组、高产组、中产组和低产组的电导率、乳脂率、乳蛋白率、脂蛋比以及高产组的乳糖率呈极显著负相关(P＜0.01)。
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表 3 不同产奶阶段泌乳量与电导率、相关乳成分的相关性分析 Table 3 Correlation analysis of lactation yield and conductivity, milk components in different milk production stages |
由于电导率在不同泌乳时间具有不同的趋势，故本研究将不同泌乳水平奶牛按单一变化分割时间段。将高产组奶牛按泌乳天数分别为1~8 d、9~266 d和267~305 d 3个阶段，中产组分为1~17 d和18~305 d 2个阶段，低产组分为1~37 d、38~245 d、246~283 d和284~305 d 4个阶段分别进行分析，如表 4所示。
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表 4 不同产奶阶段电导率与泌乳量、乳成分的相关性分析 Table 4 Correlation analysis of conductivity and lactation yield, milk components in different milk production stages |
高产组奶牛的相关性分析结果表明，电导率在1~8 d与乳脂率、乳蛋白率呈极显著负相关(P＜0.01)；在9~266 d与泌乳量、乳蛋白率、乳糖率呈极显著负相关(P＜0.01)，与乳脂率、脂蛋比呈极显著正相关(P＜0.01)；在265~305 d与乳脂率、乳蛋白率呈极显著负相关(P＜0.01)。
中产组奶牛的相关性分析结果表明，电导率在1~17 d与乳脂率、乳蛋白率呈极显著正相关(P＜0.01)，与脂蛋比呈显著正相关(P＜0.05)，与泌乳量呈极显著负相关(P＜0.01)；在17~305 d与泌乳量呈极显著负相关(P＜0.01)，与乳脂率、乳蛋白率、脂蛋比呈极显著正相关(P＜0.01)。
低产组奶牛的相关性分析结果表明，电导率在1~37 d与泌乳量、乳糖率呈极显著负相关(P＜0.01)，与乳蛋白率、乳脂率、脂蛋比呈极显著正相关(P＜0.01)；在38~245 d与泌乳量呈极显著负相关(P＜0.01)，与乳脂率、乳蛋白率、脂蛋比呈极显著正相关(P＜0.01)；在246~283 d与泌乳量呈极显著正相关(P＜0.01)，与乳脂率、乳蛋白率、脂蛋比呈极显著负相关(P＜0.01)；在284~305 d与各指标均无显著相关关系(P>0.05)。
3 讨论 3.1 不同泌乳水平奶牛乳成分之间的差异性不同泌乳水平的奶牛，乳成分之间存在显著性差异。本课题组已有研究表明，泌乳中期的中国荷斯坦奶牛，高产组[泌乳量(31.90±1.76) kg/d]和低产组[泌乳量(19.30±1.76) kg/d]奶牛的乳脂率和乳蛋白率具有显著差异[8-10]。在本研究中，扩大了样本量并加大了样本间泌乳量的差距，进一步证实了高产组奶牛与中产组奶牛相比乳脂率和乳蛋白率显著降低，但乳糖率与之前的研究略有差异，之前的研究表明高产组奶牛的乳糖率高于低产组[8]，但本研究中乳糖率则表现为高产组低于中产组，出现这种现象原因的可能是泌乳水平区间选取的不同造成的。本研究中高产组奶牛的乳糖产量较高，但泌乳量大，之前的研究泌乳量2组之间差别较小，稀释作用不明显，造成高产组乳糖率偏高的现象[10-11]。当本次研究增加样本量并加大泌乳水平间的差距后发现高产奶牛具有更高的乳糖、乳脂和乳蛋白产量，3个组之间差异极显著，但是由于“稀释作用”的影响，在实际测量中高产奶牛具有更低的乳糖率、乳脂率和乳蛋白率。牛奶中的乳糖、乳脂和乳蛋白构成了主要的乳能量[12-13]大量的研究表明，泌乳的过程产生了大量乳能量，这需要动员机体能量储备[13-15]，高产奶牛产生了更多的乳糖、乳脂和乳蛋白，就需要有更多的能量储备以及更好的乳腺状态，将更多的能量分配给乳腺产奶[13-15]，说明高产组奶牛具有更好的乳腺状态，但同时较高的泌乳量也给乳腺增加了更多的压力。本研究还发现，对于未患乳房炎的奶牛，高产组的奶牛具有更高的电导率。电导率是一种公认的反映乳中体细胞数的有效手段，并广泛的被用于乳房炎的监测当中[16]。目前关于电导率的研究多使用事后检测，在这一过程中有诸多因素会导致电导率的改变[17]。此外，根据Steeneveld等[16]的研究，温度对乳汁的电导率有很大的影响[18]。本研究测定电导率时使用的是阿菲金实时乳成分分析仪，避免了外界因素的干扰，使得测定的电导率数值更真实。冯军科等[18]的研究表明，阿菲金实时乳成分分析仪预测隐性乳房炎的电导率阈值为9.3，但该研究排除了泌乳末期、干奶前期的奶牛，因此，与本研究的结果基本一致。本研究中还发现电导率随泌乳量的升高而升高，即体细胞数随泌乳量的升高而升高，这与Roca等[19]在羊上的研究所一致，产生此现象的原因是超负荷的生产压力造成乳腺和导管的损伤，导致上皮细胞凋亡和乳头括约肌松弛，更易造成微生物入侵，因此，需要更多的免疫细胞，从而造成体细胞数的升高[20]。
3.2 不同泌乳水平奶牛泌乳量和乳成分的泌乳阶段变化模型研究乳成分在泌乳阶段变化与泌乳时间之间存在明显的相关关系。本研究使用曲线回归模型估计，用三次方的模式模型可较好地拟合泌乳量及乳成分随泌乳时间的变化，这与Zhang等[20]建立的模型使用的拟合模型不同。本试验中乳成分和泌乳量都具有规律性，并且高、中、低产奶牛表现出了显著的差异性；此外，由于本研究使用的乳成分观察数据仅考虑泌乳水平的影响，胎次、季节、温湿度数据涉及较少，因此本研究所建立的回归模型具有一定局限性。尽管如此，本研究所得泌乳量-泌乳天数曲线模型也与熊本海[21-22]、Ben等[23]、van Knegsel等[24]对不同胎次、季节因素对荷斯坦奶牛DHI影响的研究中所得结果有相似的趋势。本研究建立的乳成分和泌乳量与泌乳天数的回归模型还需要通过更多不同牛场、不同泌乳水平的乳成分变化数据进行验证，以达到对模型的检验。
另外，本试验结果显示不同泌乳水平的奶牛的乳成分到达最低值以及电导率到达最低值和第2次最高值的时间不同，推测是能量负平衡造成了这一现象。通过泌乳期前30 d表现出的高产组奶牛低电导率和高乳脂率，推测泌乳初期高产组的乳腺状态和能量储备好于中产组和低产组，由于高产组奶牛生产需要更多的乳脂、乳蛋白和乳糖，从而导致机体消耗更多的能量用于产生乳成分[14]，使机体用于维持自身生理作用的能量减少，因此造成了能量负平衡的发生[26]。在Herve等[14]和Ben Meir等[25]的研究中均发现限制饲粮会造能量负平衡的产生，并导致体细胞数的增加以及乳脂率、乳糖率、乳蛋白率的改变，与本研究结果相同。脂蛋比是反映奶牛能量平衡的重要指标之一[26]，Petrovska等[26]认为脂蛋比应在1.12~1.36，小于1.12则表示机体在快速消耗体脂，造成能量负平衡。本试验发现，高产组奶牛在泌乳高峰期的脂蛋比低于1.12，这也证实了高产奶牛在泌乳高峰期处于能量负平衡状态。由于本试验并未对牛奶中的乳能量进行实际的测定，也没有对血液中能量标志物进行检查，因此该结论还需要通过检测相关指标进行验证。
3.3 泌乳量、电导率与乳成分的相关性在泌乳周期的不同泌乳阶段内乳成分与电导率和泌乳量之间存在明显的相关关系。电导率反映的是乳汁中的体细胞数，体细胞中多为巨噬细胞、白细胞等免疫细胞，奶牛在泌乳初期增加免疫细胞数有助于帮助机体抵御生产带来得生产应激[27]，从而显示出奶牛的乳腺状态。赵萌[28]的研究认为，电导率快速降低的原因是泌乳量增加的稀释作用，而电导率的升高是由于过大产奶压力导致乳腺上皮损伤造成的。而Herve等[14]则认为电导率的升高是由于能量负平衡导致的乳腺上皮脱落率增加造成的。本研究结果与孙宇等[27]、赵萌[28]的研究结果相似，高产组奶牛较高的泌乳量使得乳腺的代谢增强，可能是造成体细胞数增加的主要原因之一。然而，高产组奶牛因为具有较高的泌乳能力，因此需要趋化更多的免疫细胞抵御外界刺激，这也可能是高产组奶牛具有更高的体细胞数的原因[28]。本研究中，在泌乳天数大于60 d后，泌乳量与各泌乳水平组的电导率、乳脂率、乳蛋白率、脂蛋比以及高产组的乳糖率呈极显著负相关。这可能是由于随着泌乳量的增加，能量平衡逐渐被打破，而到了泌乳末期由于泌乳量较少，低产组的能量负平衡状态较轻，更容易恢复，高产奶牛的能量负平衡状态较重，故恢复较慢，所以出现了电导率下降较晚的现象。因此，我们认为电导率和泌乳量均与乳成分具有相关性，但是对电导率和泌乳量对乳成分产生影响的相关机制并不清晰，仍需进一步研究。
4 结论① 不同泌乳水平奶牛的泌乳量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、脂蛋比和电导率均存在极显著的差异，并且随着泌乳时间的改变而改变，其中泌乳量和电导率是引起乳成分改变的重要因素，因此，对不同泌乳水平的奶牛分别拟合分析具有一定的实践指导意义。
② 三次方模型能较好地定量描述北京地区不同泌乳水平的中国荷斯坦奶牛各乳成分-泌乳天数曲线变化规律。
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