2. 湖南舜天恒禾农业科技发展有限公司, 宁远 425600;
3. 湖南天华实业有限公司, 娄底 417000
2. Hunan Shuntian Henghe Agricultural Science and Technology Development Co., Ltd., Ningyuan 425600, China;
3. Hunan Tianhua Industrial Co., Ltd., Loudi 417000, China
目前，我国草食畜牧业迅速发展，但由于我国饲草种植成本较高，高产奶牛的优质饲草(苜蓿、燕麦等)以进口为主，粗饲料能否稳定、优质和可接受成本供给成为发展草食畜牧业的关键因素之一。因此，如何降低粗饲料成本，为草食家畜提供稳定安全的青粗饲料，是解决草食动物规模化养殖的前提条件。再生稻作为水稻种植模式之一，头季稻谷品质较差，再生季产量低，限制了再生稻种植模式作为人类口粮的推广应用。据各地热量资源测算，我国适宜发展再生稻的耕地面积约335万hm2，而实际种植面积只有40万hm2，如能找到一种既能解决再生稻头季销售去向，又能提高再生季稻谷产量的生产利用模式，再生稻种植模式将具有很大的发展空间[1]。通过将再生稻头季提前进行全株刈割制作青贮，延长再生季生育期，可以大幅提升再生季稻谷产量，同时为草食动物提供稳定且有质量保障的青粗饲料。
不同青贮发酵时间对青贮品质和体外瘤胃发酵特性影响较大，一般青贮发酵在40~45 d即可完成，青贮时间过短会导致发酵不充分，pH过高等问题[2]。再生稻头季全株青贮发展起步较晚，且研究主要集中在稻秸的品种特性[3]、青贮添加剂的选择[4]以及混合青贮技术[5]上，青贮时间的长短对再生稻头季全株青贮品质的影响和体外瘤胃发酵特性的研究还鲜见报道。因此，本研究以再生稻头季全株为研究对象，评价不同青贮时间对再生稻头季全株青贮品质和青贮后体外瘤胃发酵特性，以期确定适宜的青贮发酵时间，为合理青贮利用再生稻头季全株提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 青贮试验 1.1.1 青贮调制青贮原料为大通湖区宏硕生态农业农机合作社试验地种植的水稻(湘两优900)，刈割时期为齐穗后10 d，留茬高度为10 cm，切碎至2~3 cm待用。青贮原料营养水平见表 1。将青贮原料分别装入聚乙烯袋(200 mm×300 mm)中，用真空包装机(诺丰DZ400/2D)抽真空模拟裹包青贮，在室温条件下(25 ℃左右)分别贮藏储存45、53和60 d后进行开包取样，分别记为S45组、S53组和S60组，每个组6个重复。
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表 1 青贮原料营养水平(风干基础) Table 1 Nutrient levels of silage raw materials (air-dry basis) |
各组逐一开启青贮袋并混匀后，按“四分法”得到分析样品，每个重复600 g左右，然后进行粉碎，一部分过40目孔筛，进行营养物质干物质(DM)、粗蛋白质(CP)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、可溶性碳水化合物(WSC)含量的检测；另一部分过60目孔筛，清洁干燥处保存，用于进行体外发酵试验。
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青贮袋开启后，各组按“四分法”称取20 g青贮饲料，加入180 mL去离子水，用榨汁机(九阳JYL-C012型多功能搅拌机)榨汁1 min，匀质液用4层纱布过滤，测定pH。滤液用于测定氨态氮(NH3-N)和挥发性脂肪酸(VFA)含量。
1.2 体外发酵试验 1.2.1 供体动物饲养管理以再生稻头季全株青贮样品进行体外发酵试验。选择3只安装永久性瘤胃瘘管、体况良好、体重[(25.0±2.0) kg]接近的成年湘东黑山羊羯羊作为体外瘤胃液供体动物，参考《肉羊饲养标准》(NY/T 816—2004)配制饲粮，每日营养需要按照1.3倍维持需要进行设计，饲粮精粗比为40 : 60。精料组成(风干基础)为：玉米47.00%，豆粕24.00%，麸皮22.00%，食盐0.77%，石粉2.23%，预混料4.00%。粗饲料为玉米秸秆，铡短，长度2~3 cm；精料经2.5 mm筛粉碎。山羊自由饮水，单笼饲养，实行限饲，采食量设计为风干样500 g/d，每天08:00和16:00各等量饲喂1次。预试期调整山羊采食量，确保试验期能完全采食。
1.2.2 人工瘤胃缓冲液与培养液配制人工瘤胃缓冲液参照Menke等[8]的方法进行配制。取520.2 mL蒸馏水、0.1 mL微量元素溶液、208.1 mL缓冲溶液、208.1 mL常量元素溶液和1.0 mL刃天青溶液，于具塞玻璃瓶中，持续充入CO2气体，置于恒温水浴中预热至39.5 ℃待用。使用前加入62.4 mL还原剂溶液，并继续充入CO2气体，直至缓冲液从蓝色转变红色，再变为近无色即可。试验当天晨饲前采集供体羊的瘤胃液1 000 mL，置于预先通有CO2的保温瓶中，立即盖严瓶口，迅速带回实验室。将供体羊的瘤胃液混合均匀后经4层纱布挤压过滤于接收瓶中，置于39.5 ℃水浴中保存，并持续充入CO2以确保瘤胃液处于厌氧环境。以体积比1 : 4的比例将瘤胃液和已预热至39 ℃的人工瘤胃缓冲液混合均匀制成培养液。
1.2.3 体外发酵操作采用Menke等[8]的体外产气法，分别称取S40组、S53组和S60组的样品各0.6 g放入200 mL发酵瓶中，并将其置入39.5 ℃恒温培养箱内预热30~60 min。取50 mL培养液厌氧分装至200 mL发酵瓶中(边操作边通入CO2)，发酵瓶用橡胶塞和铝盖封口后，在(39.5±0.5) ℃的水浴摇床中体外发酵24 h，每个样品设6个重复，同时做空白试验。发酵过程中，用具有1 mL分度的100 mL具塞注射器装体外产气管分别记录培养3、6、9、12和24 h的产气体积。
在24 h体外发酵结束后，迅速将发酵瓶放置在碎冰中终止发酵，用已编号并65 ℃烘干称重的尼龙布(50 μm)过滤，再经蒸馏水冲洗发酵瓶数次直至干净，确保发酵瓶内无残留物。待滤液置于接受瓶后，将尼龙布及滤渣小心无损地转移到烘箱中65 ℃烘干48 h至恒重。
1.2.4 体外产气量与产气参数的计算采用以下公式计算产气量：
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式中：GPt为样品在t时刻的产气量(mL)；Vt为样品发酵t小时后，玻璃管刻度读数(mL)；V0为样品在开始培养时的玻璃管刻度读数(mL)；W为样品干物质重量(mg)；GP空白为空白对照在t时刻的产气量。
采用Ørskov等[9]提出的数学模型对0~24 h的产气规律进行拟合：
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式中：GP为t时刻产气量；a为快速降解部分的产气量(mL)；b为慢速降解部分的产气量(mL)；c为慢速降解部分的产气速率(%/h)；a+b为潜在产气量(理论总产气量)(mL)；t为发酵时间(h)。
1.2.5 体外瘤胃发酵特性发酵24 h后迅速采用pH计(UB-7型，Denver Instrument公司，美国)对每个发酵瓶中的发酵液进行pH测定，并将发酵液分装到5 mL离心管中，-20 ℃保存，测定其VFA和NH3-N含量。
1.2.6 体外降解特性评定将装有滤渣的尼龙布反复用水洗涤后，晾干，105 ℃烘4 h后称重，测定其DM、CP、NDF和ADF含量，按以下公式计算体外瘤胃发酵底物的DM降解率和营养物质降解率：
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饲料样品在体外发酵24 h的产气量与绵羊体内有机物(OM)降解率之间呈显著的正相关[8]，体外OM降解率公式为：
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式中：GP为24 h产气量；CP为粗蛋白质含量。
1.3 指标测定方法DM、CP或总氮(TN)、NDF、ADF及EE含量的测定分别按GB/T 6435—2006、GB/T 24318—2009、GB/T 20806—2006、NY/T 1459—2007及GB/T 6433—2006的方法进行，参考Zahiroddini等[10]的方法测定WSC含量，总能(GE)的测定采用氧弹燃烧法。用Spectrum公司SI400型pH计测定pH[11]。通过装有检测器和HP-INNOwax毛细管色谱柱(30.0 m×320 μm×0.5 μm)的气相色谱仪(GC-2010；Shimadzu Corporation，日本)测定VFA含量[12]，主要测定乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸、正戊酸5种VFA含量。采用T/CAAA 003—2018中的苯酚-次氯酸钠比色法测定滤液中NH3-N含量。
1.4 数据统计数据经Excel 2010整理后，利用SPSS 23.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法进行多重比较，结果以平均值±标准误表示，P＜0.05为差异显著，0.05≤P＜0.10为有趋势。
2 结果 2.1 青贮时间对再生稻头季全株青贮营养物质含量的影响如表 2所示，S53组的DM含量最高，显著高于S60组(P < 0.05)。S53组和S60组的CP含量显著高于S45组(P < 0.05)，且S53组和S60组之间无显著差异(P＞0.05)。S53组和S60组的NDF含量显著低于S45组P < 0.05)，且S53组和S60组之间无显著差异(P＞0.05)。S53组和S60组的ADF含量显著低于S45组(P < 0.05)，且S60组显著低于S53组(P < 0.05)。各组之间EE、WSC含量和GE无显著差异(P＞0.05)。S60组的TDN含量与S45组相比有增加趋势(P=0.056)。S53组和S60组的RFV显著高于S45组(P < 0.05)，且S53组和S60组之间无显著差异(P＞0.05)。
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表 2 青贮时间对再生稻头季全株青贮营养物质含量的影响(风干基础) Table 2 Effects of silage time on nutrient contents of first season ratoon rice whole silage (air-dry basis) |
如表 3所示，各组之间pH、NH3-N/TN及乙酸、丁酸、异戊酸、正戊酸含量无显著差异(P＞0.05)。各组丙酸含量均较低，为0.17~ 0.21 mmol/L，S45组的丙酸含量显著高于S53组和S60组(P < 0.05)，且S53组和S60组之间无显著差异(P＞0.05)。
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表 3 青贮时间对再生稻头季全株青贮品质的影响 Table 3 Effects of silage time on quality of first season ratoon rice whole silage |
如表 4所示，S60组的24 h累积产气量显著高于S45组和S53组(P＜0.05)，且S45组和S53组之间无显著差异(P＞0.05)。S60组的快速降解部分的产气量与S45组相比有降低趋势(P=0.088)。S60组的慢速降解部分的产气速率显著高于S45组和S53组(P＜0.05)，且S45组显著高于S53组(P＜0.05)。
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表 4 青贮时间对再生稻头季全株青贮24 h累积产气量和体外产气参数的影响 Table 4 Effects of silage time on 24 h cumulative gas production and gas production parameters in vitro of first season ratoon rice whole silage |
如表 5所示，S60组的pH显著低于S45组和S53组(P＜0.05)，且S45组和S53组之间无显著差异(P＞0.05)。S60组的乙酸、丙酸、总挥发性脂肪酸(TVFA)和NH3-N含量显著高于S45组和S53组(P＜0.05)，且S45组和S53组之间无显著差异(P＞0.05)。S60组的丁酸和异戊酸含量显著高于S53组和S45组(P＜0.05)，且S45组显著高于S53组(P＜0.05)。S60组的乙酸/丙酸和正戊酸含量与S53组相比有增加趋势(P=0.086、P=0.073)。
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表 5 青贮时间对再生稻头季全株青贮体外瘤胃发酵特性的影响 Table 5 Effects of silage time on in vitro rumen fermentation characteristics of first season ratoon rice whole silage |
如表 6所示，S60组的DM、OM和CP降解率显著高于S45组和S53组(P＜0.05)，且S45组和S53组之间无显著差异(P＞0.05)。各组之间的NDF和ADF降解率无显著差异(P＞0.05)。
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表 6 青贮时间对再生稻头季全株青贮体外营养物质降解率的影响 Table 6 Effects of silage time on nutrient degradation rates in vitro of first season ratoon rice whole silage |
青贮品质受青贮原料生理阶段、刈割时间、处理方式、青贮方法和青贮时间等因素的影响，合理的青贮时间对提高青绿饲料的利用率具有十分重要的指导意义。本研究分析了青贮45、53和60 d的再生稻头季全株青贮品质变化特点，发现随着青贮时间的延长，再生稻头季全株青贮的CP、EE含量和GE逐渐升高，而NDF和ADF含量逐渐降低，这与王志敬等[13]研究结果一致。CP含量增加的主要原因可能是乳酸菌等发酵微生物在发酵过程中利用了WSC等营养物质，DM含量降低，使得再生稻头季全株青贮随着青贮时间的延长，CP含量相对升高。同时，微生物蛋白(MCP)含量为50%~60%，在发酵过程中，乳酸菌等微生物不断增殖，也有提高青贮CP含量的作用。TDN和RFV是衡量饲粮采食量和能量价值的重要指标[14-15]。本试验结果显示，随着青贮时间的延长，再生稻头季全株青贮的TDN含量有增加的趋势，RFV显著增加，说明通过延长青贮时间可以使再生稻头季全株青贮的NDF和ADF含量下降，从而提高饲料利用率。
pH通常用来衡量青贮饲料品质的好坏指标之一，理想pH在3.9~4.2[16]。本试验中，各组pH均在4.4~4.5，pH没能降到理想区间，可能是发酵底物的WCS含量偏低，或是发酵过程中乙酸较乳酸的酸性弱，乳酸菌在发酵后期变得活跃，可以将乳酸转化为醋酸和1, 2-丙二醇[17]，建议在条件容许时，可以适当添加WCS含量较丰富的原料进行混合青贮来提高全株水稻青贮品质。VFA含量是反映青贮品质好坏的重要指标。Danner等[18]研究发现，乙酸可以作为稳定提高玉米青贮有氧稳定性的青贮发酵产物。本试验中，随着青贮时间的延长，再生稻头季全株青贮乙酸含量略有上升，与刘桂要[19]研究结果一致，且符合推测造成pH上升的原因之一，同时也对提高再生稻头季全株青贮具有促进作用。丙酸具有抑制真菌的作用[20]，在青贮饲料中含量较低。本试验中，再生稻头季全株青贮丙酸含量经45 d发酵后较高，且随着青贮时间的延长显著降低；丁酸含量随着青贮时间的延长而略有降低，且最高为(1.28±0.06) mmol/L，符合优质青贮饲料的要求。NH3-N/TN被广泛用于衡量青贮品质的好坏。NH3-N主要是丁酸菌和大肠杆菌分解青贮原料有机含氮物质生成，从而使青贮饲料的营养价值降低[21]。本试验中，各组的NH3-N/TN较高，与琚泽亮等[22]研究青贮时间对燕麦与箭筈豌豆混合青贮结果相似，这可能是青贮原料TN含量低(CP为8.31%)，少量NH3-N产生也可造成NH3-N/TN较高。总体来看，再生稻头季全株青贮60 d时可以在一定程度上改善青贮品质。
3.2 青贮时间对再生稻头季全株青贮体外瘤胃发酵特性的影响饲料的体外瘤胃发酵产气量可以反映饲料在瘤胃中的可发酵程度，瘤胃的微生物数量、降解能力以及发酵底物的自身特性共同决定饲料体外发酵的产气量。本试验中，S60组体外瘤胃发酵24 h累积产气量以及慢速降解部分的产气速率显著增加，同时，随着青贮时间的延长，快速降解部分的产气量有降低趋势，说明青贮60 d后，微生物对再生稻头季全株青贮的发酵更充分，有利于瘤胃微生物的生长。
pH是瘤胃内环境的重要指标，瘤胃微生物生长繁殖适宜的pH为6.0~7.0。体外发酵试验结果表明，随着青贮时间的延长，pH显著降低，说明青贮时间对体外瘤胃发酵液pH有影响，且各组pH均略高于7.0，为7.06~7.15，与雒瑞瑞等[23]研究结果(pH 7.02~7.28)相似，对瘤胃纤维素分解菌的活性不会产生不良影响。瘤胃中VFA是微生物发酵饲料中碳水化合物产生的，其含量的多少及组成成分不仅反映了碳水化合物在瘤胃中消化率的高低，同时也是衡量瘤胃微生物活力的重要指标，瘤胃发酵产生的VFA以乙酸、丙酸和丁酸为主，占TVFA的95%左右。乙酸是乳脂合成的主要前体物质，丙酸则是乳糖合成的主要前体物质，丁酸则在被瘤胃壁吸收的过程中，参与体内物质的代谢，尤其作为肌肉组织的能量来源。本试验结果表明，经60 d青贮后的再生稻头季全株青贮体外发酵产生的乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸和TVFA含量均显著增加，乙酸/丙酸和正戊酸含量具有增加的趋势，说明青贮时间为60 d时对提升青贮原料在瘤胃中的降解有促进作用。同时，体外发酵过程中的产气量与VFA含量具有正相关关系，这与Blümmel等[24]研究结果一致；TVFA含量与OM的降解率呈正相关，这与Zhang等[25]研究结果一致。瘤胃中NH3-N既是微生物对底物含氮物质代谢的终产物，也是合成MCP的主要氮源[26]。Owens等[27]研究指出，瘤胃微生物合成MCP所需的NH3-N含量为0.35~29.00 mg/dL。本试验中，各组体外瘤胃发酵液NH3-N含量(3.46~4.74 mg/dL)均位于正常范围，但略低，可能是在体外发酵试验中，发酵瓶内除了溶解在发酵液中的NH3-N，发酵滤渣中还有NH3-N残留。随着青贮时间延长，发酵液NH3-N含量显著提高，可能是由于青贮60 d后，再生稻头季全株青贮提供了更高的CP含量，从而CP的降解速度加快[28]。综合来看，S60组发酵液NH3-N含量显著提高，说明延长青贮时间可以使瘤胃微生物作用增强。
青贮饲料所引起的瘤胃环境改变还表现在对营养物质的降解上。不同青贮时间的再生稻头季全株青贮DM、OM和CP降解率有一定的差异，本试验中，青贮60 d的再生稻头季全株青贮DM降解率显著升高，可能是与其青贮底物的TDN含量升高、RFV增加有关，且与S60组OM和CP降解率显著升高一致，说明随着青贮时间延长，瘤胃微生物对再生稻头季全株青贮的发酵利用效果最好。总体来看，延长青贮时间可以在一定程度上提高再生稻头季全株青贮瘤胃微生物利用效率。
4 结论① 再生稻头季全株青贮延长青贮时间至60 d，RFV更高，青贮品质更优。
② 体外发酵可提高S60组再生稻头季全株青贮累积产气量和慢速降解部分的产气速率，降低瘤胃液的pH，增加乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸、TVFA和NH3-N含量，提高DM、OM和CP降解率。
③ 在生产实际中，再生稻头季全株青贮时间建议延长至60 d以上再饲用，营养价值更佳。
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