2. 黑龙江省杜尔伯特蒙古自治县畜牧局, 大庆 166299
2. Animal Husbandry Bureau of Duerbert Mongolia Autonomous County, Daqing 166299, China
为了提高养猪业的经济效益,提高养殖效率,现代化养猪生产普遍采用早期断奶技术,且仔猪断奶日龄日趋提前[1]。然而早期断奶时仔猪肠道没有完全发育成熟,采食量出现下降,生长受阻[2]。如何为断奶仔猪正常生长提供全面的营养,增强断奶仔猪机体免疫力,提高仔猪生长速度,是目前养猪业所面临的重要任务。为解决这些难题,首先要了解仔猪在早期断奶期间机体营养物质的变化和营养物质的转运吸收机制。氨基酸作为重要的营养物质之一,既可氧化供能[3],又可作为蛋白质[4]、核苷类以及聚胺类合成的前体物,且通过其转运载体的调控参与动物肠道营养物质代谢[5]。其中谷氨酸(Glu)和谷氨酰胺是与肠黏膜生长和代谢相关的重要氨基酸[6],对仔猪的生长发育尤为重要。谷氨酸转运中,通过非钠离子依赖的谷氨酸/谷氨酰胺转运载体(Xc-)系统进行谷氨酸-胱氨酸交换,通过中性氨基酸转运载体系统(ASC)将其前体物谷氨酰胺转运,产生谷氨酸[7]。但早期断奶条件下,仔猪小肠谷氨酸/谷氨酰胺转运载体的表达发生怎样的变化,尚未见报道。因此,本研究以饲粮中不添加谷氨酸和谷氨酰胺的隔离早期断奶饲养的仔猪为研究对象,着重研究早期断奶对仔猪小肠谷氨酸/谷氨酰胺转运载体系统中的谷氨酸/胱氨酸交换载体(xCT)和中性氨基酸转运载体2(ASCT2)的影响,探讨早期断奶对仔猪小肠谷氨酸转运的影响,对了解仔猪小肠中谷氨酸转运及调控的深层机理具有重要意义,为断奶仔猪饲粮中添加谷氨酸或谷氨酰胺寻求理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计仔猪小肠样品来自本实验室前期的动物饲养试验,试验分别从40头不同母猪的仔猪中各选出体重相近、10日龄的杜长大三元杂交仔猪1头,共40头仔猪,随机不配对分为2组,每组20头仔猪,对照组为哺乳仔猪,随母猪喂养;试验组为断奶仔猪,饲喂玉米-豆粕型商品饲粮,进行单栏隔离饲养,试验期10 d。仔猪的饲粮组成及营养水平,以及详细的饲养管理参考前期的研究[8]。
1.2 样品采集仔猪饲养结束,每组随机选取12头仔猪,异氟烷麻醉后屠宰,取空肠和回肠,用无菌冰生理盐水冲洗干净内容物,并在各肠段中间位置分别取1和5 cm肠段样品,1 cm肠段样品装于含4%甲醛的标本瓶中,室温保存,用于检测小肠组织形态;5 cm肠段样品装于15 mL离心管中,液氮冻存。并在液氮存在下用研钵进行组织研磨,小肠组织研磨粉装入冻存管中,于-80 ℃保存,用于测定谷氨酸/谷氨酰胺转运载体蛋白和mRNA表达量,并检测小肠氧化应激水平。
1.3 指标检测 1.3.1 谷氨酸/谷氨酰胺转运载体蛋白和mRNA表达量检测根据前期研究[8]方法制备仔猪空肠和回肠的组织匀浆、细胞内质和细胞顶膜样品,分别采用Western-blot和实时荧光定量-PCR(RT-PCR)方法检测xCT和ASCT2蛋白和mRNA表达量。
蛋白检测:首先使用牛血清蛋白(级分Ⅳ,Bio-Rad公司)作为蛋白标准,采用比色法,通过96孔板读板分光光度计(Fisher公司)测定组织匀浆、细胞内质和顶膜样品中蛋白质的含量;按蛋白质含量稀释样品,进行基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE,Bio-Rad公司)和转膜抗体孵育(半干转膜仪,Bio-Rad公司),分别检测xCT、ASCT2和持家基因β-肌动蛋白(β-actin)蛋白表达量。最后用Scion成像软件(Scion公司,弗雷德里克)对图像进行印迹光密度扫描测定。
各蛋白抗体及稀释浓度如下:xCT一抗为鼠抗人xCT多克隆抗体(Chemicon,Temecula公司),用6%脱脂牛奶溶解到1×三羟甲基氨基甲烷等渗缓冲盐溶液(TBS)中进行1 : 250稀释。ASCT2一抗为羊抗人ASCT2多克隆抗体(圣克鲁斯生物国际有限公司),1 : 2 000稀释;β-actin一抗为鼠抗人单克隆抗体(Bio-Rad公司),1 : 10 000稀释;二抗均用兔抗人免疫球蛋白G(IgG)抗体(Bio-Rad公司),1 : 10 000稀释。
基因检测:引物序列和产物大小见表 1,由Invitrogen公司合成。
采用25 μL反应体系,体系组成参见iQ SYBR Green Supermix RT-PCR试剂盒(Qiagen公司)说明书,进行RT-PCR检测(实时定量RT-PCR仪,Bio-Rad公司)。操作程序为:反转录程序(50 ℃ 30 min);蛋白质变性程序(95 ℃ 15 min);扩增和量化程序,重复45个循环(95 ℃变性15 s,54 ℃退火15 s,72 ℃延伸15 s);熔解曲线程序(60~99 ℃,以0.1 ℃/s的速度加热,且进行荧光测量)。
目的基因与持家基因相对表达量比值的计算公式如下:
式中:R为目的基因的相对表达比值;Ct表示阈值的循环数。
1.3.2 空肠和回肠黏膜形态学测定将仔猪空肠和回肠样品经福尔马林液浸泡固定,经石蜡包埋,染色制成切片。制好的切片用Leica DMR型光学显微镜5.0×放大率测量每头仔猪空肠和回肠的绒毛高度、隐窝深度和平滑肌厚度。计算绒毛高度/隐窝深度和黏膜厚度(绒毛高度+隐窝深度)。
1.3.3 空肠和回肠组织氧化还原水平测定空肠和回肠中总谷胱甘肽(GSHt)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量根据试剂盒(Bio-Rad公司)说明,采用比色法,通过96孔板读板分光光度计(Fisher公司)进行测定。小肠还原型谷胱甘肽(GSH)含量通过以下公式计算获得:
小肠总抗氧化能力根据试剂盒(TA02,Oxford公司)说明,采用比色法,通过96孔板读板分光光度计进行测定。
1.4 统计分析采用SAS 13.0软件中one-way ANOVA进行t检验分析。试验数据以平均值±标准误或混合平均标准误表示。P < 0.05视为差异显著。
2 结果 2.1 早期断奶对仔猪小肠黏膜发育的影响由表 2和表 3可知,与哺乳仔猪相比,断奶仔猪的空肠和回肠绒毛高度分别显著降低了55%和47%(P < 0.05);同时隐窝深度分别显著增加了146%和99%(P < 0.05);另外,断奶仔猪空肠和回肠的黏膜厚度,相对于哺乳仔猪,亦分别显著减少了13%和14%(P < 0.05);而无论是空肠还是回肠,断奶仔猪平滑肌厚度与哺乳仔猪相比均无显著变化(P>0.05)。
采用Western blot分析方法,成功地从仔猪小肠组织匀浆、细胞内质和细胞顶膜中检测到xCT蛋白,并分析其含量。结果在小肠组织匀浆、细胞内质和细胞顶膜中检测到的xCT蛋白分子质量均为40 ku。仔猪小肠xCT蛋白表达量差异结果如图 1和图 2所示。与哺乳仔猪相比,断奶仔猪空肠组织匀浆、细胞内质和细胞顶膜中xCT蛋白表达量分别显著提高了11%、20%和20%(P < 0.05,图 1);断奶仔猪回肠组织匀浆、细胞内质和细胞顶膜中xCT蛋白表达量分别显著提高了11%、17%和22%(P < 0.05,图 2)。
由表 4可知,断奶仔猪空肠中xCT mRNA表达量较哺乳仔猪显著提高了99%(P < 0.05);断奶仔猪回肠中xCT mRNA表达量较哺乳仔猪显著提高了82%(P < 0.05)。
断奶仔猪与哺乳仔猪小肠xCT蛋白表达量与mRNA表达量之间的皮尔森相关分析结果如表 5所示。断奶仔猪与哺乳仔猪空肠和回肠组织匀浆、细胞内质、细胞顶膜的xCT蛋白表达量与其对应肠段中xCT mRNA表达量之间均呈正向线性关系(P < 0.05);空肠和回肠组织匀浆、细胞内质和细胞顶膜中xCT蛋白表达量之间也呈正向线性关系,且差异显著(P < 0.05)。
如图 3所示,在空肠组织匀浆、细胞内质和细胞顶膜中分别检测到分子质量为57 ku的ASCT2蛋白,与哺乳仔猪相比较,ASCT2蛋白在断奶仔猪空肠组织匀浆、细胞内质和细胞顶膜中的表达量分别显著提高了25%、26%和35%(P < 0.05)。如图 4所示,在回肠组织匀浆、细胞内质和细胞顶膜中也检测到分子质量为57 ku的ASCT2蛋白,与哺乳仔猪相比较,在断奶仔猪回肠组织匀浆和细胞顶膜中ASCT2蛋白表达量分别显著提高了50%和33%(P < 0.05),但在回肠细胞内质中ASCT2蛋白表达量没有显著变化(P>0.05)。
由表 6可知,断奶仔猪空肠组织中ASCT2 mRNA表达量较哺乳仔猪显著增加了454%(P < 0.05);回肠空肠组织中ASCT2 mRNA表达量较哺乳仔猪显著提高了136%(P < 0.05)。
断奶仔猪与哺乳仔猪小肠ASCT2蛋白表达量与mRNA表达量之间的皮尔森相关分析结果如表 7所示。断奶仔猪与哺乳仔猪空肠和回肠组织匀浆、细胞内质、细胞顶膜的ASCT2蛋白表达量与其对应肠段中ASCT2 mRNA表达量之间均呈正向线性关系(P < 0.05);空肠和回肠组织匀浆、细胞内质和细胞顶膜中ASCT2蛋白表达量之间也呈正向线性关系,且差异显著(P < 0.05)。
哺乳和断奶仔猪空肠中GSHt、GSH、GSSG含量和总抗氧化能力结果见表 8。与哺乳仔猪相比,断奶仔猪空肠GSHt含量差异不显著(P>0.05);空肠GSH含量较哺乳仔猪显著降低了34%(P < 0.05);空肠GSSG含量比哺乳仔猪显著提高了83%(P < 0.05)。与哺乳仔猪相比,断奶仔猪空肠GSH/GSSG显著降低了66%(P < 0.05)。断奶仔猪与哺乳仔猪相比,空肠中总抗氧化能力没有显著变化(P>0.05)。
哺乳和断奶仔猪回肠中GSHt、GSH、GSSG含量和总抗氧化能力结果见表 9。与哺乳仔猪相比较,回肠中GSHt和GSH含量分别显著降低了31%和35%(P < 0.05);但回肠GSSG含量没有统计学差异(P>0.05);回肠中总抗氧化能力显著下降了27%(P < 0.05)。
哺乳动物肠黏膜最重要的作用是在对饲粮营养物质进行必要消化和吸收的同时,对肠内微生物和毒素具有屏障作用[9]。尽管调节仔猪肠道黏膜屏障功能的分子机制还没有完全研究透彻,但是很明显,在饥饿和疾病的状态下,肠道屏障容易受到损坏,导致发病率和死亡率的明显提高[10]。Smith等[11]的研究显示,15~21日龄断奶的仔猪,与23~28日龄断奶的仔猪相比,可以导致仔猪持续的肠道屏障功能性紊乱。在本研究中,10日龄早期断奶仔猪小肠绒毛更短,隐窝深度更深,说明早期断奶严重影响了仔猪肠内营养的吸收和利用。
Xc-系统是非钠依赖的谷氨酸/胱氨酸交换系统,它将谷氨酸和胱氨酸按1 : 1比率通过细胞膜进行交换,将胱氨酸摄取进细胞内,将细胞内多余的谷氨酸置换到细胞外[12]。Xc-系统有重链亚基4F2hc和轻链亚基xCT,其中xCT是Xc-系统中的主要载体,它主要是转运细胞内的谷氨酸和细胞外的胱氨酸[13]。Xc-系统转运在大脑、神经元及突触中研究较多[14-16],而在肠道等非神经器官中研究较少。Burdo等[17]首次从猴子的十二指肠和肾脏中检测到xCT蛋白,且xCT载体位于细胞顶膜上以介导谷氨酸/胱氨酸的转运。Bridges等[18]研究发现,xCT载体在大脑中通过转运谷氨酸/胱氨酸,维持细胞内谷氨酸/胱氨酸的水平,降低氧化应激以维持细胞的健康。McBean[19]研究表明,Xc-介导的谷氨酸转运由氧化应激引起,氧化应激可刺激xCT的转运,提供更多的底物氨基酸来合成谷胱甘肽,抵抗机体内的氧化水平。本研究发现了仔猪小肠中xCT亚基,且断奶时仔猪小肠xCT蛋白表达量显著提高,说明xCT为了降低仔猪小肠的氧化应激水平而提高了表达量,以此增加对小肠中谷氨酸/胱氨酸的转运,与以上其他组织中研究结果一致。
ASCT2是钠离子依赖的转运载体,在谷氨酸和谷氨酰胺的循环中起重要作用。Epler等[20]研究发现,降低上皮细胞外环境的pH可以促进细胞对谷氨酰胺的吸收,将谷氨酰胺吸收入血液,同时伴有ASCT2 mRNA的表达量升高。本试验结果显示,早期断奶提高了ASCT2在小肠组织各部分的蛋白和mRNA表达量。断奶仔猪小肠组织中,影响谷氨酰胺转运的因素有很多种。ASCT2除转运谷氨酰胺以外,还可以转运天冬酰胺、L-半胱氨酸等[21];其中半胱氨酸对谷氨酰胺的转运有竞争抑制作用。本试验断奶仔猪饲粮配方中,半胱氨酸水平恰好符合断奶仔猪(5~10 kg,0.41%)的营养需求,未添加额外的半胱氨酸,半胱氨酸与谷氨酰胺是否竞争ASCT2,尚不明确,仍需进一步研究。
在猪等哺乳动物的乳汁中,含有较高含量的GSH、甘氨酸和谷氨酰胺[22]。大多数哺乳动物中,谷氨酸是肠-肾轴合成内源性GSH的主要底物,这个合成途径弥补了由于断奶造成的GSH严重缺乏的影响。目前认为GSH是体内主要的抗氧化剂[23],阻止活性氧自由基对机体的损伤。氧化应激水平提高时,GSH就会向氧化型谷胱甘肽(GSSG)转变,导致GSSG堆积和许多病理疾病的出现[24]。一般以GSH+2GSSG的含量表示细胞内GSH总量[25],以GSH/GSSG表示细胞氧化还原状态[26]。本试验结果显示,早期断奶使仔猪空肠组织中GSH含量下降,GSSG含量显著提高;但回肠组织中GSSG含量没有显著升高。这说明早期断奶仔猪空肠处于严重的氧化应激状态,而回肠的氧化应激水平降低,可能与肠道位置及机体自身抗氧化应激调节有关,如GSH在防止细胞免受各种过氧化损伤方面具有重要作用,如果谷胱甘肽合成的转运载体含量增多,则合成的谷氨酸/谷氨酰胺增多,则机抗氧化能力提高,氧化水平就会降低。
同时合成GSH、蛋白-S-S-半胱氨酸(PSSC)中,其底物氨基酸的吸收对于GSH与PSSC合成,维持氧化还原状态是十分重要的。本试验中断奶仔猪小肠中胱氨酸/谷氨酸交换器xCT和ASCT2蛋白表达量均显著升高,通过在肠细胞中摄取合成GSH所需的氨基酸,在肠细胞中积累胱氨酸/半胱氨酸,作为抗氧化剂或半胱氨酸用作PSSC形成的来源,起到缓冲氧化应激的作用。
4 结论总的来说,早期断奶使仔猪小肠处于氧化应激状态,试验证实了断奶应激可增强仔猪小肠组织中xCT和ASCT2蛋白及其mRNA表达量,以促进谷氨酸/谷氨酰胺的摄取尤其是半胱氨酸的吸收,降低仔猪小肠的氧化应激水平。
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