动物营养学报    2020, Vol. 32 Issue (7): 3343-3357    PDF    
2种纤维源饲粮细胞壁多糖的化学结构及其在猪消化道降解规律的核磁共振研究
杨亚敏 , 庄苏 , 张志静 , 张子珩 , 刘强     
南京农业大学动物科技学院, 南京 210095
摘要: 采用二维异核单量子相干核磁共振(2D HSQC NMR)技术对由小麦麸和西兰花茎叶粉为单一纤维来源的饲粮以及对应饲粮的猪回肠末端食糜和粪便样品中细胞壁多糖进行定性解析和量化表达,并验证该方法用于饲料细胞壁多糖化学结构解析和定量分析的潜力,为细胞壁相关的饲料营养研究提供新实验技术。经脱脂、去淀粉和去蛋白质处理的饲粮、食糜和粪便样品经球磨处理后,用氘代二甲基亚砜和吡啶混合(DP)溶液(4:1,体积比)溶胀制成胶态样品,在配有5 mm低温探头的600 MHz核磁共振(NMR)谱仪上采集其异核单量子相干(HSQC)图谱,并用Bruker TopSpin 3.6.1软件对多糖异头区的共振信号进行定性和定量分析,同时用气相色谱(GC)法测定样品中非淀粉多糖的糖苷组成和含量。结果表明:参照现有文献数据可对大多数链中和还原端糖苷的共振峰进行准确归属。小麦麸饲粮细胞壁多糖中阿拉伯呋喃糖苷(Araf)种类较多,且多以多糖侧链的形式存在;而西兰花饲粮细胞壁多糖则相对简单,主要以阿拉伯聚糖的形式存在。小麦麸饲粮细胞壁多糖中木吡喃糖苷(Xylp)不带侧链的->4)-β-D-Xylp-(1->相对积分强度显著高于西兰花饲粮细胞壁多糖(P < 0.05);西兰花饲粮细胞壁多糖中半乳糖醛酸吡喃糖苷(GalpA)和糖醛酸苷(UA)相对积分强度显著高于小麦麸饲粮细胞壁多糖(P < 0.05);二者的葡吡喃糖苷(Glcp)相对积分强度均较高,而且均以->4)-β-D-Glcp-(1->为主,但西兰花饲粮细胞壁多糖中->3)-β-D-Glcp-(1->的相对积分强度显著高于小麦麸饲粮细胞壁多糖(P < 0.05)。小麦麸饲粮细胞壁多糖主要在猪大肠内降解,而西兰花饲粮细胞壁多糖在猪回肠末端之前就有明显降解。西兰花饲粮细胞壁多糖中Araf和Galp的降解速度显著快于小麦麸饲粮细胞壁多糖(P < 0.05),但后者的->4)-β-D-Xylp-(1->在猪大肠中的降解速度显著快于前者(P < 0.05),二者的Glcp均不易降解,以侧链形式存在的Araf和有侧链修饰基团的多糖主链(木聚糖和半乳糖醛酸聚糖)在猪消化道中也均不易被降解。饲粮、食糜和粪便样品中大多数糖苷通过核磁共振(NMR)法测得的相对积分强度与通过GC法测得的摩尔百分比变化趋势一致,对于含量较高的糖苷,二者具有显著的回归关系(P < 0.05)。综上,2D HSQC NMR技术在解析细胞壁多糖精细化学结构方面具有独特优势,而且还具有一定的定量分析潜力,但用于饲料营养研究尚需进一步完善。
关键词: 二维异核单量子相干核磁共振    细胞壁多糖        小麦麸    西兰花茎叶粉    
A Study of Chemical Structure of Cell Wall Polysaccharides from Two Fibrous Diets and Their Degradation Rule in Digestive Tract of Pigs Using Nuclear Magnetic Resonance Method
YANG Yamin , ZHUANG Su , ZHANG Zhijing , ZHANG Ziheng , LIU Qiang     
College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: The objective of this study was to evaluate the feasibility of the application of 2 dimensional heteronuclear single quantum coherence nuclear magnetic resonance (2D HSQC NMR) technique in analyzing the cell wall polysaccharides from trial pig diet (using wheat bran or broccoli leaf and stem meal as single fiber source), terminal chyme of ileum and fecal samples both qualitatively and quantitatively, and to verify its potential in analyzing chemical structure and quantitative analysis and to provide new experimental techniques for cell wall related feed nutrition research. After removing lipid, starch and protein, the cell wall polysaccharide extracts of the diet, ileal digesta and fecal samples were ball milled and dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO)-d6/pyridine-d5 (4:1, V/V) to form gel mixture. The HSQC spectra of the gel samples were collected on a 600 MHz nuclear magnetic resonance (NMR) spectrometer equipped with a cryogenically cooled 5-mm TXI gradient probe. The assignment and volume integration of the signals in the anomeric zoon of polysaccharides were performed by using Bruker TopSpin 3.6 with reference to the published data of chemical shift of polysaccharides. The glycosides content and composition of the cell wall polysaccharide extracts were analyzed using gas chromatography (GC) method simultaneously. The results showed that the most of signals in anomeric zoon of spectra could be assigned to corresponding glycoside in polysaccharides referring to the existing references. The arabinfuranoside (Araf) in the cell wall polysaccharide of wheat bran-based diet (WB) were complicated and most of them existed as the form of side chains of polysaccharides. That of broccoli leaf and stem meal-based diet (BR) was relatively simpler and formed arabinan mainly. The relative integral strength of xylopyranoside (Xylp) without side chain ->4)-β-D-Xylp-(1-> in the cell wall polysaccharide of WB was higher significantly than that of BR (P < 0.05). The relative integral strengths of galacturonopyranoside (GalpA) and uronic acids glycoside (UA) in the cell wall polysaccharide of BR were significantly higher than those of WB (P < 0.05). The relative integral strength of glucopyranosides (Glcp) was higher and mainly ->4)-β-D-Glcp-(1-> in the cell wall polysaccharide of WB and BR, but in BR cell wall polysaccharides, the relative integral strength of ->3)-β-D-Glcp-(1-> was significantly higher than that of WB (P < 0.05). The cell wall polysaccharide of WB was mainly degraded in the large intestine of pigs, while that of BR was obviously degraded before entering the terminal ileum. The degrading rates of Araf and Galp in the cell wall polysaccharide of BR was faster than those of WB (P < 0.05), but the ->4)-β-D-Xylp-(1-> in the cell wall polysaccharide of WB was more easily degraded in large intestine of pigs than that of WB (P < 0.05). The Glcp in the two diets were the same difficult to degrade. It also demonstrated that Araf presented as side chain and the main chain of xylan and galacturonan with side chains were harder to be degraded in pig digestive tract. The relative integral strength of glycosides measured by the NMR method shared the same trend from diets, chyme to fecal samples with their molar percentages determined by GC method. There were significant regressive relationships between above two methods in glycosides with high content (P < 0.05). It can be concluded that the 2D HSQC NMR technique illustrated an obvious advantage not only in resolving the detail structures of cell wall polysaccharides but also possess high potential in quantitative analysis. The 2D HSQC NMR method using feed nutrition research still need to be further improved.
Key words: 2D HSQC NMR    cell-wall polysaccharides    pig    wheat bran    broccoli leaf and stem meal    

饲料90%以上源于植物,细胞壁是所有植物细胞的共有结构,其中多糖占细胞壁干重的70%~90%[1]。细胞壁多糖不易被动物自身酶系统消化,但又可部分被消化道微生物降解,发挥多种营养生理活性,是动物营养与饲料学科研究长期的关注点。众所周知,多糖的生物可利用性与其糖苷组成和连接方式密切相关[2-3]。因此,探明多糖结构是研究其生理活性的前提。然而,目前普遍采用的粗纤维(crude fiber)、洗涤纤维(detergent fiber)和饲粮纤维(dietary fiber)等只能对细胞壁多糖定量,不能提供其结构信息,限制了相关研究的深入。

二维异核单量子相干核磁共振(2 dimensional heteronuclear single quantum coherence nuclear magnetic resonance, 2D HSQC NMR)已被公认为是一种快速可重复分析多糖结构的方法[4]。Kim等[5]用氘代二甲基亚砜和吡啶混合(DMSO-d6/pyridine-d5, DP)溶液溶胀完整细胞壁制成胶态样品,进行2D HSQC NMR分析,获得了玉米叶等多种植物组织的木质素单元和多糖组成、连接方式和连接位点等丰富的结构信息。该法省去以往细胞壁结构分析过程中的组分分离、提纯和衍生步骤,避免了酸碱处理对部分组分结构的破坏,可获得细胞壁全部组分的完整结构信息。目前核磁共振(NMR)法已被广泛用于生物质能源利用[6-8]、植物细胞壁构效关系[9-10]和食品多糖结构分析[11]等研究领域,但在动物营养学科中的应用尚未见报道。

本试验拟尝试采用2D HSQC NMR技术比较以小麦麸和西兰花茎叶粉为单一纤维来源的饲粮及其在猪回肠末端和全消化道消化剩余物中细胞壁多糖的组成和结构变化,揭示多糖的糖苷组成、连接方式和糖苷键类型与其体内消化率之间的关系,同时尝试对各种结构类型的糖苷进行定量分析并与气相色谱(GC)法比较,探讨2D HSQC NMR技术用于饲料多糖定量分析的可行性,以期为饲料营养价值评价和活性多糖的构效关系等相关研究提供新方法。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验所用小麦麸饲粮(wheat bran-based diet, WB)和西兰花饲粮(broccoli leaf and stem meal-based diet, BR)及其对应的回肠食糜和粪便样品各设4个重复,均取自本实验室进行的动物试验,其中WB和BR分别以小麦麸和西兰花茎叶粉为唯一植物纤维来源配制而成,其饲料原料组成、动物试验安排和样品采集过程详见高月琴等[12]的报道。

1.2 核磁样品制备

称取饲粮、回肠末端食糜和粪便样品各1.0 g,分别用10 mL石油醚超声波脱脂3次,50 ℃减压干燥。再用15 mL 80%乙醇、15 mL丙酮超声处理2次,4 000 r/min离心10 min,除去其中的可溶性寡糖。经特异耐高温淀粉酶(Sigma, A3403)、葡糖苷淀粉酶(Megazyme, E-AMGDF)和蛋白酶(Sigma-Aldrich, P3910)水解,除去其中的淀粉和蛋白质,收集细胞壁组分以球磨处理(南京大学仪器厂ND7-2L)。西兰花类样品按每8 min间歇2 min,共198 min设定;小麦麸类样品按每6 min间歇2 min,共248 min设定。转速均为正反转切换280 r/min。称取30 mg经球磨处理的细胞壁组分放入5 mL带螺盖的玻璃管中,沿管壁缓慢加入750 μL预先混合的DP溶液(4 : 1,体积比),超声水浴处理约5 h直至样品呈均质凝胶态。吸取600 μL凝胶样品并沿核磁管壁缓慢加入核磁管密封保存待用。

1.3 2D HSQC NMR试验条件与结果处理 1.3.1 核磁测试条件

用配备5 mm布鲁克三(TXI)低温探头的Bruker Biospin 600 MHz核磁谱仪,按布鲁克绝热脉冲序列“hsqcetgpsisp 2.2”采集凝胶样品的2D HSQC NMR数据。F2(1H)扫描峰宽12 ppm(-1~11 ppm),2 048个采样点,采样时间142 ms。F1(13C)扫描峰宽220 ppm(-20~200 ppm),256个采样点,采样时间3.86 ms,扫描256次,弛豫延迟500 ms。每个样品总测试时间5~8 h。

1.3.2 图谱处理过程

用Bruker TopSpin 3.6.1软件处理HSQC图谱。窗函数F2(1H)为高斯函数(Gaussian function),线宽(line broadening,LB)-0.2,高斯函数最大值(GM)0.001;F1(13C)为正弦函数(QSINE)。线性插值512点,对原始数据进行傅里叶变换,依次进行自动相位校正、基线校正、以溶剂氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)(δC:40.45 ppm,δH:2.54 ppm)为内标进行化学位移校正、手动标峰和自动积分,在Level=48水平下输出各糖苷的积分强度和HSQC图谱。对所有C1H1区(δC1/δH1:90.0~115.0 ppm/4.0~5.5 ppm)标定的糖苷共振峰积分强度进行归一化整理,具体每种糖苷含量的测定结果表达为相对积分强度(%)。

1.4 GC法测定糖苷含量

饲粮、回肠末端食糜和粪便样品中总非淀粉多糖的糖苷组成和含量采用Knudsen[1]的方法A测定,糖醛酸苷(UA)含量通过比色法测定。测定结果表达为每克干物质中的糖苷的摩尔百分比,其中戊糖苷、己糖苷和UA的摩尔质量分别按132.1、162.2和176.1计。

1.5 数据统计与分析

采用SPSS 20软件中的单因素方差分析(one-way ANOVA)程序比较糖苷相对强度均值,用Duncan氏多重比较法分别进行组内和组间差异检验,用配对t检验对2种糖苷的定量结果进行差异检验,用通用线性模型进行回归分析。P<0.05为差异显著。结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析 2.1 HSQC图谱异头区(C1H1区)中不同类型糖苷的归属

理论上,对于由同一种单糖经相同糖苷键连接而成的多糖链,其糖苷在HSQC图谱异头区中应该可以区分出还原性末端、链中和非还原性末端3类共振峰。对于单糖组成复杂、连接方式和位置多样的全细胞壁多糖而言,其异头区共振峰个数众多,难免有重叠,不易区分归属。参考现有文献和本实验室采集的部分模型寡糖异头区的化学位移数据(δC1、δH1),对小麦麸饲粮(图 1-a)和西兰花饲粮(图 2-a)细胞壁多糖HSQC图谱异头区中共振峰进行了尝试性归属分析。

WB:小麦麸饲粮;WB-L:饲喂小麦麸饲粮猪的回肠末端食糜;WB-F:饲喂小麦麸饲粮猪的粪便。 WB: wheat bran-based diet; WB-L: chyme at ileal terminal collected from pigs fed WB; WB-F: feces collected from pigs fed WB. 图 1 DP溶剂体系中小麦麸饲粮、回肠末端食糜及粪便样品细胞壁多糖的HSQC图谱异头区 Fig. 1 Anomeric region of HSQC spectra of cell wall polysaccharides from wheat bran-based diet, ileum digesta and feces samples in DP solvent system
BR:西兰花饲粮;BR-L:饲喂西兰花饲粮猪的回肠末端食糜;BR-F:饲喂西兰花饲粮猪的粪便。 BR: broccoli leaf and stem meal-based diet; BR-L: chyme at ileal terminal collected from pigs fed BR; BR-F: feces collected from pigs fed BR. 图 2 DP溶剂体系中西兰花饲粮、回肠末端食糜及粪便样品的细胞壁多糖的HSQC图谱异头区 Fig. 2 Anomeric region of HSQC spectra of cell wall polysaccharides from broccoli leave and stem-based diets, ileum digesta and feces samples in DP solvent system

总体而言,还原性末端糖苷的C1未成糖苷键,所处的局部化学环境与其他糖苷的C1有明显差异,因此其异头区共振峰远离其他糖苷,且分为α和β 2组,易于辨识。对于多糖而言,链中糖苷的数量远大于末端糖苷,其异头区共振信号强,峰大而突出,也较容易归属。相比之下,非还原端和链中糖苷的异头区共振峰化学位移大多非常接近,因此其异头区共振峰极易被信号强度大的链中糖苷所掩盖,不易区分。和木吡喃糖苷(Xylp)相比,阿拉伯呋喃糖苷(Araf)虽然同是戊糖苷,但由于构型差异(前者为六元环,后者为五元环),使得Araf异头区的化学位移与Xylp以及其他吡喃型己糖差异较大,图谱明显分离,也易识别。

根据文献[13-29],对小麦麸饲粮和西兰花饲粮中细胞壁多糖异头区中糖苷进行了归属,详见表 1

表 1 HSQC图谱异头区(C1H1区)中糖苷的归属及其依据 Table 1 Assignment of glycosides in anomeric zone (C1H1 zone) of HSQC spectra and its basis  
2.1.1 小麦麸饲粮细胞壁多糖HSQC图谱异头区中糖苷归属

Araf 7种,其中链中糖苷2种,分别为->5)-α-L-Araf-(1->(无修饰基团,δC1H1=108.72/4.95 ppm)和->5)-2-Ac-3-Araf-α-L-Araf-(1->(O2乙酰化,O3带Araf侧链,δC1H1=106.60/5.44 ppm);侧链糖苷4种,分别为α-L-Araf-(1->2(与O2连接,δC1H1=109.45/5.17 ppm)、α-L-Araf-(1->3(与O3连接,δC1H1=107.50/5.16 ppm)、5-FA-α-L-Araf-(1->3(与O3连接且自身O5连有阿魏酸,δC1H1=108.38/5.39 ppm)和5-FA-2-Xyl-α-L-Araf-(1->3(与O3连接且自身O5连有阿魏酸,O2连有β-Xylp,δC1H1=107.78/ 5.60 ppm);还有1种β构型的还原端糖苷->5)-α-L-Araf (β)(δC1H1=103.46/5.32 ppm)。

Xylp 7种,其中还原端糖苷2种,分别为->4)-D-Xylp (α)(δC1H1=92.99/5.08 ppm)和->4)-D-Xylp (β)(δC1H1=98.15/4.43 ppm);链中糖苷4种,分别为->4)-β-D-Xylp-(1->(δC1H1=102.34/4.37 ppm)、->4)-2-Ac-β-D-Xylp-(1->(O2乙酰化,δC1H1=100.01/4.54 ppm)、->4)-2, 3-Ac-β-D-Xylp-(1->(O2和O3均乙酰化,δC1H1=100.62/4.61 ppm)和->4)-2-GlcpA-3-Ac-β-D-Xylp-(1->[O2带葡糖醛酸吡喃糖苷(GlcpA),O3乙酰化,δC1H1=102.23/4.75 ppm];δC1H1=103.41/5.33 ppm处的共振峰无法根据现有文献归属,本文仅依其13C化学位移将其暂定为带有UA侧链的Xylp,有待进一步验证。

甘露吡喃糖苷(Manp)2种,分别为链中糖苷->4)-β-D-Manp-(1->(δC1H1=101.14/4.68 ppm)、->4)-2, 3-Ac-β-D-Manp-(1->(O2和O3乙酰化,δC1H1=101.33/4.85 ppm)。半乳吡喃糖苷(Galp)也是2种,分别为侧链糖苷α-D-Galp-(1->6(δC1H1=99.81/4.93 ppm)和链中糖苷->4)-β-D-Galp-(1->(δC1H1=106.14/4.43 ppm)。δC1H1=102.45/4.90 ppm和δC1H1=100.15/4.45 ppm的2个共振峰因信号相对较弱,且与临近信号重叠,依各种糖苷2D HSQC化学位移变化规律分别暂定为Manp?和Galp (β)?,具体结构待定。

葡吡喃糖苷(Glcp)5种,分别为还原端糖苷->4)-D-Glcp (α)(δC1H1=92.52/5.23 ppm)和->4)-D-Glcp (β)(δC1H1=97.33/4.53 ppm),链中糖苷->4)-β-D-Glcp-(1->(δC1H1=103.18/4.57 ppm)和->3)-β-D-Glcp-(1->(δC1H1=104.60/4.62 ppm)以及非还原端糖苷β-D-Glcp-(1->4 (δC1H1=104.23/4.31 ppm)。

GlcpA 2种,均为非还原端或侧链糖苷,分别为4-OMe-α-D-GlcpA-(1->(δC1H1=98.28/5.30 ppm)和2-OMe-α-D-GlcpA-(1->(δC1H1=98.15/5.39 ppm)。

半乳糖醛酸吡喃糖苷(GalpA)3种,分别为侧链糖苷α-D-GalpA-(1->(δC1H1=99.09/5.00 ppm)以及链中糖苷->4)-2, 3-Ac-α-D-GalpA-(1->(δC1H1=100.27/5.07 ppm)和->4)-6-OMe-α-D-GalpA-(1->(δC1H1=99.72/4.80 ppm)。

此外,在小麦麸饲粮细胞壁多糖中还归属到1种岩藻吡喃糖苷(Fucp),即α-L-Fucp-(1->2(δC1H1=100.92/5.23 ppm),位于非还原端或侧链。

2.1.2 西兰花饲粮细胞壁多糖HSQC图谱异头区中糖苷的归属

在西兰花饲粮细胞壁多糖HSQC图谱异头区中归属出的Araf、Xylp、Manp、Galp、Glcp、GlcpA和GalpA分别有5、5、2、3、4、2和5种,其中O2带侧链的链中糖苷->2, 5)-α-L-Araf-(1->(δC1H1=107.90/5.16 ppm)、位于还原端的->4)-D-Manp(α)(δC1H1=94.48/5.11 ppm)、位于侧链或非还原端的β-D-Galp-(1->4(δC1H1=105.97/4.50 ppm)、O4甲基化α-(1->2)连接的->2)-4-OMe-α-D-Glcp-(1->(δC1H1=103.60/4.70 ppm)、GalpA链中糖苷->4)-α-D-GalpA-(1->(δC1H1=98.96/5.03 ppm)和O4甲基化的侧链4-OMe-α-D-GalpA-(1->(δC1H1=100.77/5.01 ppm)以及鼠李吡喃糖苷(Rhap)侧链α-L-Rhap-(1->2(δC1H1=101.00/5.32 ppm)7种糖苷均未在小麦麸饲粮细胞壁多糖中发现,而小麦麸饲粮细胞壁多糖中的α-L-Araf-(1->2、5-FA-2-Xyl-α-L-Araf-(1->3、->5)-2-Ac-3-Araf-α-L-Araf-(1->、->4)-2-GlcA-3-Ac-β-D-Xylp-(1->、UA-Xylp、->4)-2, 3-Ac-β-D-Manp-(1->、Manp?、Galp (β)?、->3)-β-D-Glcp-(1->和->4)-D-Glcp (α)这10种糖苷亦未在西兰花饲粮细胞壁多糖中出现。

2.1.3 2种纤维源饲粮中糖苷的多糖归属

还原性末端糖苷通常是主链末端,而非还原性末端糖苷既可能是主链末端,也可能是单糖苷侧链或侧链末端。从表 2可以清楚地看出小麦麸和西兰花饲粮细胞壁多糖组成的差异。

表 2 HSQC图谱中不同类型糖苷的相对积分强度 Table 2 Relative integral strength of different types of glycosides in HSQC spectra (n=4)  

Araf是植物细胞壁多糖中分布最广,存在形式最多的糖苷,既能形成阿拉伯聚糖主链,又能以侧链的形式与阿拉伯聚糖、木聚糖、半乳聚糖或半乳糖醛酸聚糖连接。小麦麸饲粮细胞壁多糖中非还原端或侧链糖苷α-L-Araf-(1->2、α-L-Araf-(1->3、5-FA-α-L-Araf-(1->3和5-FA-2-Xyl-α-L-Araf-(1->3约占总糖苷的18.74%,而2种链中糖苷->5)-α-L-Araf-(1->和->5)-2-Ac-3-Araf-α-L-Araf-(1->仅占3.26%,说明小麦麸饲粮细胞壁多糖中Araf主要作为侧链与木聚糖或半乳聚糖连接形成阿拉伯木聚糖或阿拉伯半乳聚糖,以阿拉伯聚糖的形式存在的较少。而西兰花饲粮细胞壁多糖中2种Araf侧链糖苷和2种链中糖苷相对积分强度分别约为6.58%和14.63%,说明其Araf主要以阿拉伯聚糖的形式存在。同时,小麦麸饲粮细胞壁多糖中与阿魏酸连接的Araf[5-FA-α-L-Araf-(1->3和5-FA-2-Xyl-α-L-Araf-(1->3]的相对积分强度为9.19%,而西兰花饲粮细胞壁多糖中未归属到同类糖苷,说明其木质纤维化程度比小麦麸饲粮细胞壁多糖低,这可能是西兰花饲粮细胞壁多糖中Araf在猪消化道内降解速度较快(表 2)的原因之一。

无论小麦麸还是西兰花饲粮细胞壁多糖,其中Xylp均以链中糖苷为主,未归属到以侧链形式存在的Xylp,说明二者的Xlyp主要构成β-(1->4)木聚糖,且木聚糖主链都有一定程度的乙酰化,少有做侧链者,如木葡聚糖中的α-D-Xylp-(1->6[30]。但小麦麸饲粮细胞壁多糖中Xlyp的相对积分强度显著高于西兰花细胞壁多糖(45.47% vs. 9.28%)(P < 0.05),所连接的侧链糖苷种类(O2和/或O3连接的Araf或乙酰基)更多。Glcp与Xylp类似,2种纤维源饲粮细胞壁多糖中均以链中糖苷为主,未见侧链糖苷,表明纤维素是其主要存在形式,以β-(1->3)-(1->4)糖苷键连接的β-葡聚糖[->3)-β-D-Glcp-(1->和->4)-β-D-Glcp-(1->]相对较少。相对小麦麸饲粮细胞壁多糖而言,西兰花饲粮细胞壁多糖中Glcp的相对积分强度更高(23.35% vs 37.92%),二者差异(P < 0.05)。

小麦麸饲粮细胞壁多糖中UA的相对积分强度显著低于西兰花饲粮细胞壁多糖(2.65% vs. 17.44%)(P < 0.05);二者GlcpA的相对积分强度均较低,均为甲基化的非还原端侧链糖苷[4-OMe-α-D-GlcpA-(1->)和(2-OMe-α-D-GlcpA-(1->],说明GlcpA主要作为木聚糖或阿拉伯木聚糖等多糖的修饰基团,本身不构成多聚体;但西兰花饲粮细胞壁多糖中GalpA的相对积分强度显著高于小麦麸细胞壁多糖(P < 0.05),而且以带修饰基团的链中糖苷[->4)-2, 3-Ac-α-D-GalpA-(1->和(->4)-6-OMe-α-D-GalpA-(1->]为主,无修饰的链中糖苷[->4)-α-D-GalpA-(1->]占比较少(10.87% vs. 2.45%),二者共同构成半乳糖醛酸聚糖主链。小麦麸细胞壁多糖中Galp的相对积分强度也显著低于西兰花细胞壁多糖(2.56% vs. 7.07%)(P < 0.05),主要为带有α-D-Galp-(1->6侧链的β-(1->4)半乳聚糖。小麦麸和西兰花饲粮细胞壁多糖中Manp的相对积分强度均较低(2.86% vs. 3.47%),且均属β-(1->4)甘露聚糖,未见以侧链形式存在的Manp。此外,小麦麸和西兰花饲粮细胞壁多糖中均包含少量以侧链形式存在的Fucp。

2.2 各种糖苷2D HSQC信号相对强度及其在猪不同消化道区段的变化

表 2图 1图 2可知,对同一种纤维源而言,其饲粮、回肠食糜和粪便样品中的可辨析C-H共振峰个数(多糖的残基及其连接方式种类)逐渐减少,各个共振峰的相对积分强度变化规律不一,说明不同纤维源饲粮中多糖及其局部结构在消化道内的降解速度存在差异。

在回肠末端之前,猪对于小麦麸饲粮细胞壁多糖的降解并不明显,主要表现为个别侧链或末端糖苷相对积分强度显著下降(P < 0.05),如β-D-Glcp-(1->4、->4)-D-Xlyp (α)和->4)-D-Xlyp (β)。而4-OMe-α-D-GlcpA-(1->、->4)-2, 3-Ac-β-D-Xylp-(1->和->4)-2, 3-Ac-β-D-Manp-(1->相对积分强度显著下降(P < 0.05)可能与其所携带的小分子修饰基团在胃酸性环境下自然解离有关[31],这从对应脱基团糖苷α-D-GalpA-(1->、->4)-β-D-Xylp-(1->和->4)-β-D-Manp-(1->的相对积分强度显著增加(P < 0.05)也可以得到印证。

经猪后肠微生物降解后,粪便中Xylp的相对积分强度显著降低(45.47% vs. 34.66%)(P < 0.05),Araf(22.29% vs. 25.38%)和UA(2.65% vs. 6.10%)的相对积分强度显著升高(P < 0.05),Glcp的相对积分强度也显著升高(P<0.05)。这说明,相对而言,由Xylp构成的多糖降解速度更快,而由Araf和UA构成的多糖降解速度较慢。进一步分析可见,4种链中Xylp中,只有不带修饰基团的->4)-β-D-Xylp-(1->相对积分强度显著下降(29.45% vs. 6.30%)(P<0.05),其他糖苷相对积分强度变化不显著(P>0.05),甚至有所升高,说明修饰基团的存在对木聚糖的降解速度有很大影响。同样的现象也可在半乳糖醛酸聚糖[->4)-6-OMe-α-D-GalpA-(1->]的降解中观测到。影响小麦麸饲粮细胞壁多糖中Araf降解速度的不是以阿拉伯聚糖形式存在的链中糖苷,而是以侧链形式存在的侧链糖苷,尤其是α-L-Araf-(1->2和5-FA-α-L-Araf-(1->3,说明连接在主链糖苷O2的α-L-Araf-(1->2(不一定是阿拉伯聚糖,也可能是木聚糖等其他多糖)比连接在O3的α-L-Araf-(1->3降解得慢;若侧链Araf连有阿魏酸,也会限制Araf及所连多糖的降解。对于Glcp而言,链中糖苷的连接位置[->4)-β-D-Glcp-(1->、->3)-β-D-Glcp-(1->和->2)-4-OMe-Glcp-(1->]对葡聚糖的降解速度影响不大,均比较难降解。另外,连接在小麦麸饲粮细胞壁多糖侧链上的α-L-Fucp-(1->降解速度也较慢。

西兰花饲粮细胞壁多糖在猪消化道中的降解规律与小麦麸饲粮细胞壁多糖明显不同。在回肠末端之前,Araf、UA和Galp的相对积分强度显著下降(P < 0.05),Xylp和Glcp的相对积分强度显著上升(P < 0.05),说明西兰花饲粮细胞壁多糖在小肠中即有较多降解,而且Araf、UA和Galp的降解速度比Xylp和Glcp快。具体而言,Araf无论是链中糖苷还是侧链糖苷,总相对积分强度均显著下降(P < 0.05);而Galp则是链中糖苷的总相对积分强度显著下降(P<0.05),侧链糖苷的总相对积分强度不降反而显著上升(P < 0.05);GalpA中不带修饰基团的链中糖苷->4)-α-D-GalpA-(1->的相对积分强度显著下降(P < 0.05),而带修饰基团的链中糖苷->4)-6-OMe-α-D-GalpA-(1->的相对积分强度显著升高(P < 0.05),再次证明修饰基团对聚糖主链降解的影响。非还原端或侧链糖苷4-OMe-α-D-GalpA-(1->的相对积分强度显著下降(P < 0.05)和α-D-GalpA-(1->的相对积分强度显著升高(P < 0.05),进一步说明猪小肠前段的酸碱环境对糖苷的部分小分子修饰基团具有解离作用。

西兰花饲粮细胞壁多糖中各种糖苷在猪后肠的降解规律与其在回肠末端之前相似。经后肠微生物降解后,Araf、UA和Galp的相对积分强度分别由22.60%、17.44%和7.07%下降到3.86%、8.81%和1.02%,而Xylp和Glcp的相对积分强度则分别由9.28%和37.92%上升到21.63%和61.16%。与小麦麸饲粮细胞壁多糖相同,西兰花饲粮细胞壁多糖中链中Glcp的连接位置对葡聚糖的降解速度影响也不明显;甲基化程度也明显限制了其半乳糖醛酸聚糖[->4)-6-OMe-α-D-GalpA-(1->]的降解速度。但不同的是,链中Xylp是否连有修饰基团对西兰花饲粮细胞壁中木聚糖的降解速度的影响不如小麦麸明显,这可能与Xlyp占其总糖苷相对较小(45.47% vs. 9.28%)(P < 0.05),其他糖苷的快速降解使得剩余糖苷的相对比例大幅升高有关。

2.3 NMR法和GC法对2种纤维源饲粮细胞壁中主要糖苷含量测定的比较

为评价NMR法用于细胞壁多糖定量分析的可行性,本试验比较了2种纤维源饲粮不同消化道区段样品中主要糖苷的摩尔百分比(GC法)与对应糖苷的相对积分强度(NMR法),具体见表 3。总的来说,无论小麦麸还是西兰花饲粮,2种方法所反映的各种糖苷摩尔百分比的变化趋势(饲粮>回肠末端食糜>粪样)是一致的,都能用于描述细胞壁多糖在动物消化道内的降解规律。但是在具体数值上,不同糖苷2种方法的测定值的差异表现不一。含量较低的糖苷(如Manp和Galp等)二者所得摩尔百分比基本一致;含量较高的糖苷(如小麦麸组中的Arap和Xylp,西兰花组的中UA等)则有的差异较大,有的(如Glcp)则接近。从2种方法测定值间的线性关系(表 4)看,对于含量较高的糖苷,二者线性关系均较好(P < 0.05),仅个别含量较少的糖苷(小麦麸组中的Gal和西兰花组中的Man),二者回归关系较低(P>0.05)。

表 3 GC法所得各种糖苷的摩尔百分比及NMR法所得其相对积分强度 Table 3 Molar percentages of different types of glycosides determined by GC method and their relative integral strengths determined by NMR method (n=4)  
表 4 GC法与NMR法糖苷测定结果间的回归关系 Table 4 Regression relationships of results of glycosides determined by NMR and GC methods
3 讨论

多糖的生物可降解性受其糖残基组成与排列方式、糖苷键连接位置、糖苷键类型(α或β)、侧链与修饰基团的数量等多种因素影响。UA中的羧基在中性和碱性条件下容易解离出氢离子,使得多糖带正电荷,更易于溶解和降解,这可能是本试验中西兰花饲粮细胞壁多糖中UA降解速度高于小麦麸细胞壁多糖的主要原因之一。以α构象连接的糖苷O1平伏,易形成螺旋或无定型缠绕结构,此类多糖分子内和分子间氢键在氢离子(H+)、水或二甲基亚砜(DMSO)等极性分子作用下易破坏,因此易溶解和降解(如2种饲粮中的阿拉伯聚糖和半乳糖醛酸聚糖)。以β-1->4方式连接的已糖苷O1直立,位于呋喃环下,易形成刚性线性分子,因此无论小麦麸还是西兰花饲粮中的->4)-β-D-Glcp-(1->、->4)-β-D-Manp-(1->和->4)-β-D-Galp-(1->均不易降解;且Glcp不带侧链,更易与相邻糖链通过分子间氢键聚合形成结晶态,进一步影响了其降解。对于带有侧链的多糖,虽然侧链和修饰基团的存在影响了其与相邻糖链的聚集,溶解性可能增强,如小麦麸饲粮细胞壁多糖中的阿拉伯木聚糖和西兰花细胞壁多糖中的半乳糖醛酸聚糖,但伴随产生的空间位阻也影响了糖苷水解酶与底物的接合,限制了其降解效率。如果经小肠前段酸碱环境或微生物作用去除此类多糖的侧链与修饰基团,则其降解速度明显加快(如表 2中小麦麸组的->4)-β-D-Glcp-(1->和西兰花组的->4)-α-D-GalpA-(1->)。多糖在消化道中的降解主要应归功于消化道微生物。Zhang等[32]的研究表明,猪饲喂添加了复合多糖水解酶的小麦麸饲粮后,回肠食糜和粪便中适宜降解可溶性多糖的拟杆菌门(Bacteroidetes)细菌相对丰度上升,而偏好降解不溶性多糖的厚壁菌门(Firmicutes)细菌相对丰度下降;在猪后肠中,Bacteroidetes细菌通过分泌多种侧链糖苷水解酶和Firmicutes细菌共同实现对不溶性木聚糖和纤维素的降解。可见,微生物对多糖的降解实质是酶降解,多糖侧链的位阻效应依然适用。至于饲粮细胞壁多糖结构与消化道微生物区系变化和代谢之间的内在关系,正如前文所述,由于受多糖结构分析方法的限制,国内外现有研究仅限于对个别纯化多糖或寡糖的体外细菌纯培养或混合培养,可借鉴资料较少,正是今后需要深入探讨的课题。

本试验在量化尝试上,GC法测定的糖苷摩尔百分比和NMR法测得的相对积分强度在具体糖苷上表现不一。2D HSQC NMR技术虽然将共振信号同时沿1H和13C 2个方向展开,极大地提高了图谱的分辨率,并且待测基团共振峰的积分强度与其浓度仍然存在比例关系,被认为是最有潜力的NMR定量技术,但由于HSQC的信号采集经1H→13C→1H极化转移过程,不同基团的局部化学环境差异可能引起响应系数变化,影响定量的准确性[33]。本课题组在研究中发现,在其他测试参数相同的条件下,链中和非还原端糖苷的异头区响应系数相近,但其还原端糖苷的异头区响应系数有较大差异。因此,在今后计算各种糖苷的相对积分强度时,采用不同的响应系数或试验过程中加入外标可能有助于提高定量的准确性[34-35]。本次试验采用的手动积分方法对共振峰边界划分得不准也可能是造成二者差异的原因之一,对结构多样的糖苷尤其明显。如Araf和Xylp的链中和侧链形态众多(表 1),各种结构的共振峰往往部分重叠,在划定积分边界时容易产生误差;而Glcp仅->4)-β-D-Glcp-(1->、->3)-β-D-Glcp-(1->和(β-D-Glcp-(1->4)3种主要糖苷类型,产生积分偏差的几率较小。本课题组正在摸索采用快速最大相似性重构(fast maximum likelihood reconstruction, FMLR)等图谱处理技术,分离重叠的共振峰,降低由此引起的定量偏差[36]。个别共振峰归属不确定也可能引起定量准确性下降。本试验用于HSQC图谱归属的化学位移数据大多源自生物质能源利用相关研究文献[6-8],生物质材料的细胞壁多糖主要由纤维素和木聚糖组成,而常见植物性饲料原料细胞壁多糖中除此之外,还含有大量半纤维素和果胶,糖苷连接方式也更多样。另外,因以DP溶液为溶剂的多糖化学位移数据积累有限,本试验在共振峰归属时,参考了部分多糖在氘水(D2O)溶液中的化学位移数据。虽然本文作者根据文献中提供的信息对所参考的数据统一进行了校正,但不能消除溶剂效应对化学位移的影响,由此可能导致归属的不确定或错误。如表 1中的Manp?、Galp (β)?和UA-Xylp?,其中仅UA-Xylp?的相对积分强度较大(表 2),可能对总体定量准确性产生较大影响,其他不确定糖苷的相对积分强度都很小,误判对总体定量准确性不会带来明显影响。针对常见植物性饲料原料中细胞壁多糖的组成特点,在后续研究中,通过采集具有典型糖苷键结构的多糖或寡糖在DP溶剂体系中的化学位移,完善参考数据库,可进一步提高信号归属的准确性,降低这方面引起的定量误差。

图 1图 2可知,植物来源相同的多糖,其饲粮和消化剩余物中各类糖苷的化学位移均保持一致;植物来源不同的多糖,相同结构的糖苷化学位移也基本相同。该特性既保证了各类糖苷经消化、发酵或加工处理前后的可追踪性,有利于考察饲料多糖数量和种类的变化,又能显示不同饲料多糖的化学结构多样性,丰富对饲料多糖的已有认知。既可用于多糖的定性分析,也可进行定量研究。从前文所述的研究过程可知,胶态2D HSQC NMR测试过程简单,样品制备条件温和,不需要分离提取,而且可以同步获取多种多糖在细胞壁基质中的原始结构,弥补现有纤维分析方法的缺陷。目前国内科研院所和大型企业已普遍配置了高频核磁共振波谱仪,也为该方法的应用提供了物质基础。

4 结论

本试验对小麦麸和西兰花饲粮多糖在DP溶剂体系中的HSQC图谱异头区糖苷进行了定性归属和量化尝试,揭示出2种纤维源饲粮细胞壁多糖在糖苷组成和糖苷键连接方式及其在猪消化道内的相对降解速度方面都存在明显差异,糖苷的组成及其连接位置、链中糖苷所带侧链的种类和数量等对饲料多糖的体内降解难易程度有明显影响。本研究尝试将2D HSQC NMR技术应用于饲料营养研究中,尽管技术本身尚存在诸多不足之处,但也显示了该技术在解析细胞壁多糖精细化学结构方面具有的独特优势,而且还具有一定的定量分析潜力,值得继续开发。由此提供的信息,必将有助于饲料细胞壁多糖构效关系、饲料营养价值评定和饲料资源开发利用等相关研究的进一步深入。

参考文献
[1]
KNUDSEN K E B. Carbohydrate and lignin contents of plant materials used in animal feeding[J]. Animal Feed Science and Technology, 1997, 67(4): 319-338. DOI:10.1016/S0377-8401(97)00009-6
[2]
SUN L W, FENG K, JIANG R, et al. Water-soluble polysaccharide from Bupleurum chinense DC:isolation, structural features and antioxidant activity[J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 79(1): 180-183. DOI:10.1016/j.carbpol.2009.07.044
[3]
TONG H B, LIANG Z Y, WANG G Y. Structural characterization and hypoglycemic activity of a polysaccharide isolated from the fruit of Physalis alkekengi L.[J]. Carbohydrate Polymers, 2008, 71(2): 316-323. DOI:10.1016/j.carbpol.2007.06.001
[4]
CHYLLA R A, VAN ACKER R, KIM H, et al. Plant cell wall profiling by fast maximum likelihood reconstruction (FMLR) and region-of-interest (ROI) segmentation of solution-state 2D 1H-13C NMR spectra[J]. Biotechnology for Biofuels, 2013, 6: 45. DOI:10.1186/1754-6834-6-45
[5]
KIM H, RALPH J. Solution-state 2D NMR of ball-milled plant cell wall gels in DMSO-d6/pyridine-d5[J]. Organic & Biomolecular Chemistry, 2010, 8(3): 576-591.
[6]
SAMUEL R, FOSTON M, JIANG N, et al. Structural changes in switchgrass lignin and hemicelluloses during pretreatments by NMR analysis[J]. Polymer Degradation and Stability, 2011, 96(11): 2002-2009. DOI:10.1016/j.polymdegradstab.2011.08.015
[7]
TERAMURA H, SASAKI K, OSHIMA T, et al. Changes in lignin and polysaccharide components in 13 cultivars of rice straw following dilute acid pretreatment as studied by solution-state 2D 1H-13C NMR[J]. PLoS One, 2015, 10(6): e0128417. DOI:10.1371/journal.pone.0128417
[8]
DEL RÍO J C, RENCORET J, PRINSEN P, et al. Structural characterization of wheat straw lignin as revealed by analytical pyrolysis, 2D-NMR, and reductive cleavage methods[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(23): 5922-5935. DOI:10.1021/jf301002n
[9]
SASSAKI G L, GUERRINI M, SERRATO R V, et al. Monosaccharide composition of glycans based on Q-HSQC NMR[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 104: 34-41. DOI:10.1016/j.carbpol.2013.12.046
[10]
MULLOY B. High-field NMR as a technique for the determination of polysaccharide structures[J]. Molecular Biotechnology, 1997, 6(3): 241-265.
[11]
CHENG H N, NEISS T G. Solution NMR spectroscopy of food polysaccharides[J]. Polymer Reviews, 2012, 52(2): 81-114. DOI:10.1080/15583724.2012.668154
[12]
高月琴, 王伟兰, 张亚伟, 等. 不同来源纤维在生长猪消化道内的食糜理化特性和养分消化率[J]. 南京农业大学学报, 2015, 38(3): 471-477.
[13]
WEFERS D, BUNZEL M. NMR spectroscopic profiling of arabinan and galactan structural elements[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2016, 64(50): 9559-9568. DOI:10.1021/acs.jafc.6b04232
[14]
WEFERS D, TYL C E, BUNZEL M. Novel arabinan and galactan oligosaccharides from dicotyledonous plants[J]. Frontiers in Chemistry, 2014, 2: 100.
[15]
SHAKHMATOV E G, ATUKMAEV K V, MAKAROVA E N. Structural characteristics of pectic polysaccharides and arabinogalactan proteins from Heracleum sosnowskyi Manden[J]. Carbohydrate Polymers, 2016, 136: 1358-1369. DOI:10.1016/j.carbpol.2015.10.041
[16]
CARDOSO S M, SILVA A M S, COIMBRA M A. Structural characterisation of the olive pomace pectic polysaccharide arabinan side chains[J]. Carbohydrate Research, 2002, 337(10): 917-924. DOI:10.1016/S0008-6215(02)00082-4
[17]
SCHENDEL R R, BECKER A, TYL C E, et al. Isolation and characterization of feruloylated arabinoxylan oligosaccharides from the perennial cereal grain intermediate wheat grass (Thinopyrum intermedium)[J]. Carbohydrate Research, 2015, 407: 16-25. DOI:10.1016/j.carres.2015.01.006
[18]
TELEMAN A, TENKANEN M, JACOBS A, et al. Characterization of O-acetyl-(4-O-methylglucurono)xylan isolated from birch and beech[J]. Carbohydrate Research, 2002, 337(4): 373-377. DOI:10.1016/S0008-6215(01)00327-5
[19]
MARQUES G, GUTIÉRREZ A, DEL RÍO J C, et al. Acetylated heteroxylan from Agave sisalana and its behavior in alkaline pulping and TCF/ECF bleaching[J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 81(3): 517-523. DOI:10.1016/j.carbpol.2010.02.043
[20]
KIM H, RALPH J, AKIYAMA T. Solution-state 2D NMR of ball-milled plant cell wall gels in DMSO-d6[J]. Bioenergy Research, 2008, 1(1): 56-66.
[21]
KAN D, FANG J N, DONG T X, et al. Characterization of a rhamnogalacturonan and a xyloglucan from Nerium indicum and their activities on PC12 pheochromocytoma cells[J]. Journal of Natural Products, 2003, 66(1): 7-10.
[22]
TELEMAN A, NORDSTRÖM M, TENKANEN M, et al. Isolation and characterization of O-acetylated glucomannans from aspen and birch wood[J]. Carbohydrate Research, 2003, 338(6): 525-534. DOI:10.1016/S0008-6215(02)00491-3
[23]
CAPEK P, KUBA ČKOVÁ M, ALFÖLDI J, et al. Galactoglucomannan from the secondary cell wall of Picea abies L.Karst[J]. Carbohydrate Research, 2000, 329(3): 635-645. DOI:10.1016/S0008-6215(00)00210-X
[24]
DENTINI M, CAUCCI D, BARBETTA A, et al. C(6)-oxidation and C(5)-epimerization of locust bean galactomannan studied by high field NMR and circular dichroism[J]. Biomacromolecules, 2006, 7(1): 54-63. DOI:10.1021/bm050341a
[25]
TOMATI U, BELARDINELLI M, GALLI E, et al. NMR characterization of the polysaccharidic fraction from Lentinula edodes grown on olive mill waste waters[J]. Carbohydrate Research, 2004, 339(6): 1129-1134. DOI:10.1016/j.carres.2004.02.007
[26]
RENCORET J, GUTIÉRREZ A, NIETO L, et al. Lignin composition and structure in young versus adult Eucalyptus globulus plants[J]. Plant Physiology, 2011, 155(2): 667-682. DOI:10.1104/pp.110.167254
[27]
DINAND E, VIGNON M R. Isolation and NMR characterisation of a (4-O-methyl-D-glucurono)-D-xylan from sugar beet pulp[J]. Carbohydrate Research, 2001, 330(2): 285-288. DOI:10.1016/S0008-6215(00)00273-1
[28]
LAGURI C, SILIPO A, MARTORANA A M, et al. Solid state NMR studies of intact lipopolysaccharide endotoxin[J]. ACS Chemical Biology, 2018, 13(8): 2106-2113. DOI:10.1021/acschembio.8b00271
[29]
RÖNNOLS J, PENDRILL R, FONTANA C, et al. Complete 1H and 13C NMR chemical shift assignments of mono-to tetrasaccharides as basis for NMR chemical shift predictions of oligosaccharides using the computer program CASPER[J]. Carbohydrate Research, 2013, 380: 156-166. DOI:10.1016/j.carres.2013.06.026
[30]
GORSHKOVA T A, KOZLOVA L V, MIKSHINA P V. Spatial structure of plant cell wall polysaccharides and its functional significance[J]. Biochemistry (Moscow), 2013, 78(7): 836-853. DOI:10.1134/S0006297913070146
[31]
MORRIS E R.Physical properties of dietary fibre in relation to biological function[M]//SOUTHGATE D A T, WALDRON K, JOHNSON I T, et al.Dietary fibre.London: Woodhead Publishing Limited, 2005: 91-102.
[32]
ZHANG Y J, LIU Q, ZHANG W M, et al. Gastrointestinal microbial diversity and short-chain fatty acid production in pigs fed different fibrous diets with or without cell wall-degrading enzyme supplementation[J]. Livestock Science, 2018, 207: 105-116. DOI:10.1016/j.livsci.2017.11.017
[33]
FOSTON M, SAMUEL R, HE J, et al. A review of whole cell wall NMR by the direct-dissolution of biomass[J]. Green Chemistry, 2016, 18(3): 609-621.
[34]
OKAMURA H, NISHIMURA H, NAGATA T, et al. Accurate and molecular-size-tolerant NMR quantitation of diverse components in solution[J]. Scientific Reports, 2016, 6: 21742. DOI:10.1038/srep21742
[35]
MARTINEAU E, EL KHANTACHE K, PUPIER M, et al. Non-linear effects in quantitative 2D NMR of polysaccharides:pitfalls and how to avoid them[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2015, 108: 78-85. DOI:10.1016/j.jpba.2015.01.056
[36]
CHYLLA R A, HU K F, ELLINGER J J, et al. Deconvolution of two-dimensional NMR spectra by fast maximum likelihood reconstruction:application to quantitative metabolomics[J]. Analytical Chemistry, 2011, 83(12): 4871-4880. DOI:10.1021/ac200536b