断奶是仔猪生产过程中的重要阶段，也是仔猪遭受母子分离、饲粮类型改变、被动免疫中断等应激的关键时期。断奶常常导致仔猪肠道屏障功能障碍、氧化应激等综合征，进而降低仔猪的生长性能，提高仔猪的死亡率，因此提高仔猪断奶期的生长性能和改善其肠道健康是养猪行业发展的重中之重^[1]。抗生素在饲粮中的使用为解决这一问题发挥了积极作用。但随着我国促生长类饲料抗生素的全面禁止使用，找寻替代方案成为了当前生猪生产和研究中亟待解决的焦点问题。白术和茯苓是药食同源的中药，常用于治疗人肠道疾病，张仲景在《伤寒杂病论》中提出的白术茯苓汤(由15 g白术和15 g茯苓组成)即为一例中草药经典复方^[2]。近年来，将白术和茯苓多糖应用于畜禽的研究也常有报道。研究表明，0.5%白术多糖可以显著提高28日龄断奶仔猪的平均日增重和饲料转化率^[3-4]。中药多糖还可以提高机体的免疫力。将不同剂量的茯苓多糖饲喂小鼠后，血清免疫球蛋白(Ig)A、IgG和IgM的合成量获得显著提高，且其合成量与茯苓多糖剂量呈正相关^[5]。刘兴隆等^[6]考察了白术茯苓等比配伍不同剂量组对脾气虚克罗恩病(慢性非特异性炎症肠道病)大鼠肠“神经-免疫”相关递质及Th1/Th2型细胞因子的影响，结果显示，相比于血清白细胞介素(IL)-1、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量升高的模型组，中剂量组大鼠血清IL-1、IL-6和TNF-α含量显著降低，而IL-10含量显著提高。关于单一中药多糖的复合配伍研究已有较多报道，其中白术、茯苓配伍比例以1:1、1:2和2:1最为常见^[7]。但是，白术多糖和茯苓多糖(尤其是两者复配)应用于仔猪研究还鲜有报道。源自《伤寒杂病论》的启示，本文拟开展关于白术多糖和茯苓多糖复方对断奶仔猪生长性能和免疫功能的影响研究，旨在为分析白术茯苓多糖复方对断奶仔猪肠道应激、促生长及免疫水平的调节效果提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

白术多糖和茯苓多糖中多糖的含量均为37.5%，剩余部分为糊精。白术多糖主要由水溶性多糖即葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖等组成，摩尔比为7.7:1.06:2.91:1.66；茯苓多糖主要由水溶性多糖即葡萄糖、半乳糖、甘露糖和木糖等组成，摩尔比为6.12:1.48:1.53:0.85。在加工仔猪饲粮时，白术多糖和茯苓多糖按质量1:1预先混合后再逐级加入到饲粮中。

1.2 试验动物和试验设计

试验选用体重接近、健康状况良好的23日龄“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪150头，采用单因素试验设计，将仔猪随机分为6组，抗生素组(添加硫酸黏杆菌素20 mg/kg+杆菌肽锌40 mg/kg+喹乙醇100 mg/kg)、空白组(既不添加任何抗生素也不添加白术茯苓多糖复方)和白术茯苓多糖复方添加组(分别添加0.02%、0.04%、0.06%和0.08%白术茯苓多糖复方)，每组5个重复，每个重复5头猪。试验期27 d。

1.3 试验饲粮

仔猪饲喂玉米-豆粕型基础饲粮。基础饲粮配方参照NRC(2012)和我国《猪饲养标准》(NY/T 65—2004)配制，其组成及营养水平见表 1。

1.4 饲养管理

试验在江西省某牧业有限公司猪场进行。仔猪饲养于装有高床、漏缝地板、乳头式饮水器的保育舍。试验开始前对猪舍进行彻底清理消毒。试验过程中，每日饲喂4~5次。所有仔猪自由采食和饮水，其他饲养管理措施、免疫处理按猪场常规管理程序进行。

1.5 样品采集 1.5.1 血液样品采集

试验第27天，从每个重复中随机选取1头接近平均体重的仔猪，前腔静脉采血10 mL于真空采血管中，并编号。室温静置1~2 h后，3 000 r/min离心10 min，移取上层血清并分装，血清样于-20 ℃保存待测。

1.5.2 肠道黏膜样品采集

试验结束时，从每个重复中随机选取1头仔猪，肌注4%戊巴比妥钠溶液进行麻醉。待麻醉完全后，颈静脉放血处死，沿腹中线剖开腹腔，用无菌手术剪剪取空肠和回肠中段各约6 cm。用镊子轻轻挤出肠道内容物，并将冷焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水灌入肠腔，小心冲洗肠内容物。沿肠段纵轴剪开肠壁，经干净滤纸吸水后，用载玻片小心刮取小肠黏膜，分装于2 mL无菌冻存管中，编号后立即放入液氮中速冻，最后转入-80 ℃保存备用。

1.6 测定指标及方法 1.6.1 生长性能

观察并记录每天的仔猪数和采食量，淘汰或死亡仔猪及时称重并记录。试验第1、27天清晨以每个重复为单位称重并做记录，仔猪称重前空腹12 h。以每个重复为单位记录饲粮消耗量，并计算平均日增重、平均日采食量、料重比。

1.6.2 腹泻率

试验期间，每天定时观察仔猪腹泻情况并做好详细记录。腹泻率参考Kelly等^[8]的方法进行统计。

1.6.3 血清免疫球蛋白和细胞因子含量

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法进行血清IgA、Toll样受体-4(TLR-4)、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量测定，试剂盒购自于南京建成生物工程研究所。血清IgG、IgM含量用贝克曼AU480全自动生化分析仪进行测定，试剂盒购自于伊普诺康生物技术有限公司。

1.6.4 空肠黏膜细胞因子mRNA相对表达量

根据GenBank提供的猪基因序列，用Primer Express 5.0软件设计TLR-4、TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10的基因特异性扩增引物。引物序列见表 2，引物由上海生物工程有限公司合成。提取空肠黏膜总RNA，以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参，按照PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒说明进行反转录。以反转录产物为模板使用定量PCR仪(伯乐CFX96，美国)进行基因扩增，测定空肠黏膜TLR-4、TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10 mRNA相对表达量。

1.7 数据处理与统计分析

所有数据用Excel 2013简单处理后，采用SPSS 17.0软件中单因素方差分析(one-way ANOVA)模型进行方差分析，用Duncan氏法进行多重比较，各组数据以“平均值±标准误”表示。以P < 0.05为差异显著性判断标准。

2 结果 2.1 白术茯苓多糖复方对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响

由表 3可知，与抗生素组和空白组相比，饲粮中添加白术茯苓多糖复方显著提高了末重和平均日增重(P < 0.05)，其中0.02%、0.04%、0.06%和0.08%白术茯苓多糖复方组的平均日增重比抗生素组分别提高了45.06%、46.46%、51.81%和47.04%，比空白组分别提高了27.86%、29.10%、33.81%和29.61%；与抗生素组相比，饲粮中添加白术茯苓多糖复方均显著降低了料重比(P < 0.05)，其中0.02%、0.04%、0.06%和0.08%白术茯苓多糖复方组的料重比比抗生素组分别降低了25.71%、25.71%、25.24%和18.10%，空白组与抗生素组之间的料重比差异不显著(P>0.05)；空白组仔猪腹泻率显著高于抗生素组和0.06%白术茯苓多糖复方组(P < 0.05)，添加0.06%的白术茯苓多糖复方可以使仔猪腹泻率降至抗生素组水平(P＞0.05)。

2.2 白术茯苓多糖复方对断奶仔猪血清免疫球蛋白含量的影响

由表 4可知，与空白组和抗生素组相比，饲粮添加0.02%、0.04%、0.06%和0.08%白术茯苓多糖复方后，血清IgA和IgM含量无显著变化(P>0.05)。与抗生素组相比，白术茯苓多糖复方组血清IgG含量无显著差异(P>0.05)，但比空白组提高了30%以上。

2.3 白术茯苓多糖复方对断奶仔猪血清细胞因子含量的影响

由表 5可知，与空白组相比，抗生素组及0.02%、0.04%、0.06%、0.08%白术茯苓多糖复方组血清TNF-α和IL-6含量(除0.02%白术茯苓多糖复方组)显著降低(P < 0.05)。0.02%白术茯苓多糖复方组血清TNF-α和IL-6含量显著高于抗生素组(P < 0.05)，但随着白术茯苓多糖复方添加水平的提高，血清TNF-α和IL-6的含量呈先降低后升高的趋势，其中0.04%、0.08%白术茯苓多糖复方组血清TNF-α和IL-6含量达抗生素组水平(P>0.05)，而0.06%白术茯苓多糖复方组血清TNF-α和IL-6含量显著低于抗生素组(P < 0.05)。与空白组相比，抗生素组和0.02%、0.04%、0.06%、0.08%白术茯苓多糖复方组血清IL-10含量均获得显著提高(P < 0.05)。随着白术茯苓多糖复方添加水平的提高，血清IL-10含量均呈先升高后降低的趋势，其中0.02%、0.08%白术茯苓多糖复方组血清IL-10含量与抗生素组差异不显著(P>0.05)，而0.04%、0.06%白术茯苓多糖复方组血清IL-10含量显著高于抗生素组(P < 0.05)。饲粮添加白术茯苓多糖复方后，仔猪血清IL-1β含量呈先降低后升高的趋势，但与空白组和抗生素组的差异均不显著(P>0.05)。

2.4 白术茯苓多糖复方对断奶仔猪空肠黏膜局部免疫的影响

如图 1所示，与空白组相比，饲粮添加0.02%、0.04%、0.06%和0.08%白术茯苓多糖复方显著降低了空肠黏膜TLR-4 mRNA相对表达量(P < 0.05)，且随着白术茯苓多糖复方添加水平的增加而降低。0.02%、0.04%白术茯苓多糖复方组空肠黏膜TLR-4 mRNA相对表达量与抗生素组差异不显著(P>0.05)，但当白术茯苓多糖复方添加水平达到0.06%和0.08%时，空肠黏膜TLR-4 mRNA相对表达量显著低于抗生素组(P < 0.05)。

如图 2所示，与抗生素组和空白组相比，饲粮添加0.04%、0.06%和0.08%白术茯苓多糖复方时，空肠黏膜TNF-α mRNA相对表达量显著降低(P < 0.05)。0.02%白术茯苓多糖复方组空肠黏膜TNF-α mRNA相对表达量与空白组差异不显著(P>0.05)，而0.04%、0.06%和0.08%白术茯苓多糖复方组TNF-α mRNA相对表达量显著低于空白组(P < 0.05)。

如图 3所示，与空白组相比，饲粮添加抗生素和添加0.04%、0.06%、0.08%白术茯苓多糖复方均显著降低了空肠黏膜IL-1β mRNA相对表达量(P < 0.05)。0.04%、0.06%、0.08%白术茯苓多糖复方组之间以及这3组与抗生素组之间IL-1β mRNA相对表达量差异不显著(P>0.05)。

如图 4所示，随着白术茯苓多糖复方添加水平由0.02%逐渐增加到0.08%，空肠黏膜IL-6 mRNA相对表达量呈先降低后升高的趋势。当白术茯苓多糖复方添加水平达到0.06%、0.08%时，空肠黏膜IL-6 mRNA相对表达量显著低于空白组和抗生素组(P < 0.05)，其中0.06%白术茯苓多糖复方组空肠黏膜IL-6 mRNA相对表达量又显著低于0.02%、0.04%、0.08%白术茯苓多糖复方组(P < 0.05)，而0.02%、0.04%、0.08%白术茯苓多糖复方组之间差异不显著(P>0.05)。

如图 5所示，与空白组相比，饲粮使用抗生素后，空肠黏膜IL-10 mRNA相对表达量显著升高(P < 0.05)，而添加0.02%、0.04%、0.06%、0.08%白术茯苓多糖复方后，空肠黏膜IL-10 mRNA相对表达量显著高于空白组和抗生素组(P < 0.05)。随着白术茯苓多糖复方添加水平由0.02%增加到0.08%，空肠黏膜IL-10 mRNA相对表达量呈先升高后降低的趋势，但未达显著差异水平(P>0.05)。

3 讨论 3.1 白术茯苓多糖复方对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响

中草药多糖作为植物多糖家族中的重要一员，因其天然的免疫增强功能和代谢调节功能，使其不仅在人类临床医学上得到广泛应用，而且在畜牧生产上也逐渐受到关注。研究表明，0.4%白术多糖可以促进78日龄育成期海兰灰蛋雏鸡的生长发育^[9]。在28日龄断奶仔猪饲粮中添加0.5%^[4]或0.6%^[10]白术多糖后，与抗生素组相比，仔猪日增重显著提高，料重比显著降低。赵燕飞等^[11]在白术多糖研究中获得了改善断奶仔猪生长性能的结果。本试验采用白术多糖、茯苓多糖两者复配，结果显示其同样能显著提高断奶仔猪的平均日增重并降低仔猪料重比，其中0.06%白术茯苓多糖复方对断奶仔猪的促生长效果最佳。

白术多糖和茯苓多糖在调节肠道功能上发挥着积极作用，这主要归因于其可以保护肠上皮细胞的内质网、微绒毛和线粒体等，能调节肠黏膜修复因子转化生长因子-1β(TGF-1β)和表皮生长因子受体(EGFR)，促进肠黏膜的修复，加快细胞恢复正常代谢的脚步^[12]。医学上的克罗恩病是由遗传及环境因素共同导致的终身性消化道疾病，主要表现为慢性、透壁性炎症，并伴有腹泻和腹痛等症状^[13]。而用白术茯苓汤中剂量能有效减轻脾虚型克罗恩病的炎症反应，以缓解腹泻症状^[7]。尚秋辰^[12]研究发现，白术多糖治疗由大肠杆菌攻毒后导致腹泻的小鼠，结果小鼠腹泻的初期症状得到有效减缓。本试验结果表明，饲粮中不使用抗生素也不添加白术茯苓多糖复方，仔猪腹泻率显著高于抗生素组和0.06%白术茯苓多糖复方组，而0.06%的白术茯苓多糖复方可以使仔猪腹泻率降至抗生素组水平。

3.2 白术茯苓多糖复方对断奶仔猪免疫功能的影响

血清免疫球蛋白水平是反映动物抵抗外界病原菌或病毒侵袭能力的重要指标之一。研究表明，白术多糖可刺激小鼠产生特异性IgG抗体^[14]，并提高大鼠血清IgG和IgA含量^[15]。张志军等^[16]使用茯苓多糖灌喂小鼠1周后，小鼠血清IgG、IgA和IgM含量均获显著提高，且存在剂量效应关系。本研究结果表明，与空白组和抗生素相比，饲粮添加0.02%、0.04%、0.06%和0.08%白术茯苓多糖复方后，仔猪血清IgA和IgM含量差异不显著。尽管统计上差异不显著，但白术茯苓多糖复方使得仔猪血清IgG含量比空白组提高了30%以上。

细胞因子是一类由免疫细胞(T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和单核/巨噬细胞等)分泌的具有调节机体免疫功能的多肽分子。当病原微生物入侵时，机体的免疫系统随即被激活，促使机体分泌细胞因子以清除病原微生物，TNF-α、IL-1、IL-6等促炎细胞因子在此过程中发挥了关键作用^[17]。而IL-10具有抑制TNF-α、IL-1和IL-6分泌的功能，是对机体起保护性抗炎作用的细胞因子之一。白术多糖和茯苓多糖对机体细胞免疫均具有调节作用^[18-19]。本试验中，抗生素组和白术茯苓多糖复方组仔猪血清TNF-α和IL-6含量显著低于空白组，而0.04%、0.06%白术茯苓多糖复方组仔猪血清IL-10含量显著高于空白组和抗生素组，这与石振国等^[20]用茯苓多糖治疗急性胰腺炎SD大鼠时获得有效降低血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量的结果一致，说明适宜添加水平的白术茯苓多糖复方可以有效提高仔猪机体的细胞免疫水平，降低断奶应激带来的仔猪肠道炎症风险。

肠道黏膜的局部免疫主要通过改变细胞因子分泌，参与肠黏膜损伤的修复过程。仔猪早期断奶造成的免疫应激会影响淋巴细胞对促炎性细胞因子(如TNF-α、IL-1β和IL-6)的分泌，从而影响仔猪健康和生长性能。TLR-4是介导炎症反应及先天免疫的主要受体，它与先天性免疫系统关系密切，可通过特异性地识别病原微生物的保守分子序列，迅速激活信号转导途径，诱导炎症反应，促进抗原递呈细胞的活化，启动肠道固有免疫反应^[21]。白术多糖能通过TLR-4/髓样分化蛋白抗原88(MyD88)/核因子-κB抑制物激酶ε-核因子-κB抑制蛋白α(IKKε-IκBα)途径解除环磷酰胺对TLR-4信号通路的负性调节，从而提高免疫功能^[22]。多糖中的葡聚糖，一般有α和β型2种结构。α型葡聚糖由淀粉构成，不具有免疫活性。β型葡聚糖主要由β-1-3D、β-1-4D、β-1-6D等葡聚糖组成，其中β-1-4D葡聚糖单独使用没有免疫活性，只有和其他葡聚糖配合使用才有免疫活性，如木糖、甘露糖等^[23]。白术多糖以β-1-4D葡聚糖为主^[23]，而茯苓多糖中的葡萄糖则以β-1-3D葡聚糖为主^[24]。本试验结果表明，与空白组相比，0.04%、0.06%、0.08%白术茯苓多糖复方显著下调了仔猪空场黏膜TNF-α、IL-1β、TLR-4 mRNA相对表达量，并提高了IL-10 mRNA相对表达量。而0.06%、0.08%白术茯苓多糖复方同时还下调了IL-6 mRNA相对表达量。0.04%、0.06%、0.08%白术茯苓多糖复方获得相当甚至超过抗生素的免疫调节效果。空肠黏膜TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10 mRNA相对表达量的结果与本试验仔猪血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10含量的变化趋势一致。白术茯苓多糖复方之所以能够对仔猪发挥积极的免疫调节作用，可能归因于白术多糖以β-1-4D葡聚糖为主，并辅以茯苓多糖的甘露糖和木糖，这种结合方式也是免疫活性强且最容易被机体吸收的形式。

4 结论

饲粮中添加白术茯苓多糖复方可以提高断奶仔猪的生长性能，缓解腹泻，提高机体免疫水平。在本试验条件下，断奶仔猪饲粮中白术茯苓多糖复方的适宜添加水平为0.06%。