2. 河南省饲草饲料站, 郑州 450008;
3. 延津县农业农村局, 延津 453200;
4. 驻马店市兽药饲料(动物产品)质量检验监测中心, 驻马店 463000;
5. 河南牧业经济学院, 郑州 450046
2. Forage Feeds Service Station of Henan Province, Zhengzhou 450008, China;
3. Yanjin Agricultural and Rural Rureau, Yanjin 453200, China;
4. Zhumadian Veterinary Drug Feed(Animal Products) Quality Inspection and Monitoring Center, Zhumadian 463000, China;
5. Henan University of Animal Husbandry and Economy, Zhengzhou 450046, China
奶牛全混合日粮(total mixed ration，TMR)可对不同阶段牛群提供精粗比例稳定、营养浓度一致的配合日粮，实现了奶牛饲养的自动化、定量化、营养均衡化，克服了传统饲养方法中的精粗分开、营养不均衡、奶牛挑食、难以定量等难题[1-3]。TMR具有提高采食量、配方科学性、安全性、饲料转化率及降低奶牛疾病发生率等优点[4]。奶牛TMR品质的好坏是直接决定反刍动物是否发挥最佳生产性能的关键因素之一[5-6]。评价TMR营养成分含量的指标通常采用传统的湿化学方法进行，由于其分析过程繁琐、测定速度较慢、检测成本高，不能及时指导生产。因此，该方法存在着一定的不足。近红外光谱(near infrared reflectance spectroscopy，NIRS)技术是新发展起来的快速简便、无污染的检测方法[7-9]，在操作过程中不耗费任何化学试剂，可实现奶牛TMR多种营养成分含量的即时监测，及时指导奶牛饲粮配制，提高奶牛饲喂质量，降低养殖成本，是绿色、经济、环保的一种检测分析模式[10]。
目前，何云等[11]将NIRS技术应用于苜蓿干草常规营养成分含量的研究，在干物质(DM)、粗蛋白质(CP)、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量等定性定量研究上已经取得了良好的成果，可用于实际含量的测定。由于仪器使用的不同、应用标准样品的差异、预测未知样品的不同，不能通用在不同的地区[12]。文献报道了国外NIRS技术对TMR快速检测的应用情况，如Ki等[13]应用NIRS技术和化学方法比较了253种TMR的品质，CP、CF、粗灰分(Ash)、ADF、NDF含量的相关度很高；Mentink等[14]应用NIRS技术很好地分析了奶牛TMR中CP、NDF、淀粉(Starch)、NFC及粗脂肪(EE)等成分含量。但鲜有文献报道国内奶牛场TMR模型的研究。因此，本试验主要针对大型奶牛场的TMR，建立NIRS技术测定常规营养成分含量的预测模型，为奶牛TMR常规营养成分含量快速检测提供技术支撑。
1 材料与方法 1.1 样品的采集与制备2016年8月—2019年7月在河南省不同的牧场采集有代表性的青年牛、后备牛、高产牛、中产牛、低产牛、干奶牛等不同饲养阶段的奶牛TMR样品共542份，将其分成定标集(n=481)和验证集(n=61)。采用四分法对每个样品缩分至500 g左右，经烘箱干燥(65 ℃，48 h)后粉碎过40目筛，分别用于近红外光谱扫描和实验室传统湿化学方法分析。
1.2 奶牛TMR常规营养成分含量的测定DM含量参照GB/T 6435—2014方法测定；CP含量参照GB/T 6432—2018方法测定(K1100F全自动凯氏定氮仪)；EE含量参照GB/T 6433—2006方法测定；NDF含量参照GB/T 20806—2006方法测定；ADF含量参照NY/T 1459—2007方法测定；Starch含量参照ZYA-SL-005-2017方法测定(P810全自动旋光仪)；氨基酸(AA)含量参照GB/T 18246—2000方法测定(HITACHI835氨基酸分析仪)。每个试样取2个平行样进行测定，在误差允许范围内取2次平均值为测定值，结果以DM基础计算。
1.3 奶牛TMR的NIRS分析 1.3.1 奶牛TMR的NIRS采集采用美国Unity公司Spectrastar 1400XL-3型NIRS仪在1 400~2 500 nm(波数为7 143~4 000 cm-1)的波长范围内对奶牛TMR样品进行NIRS的采集，其中波长间隔1 nm，光学带宽10 nm，光谱扫描次数为24次。样品扫描前，仪器预热30 min后进行校准。选择适当的样品杯，将制备好的样品装入样品杯，装杯前将样品充分混合，确保均匀。装杯量占杯高的1/2~2/3，约50 g，用杯盖压实样品，确保底部照射光无法穿透样品。将装好样品的样品杯放置适配环上，确保样品杯底部和仪器出光孔镜面清洁，进行扫描测定。光谱采集速率45 degs/s，扫描等待时间设定为30 s，待预测栏内各项指标出现后结束本次测定。每个样品重复装样、扫描3次，以减少装样误差，取3次测定的平均值为本样品测定最终结果。542份奶牛TMR样品的NIRS原始光谱图如图 1所示，奶牛TMR样品的NIRS存在多个吸收峰，为其常规营养成分含量的定量分析提供了丰富的信息。
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图 1 奶牛TMR样品近红外原始光谱图 Fig. 1 Origingal NIRS of total mixed ration samples |
采用浓度梯度法[15]对542份奶牛TMR样品的每个检测指标的化学分析值进行从大到小依次排序，隔9选1，其中481份样品作为校正集，其余的61份样品作为验证集。
1.3.3 奶牛TMR样品NIRS模型的建立和验证利用Ucal化学计量学软件把样本光谱与实验室化学分析值进行关联分析，采用偏最小二乘法(partial least squares, PLS)建立定标模型。在采集样品光谱的过程中，由于仪器、样品背景或其他因素的影响，NIRS分析中可能会出现图谱的偏移或漂移现象，如不进行处理同样影响定标模型的质量和预测精度。而基线校正最常用的解决办法是对光谱进行导数处理，一阶导数主要解决基线偏移，二阶导数则解决基线漂移。另外，样本粒度大小分布不均匀导致同样的样本多次测量的光谱也会出现差异，即为光散射影响。采用标准正态变换既可消除光散射影响，又可解决基线漂移问题。因此，在建模过程中，首先通过光谱散射校正和导数处理相结合的方法对原始光谱预处理以选出最优模型，其中光谱散射校正方式包括4种：标准正态变量校正(standard normal variate transformation, SNV)、去趋势校正(Detrend)、标准正态变量校正结合去趋势校正(SNV+Detrend)和无散射(None)，导数处理方式包括10种：1, 4, 4, 1、2, 4, 4, 1、1, 8, 8, 1、2, 8, 8, 1、1, 10, 10, 1、2, 10, 10, 1、1, 12, 12, 1、2, 12, 12, 1、1, 16, 16, 1和2, 16, 16, 1。在定标过程中，通过全局距离(GH≥3)和“T”检验(T＞2.5)剔除异常数值。模型建立后，通过定标决定系数(coefficient of determination for calibration，Rcal2)、交互验证决定系数(coefficient of determination for cross-validation，1-VR)、定标标准偏差(standard error of calibration，SEC)、交互验证标准误差(standard error of cross-validation，SECV)的高低选择最优定标模型[16-17]，计算公式参考文献[18]。其中Rcal2、1-VR越接近1，代表模型的预测能力越强，SEC、SECV越小，代表模型预测误差越小，定标效果越好[19-20]。
最优定标模型确定后，通过预测决定系数(coefficient of determination for validation, RSQV)和预测相对分析误差(ratio of performance to deviation for validation，RPDV)(RPDV=SD/SEP)对最优定标模型进一步评价，RSQV越接近1，表明模型的预测性越好。一般认为若RSQv＞0.80时，说明定标效果良好，模型可用于实际预测。若0.66≤RSQv≤0.80时，说明定标模型可达到粗估的效果，但预测精度需要进一步提高。若RSQv＜0.66时，说明模型难以用于NIRS的定量分析[18, 21-23]。
2 结果和分析 2.1 奶牛TMR常规营养成分含量化学分析结果奶牛TMR校正集和验证集DM、CP、EE、Starch、NDF、ADF和total AA 7个指标的含量分布及分集情况见表 1。DM、CP、EE、Starch、NDF、ADF和total AA 7个指标含量范围相对较宽，且最大值、最小值、平均值和标准差都比较接近，说明样品具有良好的代表性。同时验证集的最大值和最小值均在校正集的范围内，能够满足模型建立的需求。
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表 1 奶牛TMR校正集和验证集常规营养成分含量(干物质基础) Table 1 Routine nutritional component contents of calibration and validation set of TMR of dairy cattle (DM basis) |
利用Ucal分析软件分别对DM、CP、EE、Starch、NDF、ADF和total AA 7个指标含量进行优化，最终的优化参数及定标结果见表 2。7个指标中除了EE、Starch含量外，其他5个指标的Rcal2和1-VR都相对较高，均在0.83以上。其中，CP含量的光谱预处理参数为Detrend和2, 10, 10, 1时的Rcal2和1-VR最高，SEC和SECV相对较低；其次分别为ADF、total AA、DM、NDF含量，当光谱预处理方式为Detrend+SNV和1, 4, 4, 1、SNV和1, 8, 8, 1、SNV和2, 12, 12, 1、Detrend+SNV和2, 12, 12, 1时，Rcal2和1-VR分别为0.898和0.812、0.891和0.873、0.881和0.857、0.834和0.723，SEC和SECV分别为1.56和2.04、0.664和0.70、1.612和1.724、2.85和3.44；当光谱预处理方式为SNV和1, 4, 4, 1时，EE含量的Rcal2和1-VR相对较低；当光谱预处理方式分别为SNV和2, 8, 8, 1时，Starch含量的Rcal2和1-VR相对较低，SEC和SECV相对较高。
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表 2 奶牛TMR定标结果 Table 2 Calibration results of TMR of dairy cattle |
奶牛TMR预测模型建立后，用各指标的重复数分别为61份样品的验证集对其最优定标模型进行外部验证，NIRS预测值与传统湿化学方法所测得的结果进行比较分析，预测结果见表 3。DM、CP、EE、Starch、NDF、ADF、total AA 7个指标含量的化学分析值与NIRS预测值差异不显著(P>0.05)；7个指标中除了EE、Starch含量外，其他5个指标DM、CP、NDF、ADF、total AA含量的RSQV均大于0.80，外部验证RPDV均大于2.50，结果显示DM、CP、NDF、ADF、total AA 5个指标含量的定标模型可以用于实际检测，EE含量的定标模型仅能用于样品粗略的预测，不能预测Starch含量。TMR的7个常规营养成分含量的实测值和预测值的相关关系如图 2所示，其中横坐标代表传统湿化学法的实测值，纵坐标代表NIRS模型预测值。
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表 3 TMR常规营养成分含量的预测结果 Table 3 Prediction results of routine nutritional component contents of TMR |
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图 2 DM、CP、EE、Starch、NDF、ADF含量和AA总量预测值与实测值的相关性 Fig. 2 Correlation between predicted value and measured value of DM, CP, EE, Starch, NDF, ADF and total AA contents |
本试验对河南省奶牛TMR的营养成分含量进行了快速分析预测模型的可行性研究，试验结果表明，奶牛TMR的DM、CP、NDF、ADF、total AA含量的实验室化学检测值与NIRS分析值之间的验证相关系数均达到0.84以上，具有良好的预测效果。Garcia-Criado等[24]用NIRS技术分析了不同生长阶段草地植物的CP含量，预测模型的相关系数达到0.9以上。Berardo等[25]采用偏最小二乘法建立定标模型，成功预测了混合牧草样品中的ADF、CP含量。Ki等[13]应用NIRS技术和化学方法对253种TMR的品质进行了分析评定，其中CP、CF、Ash、ADF、NDF含量的相关度很高，相关系数分别为0.965、0.889、0.894、0.933和0.889；Mentink等[14]应用NIRS技术很好地分析了奶牛TMR中CP、NDF、Starch、NFC及EE等成分含量，本试验ADF、NDF含量的验证相关系数达到0.85以上，这与前人的研究结果相一致，NIRS技术能够准确检测奶牛TMR中DM、CP、NDF、ADF、total AA的含量。而EE含量的RSQV和RPDV分别为0.788、2.192，分别低于0.80和2.50，表明EE含量定标模型仅能用于样品粗略的预测，这可能与EE含量较低，其他成分含量的吸收掩盖了EE的吸收造成的。刘红梅等[26]用NIRS技术分析了稻米直链Starch含量，其预测模型的相关系数达到0.9以上，预测稻米直链Starch含量是可行的。而本研究中奶牛TMR中Starch含量的RSQV和RPDV分别为0.562、1.504，分别低于0.66和2.00，表明Starch含量定标模型不能用于样品的预测，这可能是由于奶牛TMR包括青年牛、后备牛、高产牛、中产牛、低产牛、干奶牛等不同阶段，各TMR组成差别较大，会对模型的准确性起到一定的影响[27-28]。
4 结论本研究利用NIRS技术建立了DM、CP、EE、Starch、NDF、ADF、total AA 7个指标含量的NIRS模型，其中建立的DM、CP、NDF、ADF、total AA含量的NIRS预测模型可达到精准预测的效果，但EE含量的NIRS预测模型只达到粗估效果，仍需沿用传统的实验室化学测定方法对模型进一步优化，而Starch含量预测模型效果不理想，尚不能用于Starch含量的预测。
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