饲料的菌酶协同作用，即在饲料发酵过程中根据发酵基质的特点额外添加蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶等酶制剂，或者在饲料酶解处理工艺中加入一定量的乳酸菌、酵母菌、芽孢菌、霉菌等动物益生菌进行发酵，使菌酶协同发挥作用完成对基质的发酵和酶解^[1]。采用菌酶协同作用处理饲料，可以提高发酵过程中微生物对饲料中大分子物质的利用效率，如纤维素酶分解秸秆中的纤维素和半纤维素生成单糖能为酵母菌合成菌体蛋白提供能量，同时也可以克服单独利用微生物发酵产酶不足的问题，进而提高饲料品质。因此，采用菌酶协同作用对于饲料的资源开发和应用具有重大意义^[1-2]。

1 菌酶协同作用的目的

目前，饲料和饲料原料的菌酶协同作用是对生物发酵饲料或者酶解饲料的必要补充措施，其首要目的是针对发酵和酶解基质的特点组合微生物和酶对其中大分子营养物质进行更充分的发酵和降解，进而提升基质饲料的营养价值，降低基质饲料中的抗营养因子，改善饲料的风味和适口性^[3]。例如，豆粕是一种优质植物蛋白质饲料原料，但是含有多种抗营养因子，限制了其营养价值的发挥，通过添加外源酶和微生物的发酵可以降低抗营养因子含量，提升营养价值^[4]。通过微生物的发酵和外源酶的酶解作用可以使豆粕中的大豆蛋白降解为多种小肽，提高血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)的含量，保证动物的健康^[5]；经过菌酶协同分解，豆粕可以在仔猪饲粮中大量使用而不影响仔猪的日增重，并可提高仔猪的免疫能力，促进小肠上皮细胞的发育^[6]。在肉鸡上，对豆粕进行菌酶协同作用也较单一发酵或酶解的效果要好^[4]。也有报道从营养平衡角度考虑，通过菌酶协同作用发酵单一的廉价蛋白质饲料原料来平衡饲料中的营养成分，尤其是氨基酸的比例^[7-8]。

通过菌酶协同作用增加特定产物的产量，提高基质的特定附加值，是菌酶协同作用的另一个主要目的。例如：以蛋白质饲料为处理基质，通过动物益生菌和蛋白酶的菌酶协同作用分解大分子蛋白质生产各种功能肽^[9-11]。利用β-葡萄糖苷酶和蛋白酶与解淀粉芽孢杆菌在豆粕上的协同处理可显著提高总酚和类黄酮的含量，这些物质与机体抗氧化特性密切相关，经过菌酶协同作用，豆粕新增的部分成分可以在功能性食品上进行应用^[12]。以甜高粱为底物，通过添加胰蛋白酶和有机酸预处理后，再经过嗜热梭状芽孢杆菌进行发酵可获得大量的丁酸^[13]。通过物理化学诱变刺激菌株及蛋白酶的活性使其协同发挥作用可以提高香樟籽油的提取量^[14]。在生物能源领域，以酿酒酵母为发酵剂，对蓖麻籽饼进行发酵，发酵产糖后利用假单胞菌的纤维素酶(CMCase)从蓖麻籽饼中获取生物乙醇^[15]；玉米芯经过水解，全浆进行糖化后，经过大肠杆菌对其进行发酵形成生物乙醇^[16]。

2 菌酶协同作用的基质、菌种和酶

菌酶协同作用的基质主要为饼粕类饲料、纤维类饲料、谷物副产物和动物副产品等。菌酶协同作用所用的菌种均符合我国原农业部《饲料添加剂品种目录》中允许在饲料和养殖动物中使用的微生物品种，主要有乳酸菌类、芽孢杆菌类、酵母类和部分霉菌。菌酶协同作用的酶大部分为水解酶，即特异性针对基质中的某种底物进行分解，也是动物消化这些基质所必需的消化酶。菌酶协同作用的基质及其所用菌种和酶如表 1所示。在对饼粕类饲料的协同处理上，各种菌种都可能被应用，用以改善风味，降低抗营养因子，提高其消化率；但协同的酶以蛋白酶为主，用以分解饼粕类饲料中的大分子蛋白质，提高消化率或者提高特定功能肽的含量。在对纤维类和谷物副产物的协同处理上，所用的菌种以芽孢杆菌、酵母以及霉菌为主，用以破坏纤维结构，释放胞内营养物质，所用的酶以纤维素酶、半纤维素酶等非淀粉多糖(NSP)酶为主，用以分解大分子碳水化合物为单糖，供动物利用或者为协同的微生物提供能源。对于动物副产物，主要利用产蛋白酶的菌种和外源蛋白酶协同处理获得特定功能肽和氨基酸。

3 菌酶协同作用的工艺

目前，饲料菌酶协同作用工艺大部分为一次发酵工艺，即在对饲料进行发酵的过程中将所需的协同酶同时添加。由于基质用量大且作为被处理对象，因此在对饲料进行菌酶协同作用时均采用固态发酵(solid-state fermentation，SSF)的发酵形式。值得探讨的是在使用不同菌种和不同酶进行协同处理时的工艺参数有较大的变化。菌酶协同作用工艺的确定包括对菌酶协同作用发酵方式(厌氧、好氧)的选择，对协同处理温度、处理水分含量、处理的时间、菌的接种量、酶的添加量、协同处理的初始pH等参数的确定。适当的菌酶协同作用参数会对处理效果有较大的提升，为了降低试验设计中试验组的数量同时又能考虑到较多的因素和水平，正交试验设计和响应面法被广泛用于菌酶协同作用的参数优化上^[1]。在工艺参数的确定上，对所用协同菌种和酶的背景研究很关键，对特定条件下效果最佳的菌种和酶应尽可能创造适应其发挥作用的协同反应条件。例如，Wang等^[13]利用嗜热梭状芽孢杆菌与胰蛋白酶在50 ℃下协同处理甜高粱，可获得产量较高的丁酸。

有文献报道了采用二次发酵或两步法协同处理工艺对基质进行协同处理，不管是二次发酵还是两步协同，其原理都是第1步创造适合一类菌和酶的最佳反应条件，第2步创造适合另一类菌和酶的最佳反应条件，通过2个步骤采用2套工艺参数完成对基质更彻底的处理，或者得到更充足的目标产物^[38-39]。而帖余等^[23]在对菜籽粕的协同处理上使用的两步法又有所不同，该研究首先通过创造适合黑曲霉发酵的条件用黑曲霉对菜籽粕进行发酵处理，然后利用发酵过程中黑曲霉所产的内生酶对菜籽粕进行酶解处理，酶解过程温度较发酵高很多(发酵为30 ℃，酶解为45 ℃)，通过两步法使菜籽粕中的硫苷和植酸含量大幅降低，使小肽含量大幅度提高。

与一次发酵工艺比较，两步法协同处理工艺考虑到了不同菌种和酶的生长环境和反应参数，能更好地发挥菌酶协同作用。Bartkiene等^[3]对工业谷类副产品先用酶进行处理，然后利用嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)发酵，发现对谷类副产物进行菌酶协同处理后其微生物组成、生物胺、真菌毒素、乳酸和烷基间苯二酚含量均发生了显著变化。谷物副产品在发酵前经过酶解可在发酵过程中获得更多的乳酸菌。Tie等^[40]建立了一种两步法对菜籽粕进行解毒并提高其蛋白质价值的方法，具体为：在第1阶段，黑曲霉固态发酵产生各种解毒酶和蛋白酶；第2阶段，改变参数采用酶解协同的方法进一步降解菜籽粕中的抗营养因子和大分子蛋白质。结果表明，与单独使用固态发酵法相比，两步法可以更有效地降解菜籽粕中的抗营养因子，提高菜籽粕中蛋白质的含量，从而提高菜籽粕在食品和动物饲料中使用的可能。

对特定的发酵产物而言，两步法协同处理工艺能够获得含量更多、纯度更高的发酵产物。例如，菜籽多酚具有很强的抗氧化及抗诱变、抗癌等生理活性，因此具有重要的医药和营养价值。Odinot等^[41]利用黑曲霉和担子菌及所产的酶协同发酵，通过2个步骤将菜籽粕中天然存在的芥酸转化为菜籽多酚：第1步，通过优化菌和酯酶反应参数将芥子酸分解为芥子酸衍生物(芥子酸胆碱等)；第2步，改变反应参数，通过非氧化脱羧途径将芥子酸转化为菜籽多酚。聚羟基丁酸酯(poly-3-hydroxybutyrate, PHB)是一类由微生物发酵产生的热塑性生物降解材料，很容易降解，在环保包装领域有广泛前景。Schwarz等^[42]以青贮饲料为原料，以富养罗尔斯通菌(Cupriavidus necator)DSM为发酵菌种，采用两步法协同处理工艺合成了PHB。

但两步法协同处理的发酵工艺复杂，参数变化差异大，对生产设备和加工工艺提出了极高的要求。一次发酵工艺相对简单很多，对饲料领域更具有实用性。只要充分研究菌和酶的生活背景和反应条件，在尽量满足这些条件后，也会取得较好的发酵效果。

4 菌酶协同作用效果的评价

目前，对饲料菌酶协同作用效果的评价方式大致可以分为协同处理效果评价和应用效果评价。协同处理效果评价一般可概括为对发酵指标的评价和测定，以及所用协同酶的特异性产物的测定。以乳酸菌为主的协同处理其发酵指标的评定主要包括基质pH、基质中协同菌种的活菌数量以及总滴定酸度(total titratable acidity，TTA)^{[3, 43]}，以芽孢杆菌为主的协同处理其发酵指标评定主要包括基质的氨基酸组成、基质中酸溶蛋白或具体的功能肽的含量等，以酵母、霉菌为主的协同处理其发酵指标评定主要包括基质中酵母数量、低聚寡糖(甘露聚糖)含量以及还原糖增量等^[44]。除了发酵和酶解指标，常规营养成分如粗蛋白质(CP)、氨基酸(AA)、粗脂肪(EE)、粗纤维(CF)、淀粉(starch)、糖分(sugar)等的含量也是评价协同处理效果的常用指标。Yasar等^[45]不仅通过上述指标评价了发酵大麦的协同处理效果，还用二阶导数光谱分析(second derivate spectra analysis，SDSA)法尝试发现菌酶协同发酵处理后大麦中新增的物质，以评价菌酶协同作用的实际价值。

对饲料菌酶协同作用应用效果的评价更多的是将协同处理过的基质添加到动物饲粮中，通过动物饲养试验，观测生长或生产性能指标(日增重、采食量、饲料报酬、产蛋量、产奶量、肉品质等)以及生理生化指标(免疫因子、血液指标、肠道菌群、肠道结构等)等。此外，还可通过测定菌酶协同作用前后的饲料消化利用率评价菌酶协同作用效果，如测定营养物质表观消化率(apparent digestibility，AD)、表观代谢能(apparent metabolic energy，AME)等。Jazi等^[46]比较了菌酶协同作用发酵棉籽粕、未发酵棉籽粕和豆粕对肉鸡生长性能、胴体性状、胃肠道微生物群及肠道形态的影响，结果表明，添加菌酶协同作用发酵棉籽粕能显著提高肉鸡的生长性能，降低腹脂量，减少回肠中大肠菌群数量，增加十二指肠和空肠中绒毛数量，对肉鸡的生长性能和肠道健康有积极影响。Boroojeni等^[7]研究了饲粮中添加菌酶协同作用豌豆对肉鸡生长性能和营养物质消化率的影响，结果显示，菌酶协同作用可以改善豌豆的营养品质，饲粮中添加菌酶协同作用豌豆后粗蛋白质、氨基酸、粗脂肪、淀粉、钙、磷、钾的表观回肠消化率均有改善，表明菌酶协同作用豌豆可作为肉鸡的蛋白质来源。Zhu等^[6]研究了发酵豆粕对断奶仔猪生长性能、血清参数、免疫化学和肠道形态的影响，结果发现，饲喂发酵豆粕仔猪的平均日增重增加，生长发育速度提高，血清尿素氮含量降低，免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、免疫球蛋白A含量升高，十二指肠、空肠、回肠绒毛高度显著增高，隐窝深度显著降低，并确定10%是最佳添加量。对反刍动物而言，会有更多的瘤胃相关指标用于评价饲料菌酶协同作用的应用效果，如瘤胃挥发性脂肪酸(VFA)的组成、瘤胃产气量等^[35]。值得注意的是，近年来无论是菌酶协同作用的饲料还是生物发酵饲料，在水产养殖上均取得了非常不错的应用效果^{[20, 47]}。

5 小结

菌酶协同作用是一个复杂的微生物生命活动过程和酶参与的生物化学反应过程，在协同的过程中涉及到不同的基质、菌种和酶，因此，菌酶协同作用绝不是简单的生物处理工艺。笔者认为目前菌酶协同作用还存在以下问题：1)菌酶协同作用还缺少坚实的理论依据，如哪些菌种和酶在哪些基质里面最能协同，协同的过程和机制是什么等问题还没有坚实的数据支撑，没有形成完整的理论体系；2)菌酶协同作用工艺变异很大，基质发生变化，相应的菌种和酶也发生变化，变化过程中各工艺参数的变化缺乏数据和依据；3)缺乏客观快捷的评价方法，很多菌酶协同作用的饲料要到饲养试验中去评价处理效果的好坏，缺乏现场的快速评价。

基于上述存在的问题，饲料的菌酶协同作用未来发展应重点解决以下问题：1)对基质选择尽可能简单化，优先建立起单一原料基质(确实需要补充碳源、氮源等，可考虑使用单一化工产品)的协同处理工艺，确定其最佳菌和酶的种类与用量；2)研发菌酶协同作用专用菌种和酶，市场上的益生菌和酶制剂来源、活性力、反应条件等均存在较大变化，应开发菌酶协同作用专用的菌种和酶；3)建立菌酶协同作用过程评价机制，即在菌酶协同处理过程中或处理结束后即可评价协同处理的效果，推动菌酶协同作用产物商品化。