断奶肉兔由于自身消化机能发育不完全，特别是内源酶分泌不足，摄入植物性饲料后在一定程度会破坏肠道结构，并且植物性饲料对断奶幼兔胃中pH有一定的中和作用，使消化酶活性受到影响，再加上断奶应激，极易发生腹泻[1-2]。酸化剂具有提高动物胃肠道消化酶活性、降低胃肠道pH、改善胃肠道微生物结构、提高免疫力和促进生长的作用[3]。国内外关于酸化剂在幼畜生产中应用的研究已有较多报道，在饲粮中添加酸化剂可以改善幼畜的生长性能，降低腹泻率[4-7]。但由于酸化剂的种类、剂量以及试验动物等不同，酸化剂对动物肠道健康的影响结果并不一致。目前，酸化剂对家兔肠道健康的影响研究相对较少，因此，本试验在伊拉肉兔饲粮中添加柠檬酸，研究其对断奶幼兔盲肠微生物多样性及代谢产物的影响，以期为幼兔生产中酸化剂的合理利用提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验用柠檬酸为食品级一水柠檬酸。试验兔为100只体重相近的35日龄断奶伊拉肉兔。
1.2 试验饲粮基础饲粮参考《中国养兔学》[8]推荐的家兔饲养标准配制，其组成及营养水平见表 1。试验饲粮是在基础饲粮配方的基础上，在预混料中添加不同水平柠檬酸后制成。各饲粮均制成颗粒饲料。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
将100只体重相近的35日龄断奶伊拉肉兔按性别随机分为5组，每组20个重复，每个重复1只兔。对照Ⅰ组为空白对照组，饲喂基础饲粮；对照Ⅱ组为抗生素对照组，饲喂添加抗生素(恩拉霉素20 g/t+金霉素300 g/t)的基础饲粮；试验Ⅰ组、试验Ⅱ组、试验Ⅲ组为试验组，分别饲喂在基础饲粮中添加0.5%、1.0%和1.5%柠檬酸的试验饲粮。预试期5 d，正试期22 d。试验兔单笼饲养，试验前对兔舍、笼具进行清洗，消毒。试验期间按照常规程序免疫，兔舍自然采光、通风，每天08:00、17:00进行饲喂，自由采食和饮水。
1.4 测定指标和方法 1.4.1 盲肠微生物多样性试验结束时，每组随机选取4只试验兔(公母各占1/2)，屠宰后取盲肠内容物，装入无菌的5 mL冻存管中，迅速投入液氮中，随后转入-80 ℃冰箱保存待测。
使用环境样本DNA提取试剂盒对盲肠微生物进行基因组DNA抽提后，使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。随后对DNA样品进行测序分析(由成都安诺微生物检测公司完成)，采用PE250测序方式，测序试剂盒使用Illumina公司的Hiseq Rapid SBS Kit v2 (FC-402-4023 500 Cycle)。
1.4.2 盲肠微生物代谢产物 1.4.2.1 盲肠内容物pH采用PHSJ-3F型pH计直接测定盲肠内容物pH。
1.4.2.2 盲肠微生物代谢产物浓度取适量盲肠内容物加入2 mL水(1：3磷酸水溶液)，涡旋匀浆2 min，加入2 mL乙醚萃取10 min，4 000 r/min离心20 min(做低温处理，放置于冰水浴中离心，下同)；离心后取出乙醚相，再加入2 mL乙醚萃取10 min，4 000 r/min离心20 min，离心后再次取出乙醚相，将2次萃取液合并后挥发定容至2 mL，采用气相色谱质谱联用仪(Agilent 7890B-7000D)检测盲肠微生物代谢产物浓度。
1.5 数据处理与分析双端测序得到的PE reads首先使用FLASH进行拼接，使用QIIME软件将拼接之后的序列按照barcode标签区分，去除低质量序列，在97%的相似性水平上使用UPARSE算法进行操作分类单元(OTU)的聚类，挑选出OTU的代表性序列。使用Uchime去除嵌合体，并基于Silva数据库对OTU进行分类学注释。基于OTU聚类分析结果，使用QIIME、Mothur和R等软件对样本进行Alpha多样性分析、Beta多样性分析和群落结构的差异性分析。采用SPSS 19.0统计软件的ANOVA方法对数据进行单因素方差分析，用Duncan氏法进行多重比较，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。
2 结果与分析 2.1 试验可行性分析从样本中随机抽取一定量的序列，统计它们所代表的物种数目，以抽取的一系列序列数和相应的物种数来绘制稀释曲线。图 1显示，序列稀释曲线达到较一致的平缓趋势，表明样本的多样性已经接近饱和，样品DNA中大部分细菌已经被获得，所测的序列足以覆盖群落物种组成，能够真实反映群落各物种间的相对比例关系。
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图 1 所有样本的稀释曲线 Fig. 1 Rarefaction curves of all samples |
为了研究样本中物种丰度与物种个体类型的变化关系，验证测序多样性可以达到试验要求，绘制丰度等级曲线，用来观测物种丰度和均匀度。由图 2可知，所有样本在横轴上范围较大，下降趋势平缓，说明20个样本中物种丰度和均匀度较好。
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图中1~4表示各组的4个样本。x轴表示OTU等级，y轴表示该等级OTU中序列数的相对丰度，进行了对数转换。 In figure, 1 to 4 represented 4 samples in each group. x-axis represented OTU rank, y-axis represented the relative abundance of read with logarithmic transformation in this OTU rank. 图 2 所有样本的丰度等级曲线 Fig. 2 Rank-abundance curves of all samples |
采用Illumina Hiseq测序平台对5组盲肠内容物样本中16S rDNA的V4区进行检测，20个样本测序共获得1 306 918对reads，对原始序列进行质控，双端reads拼接、过滤后共产生1 216 645条clean tags，平均每个样品产生60 832条clean tags。
对各组盲肠微生物OTU数进行分析，由表 2可知，3个试验组盲肠微生物的OTU数均极显著高于空白对照组与抗生素对照组(P＜0.01)；并且，随着柠檬酸添加量的增加，OTU数先减少再增加；各组试验兔盲肠微生物OTU数以空白对照组最低，试验Ⅲ组最高。
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表 2 盲肠微生物OTU数 Table 2 OUT number of caecal microflora |
由表 3可知，盲肠微生物Chao指数、Shannon指数和Simpson指数随着柠檬酸添加量的增加呈现先降低再增加的趋势，试验组中均以试验Ⅲ组最高，并极显著高于2个对照组和其他试验组(P＜0.01)。
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表 3 盲肠微生物Alpha多样性指数 Table 3 Alpha diversity indices of caecal microflora |
对各组试验兔盲肠微生物群落进行主坐标分析(PCoA)和非度量多维尺度(NMDS)分析，分别见图 3和图 4。从图中可知，对照组及试验组组内样本聚集度均较高，差异性较小，较稳定；各试验组与2个对照组均能够明显的区分开来，表明试验组与2个对照组盲肠微生物多样性存在明显差异。
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图 3 盲肠微生物群落构成的主坐标分析图 Fig. 3 PCoA diagram of caecal microflora composition |
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图 4 盲肠微生物群落构成的UniFrac非度量多维尺度分析图 Fig. 4 UniFrac NMDS analysis diagram of caecal microflora composition |
将本试验所得有效序列在不同分类水平上进行物种解释，结果共得到22个门。由图 5可知，各组试验兔盲肠微生物在门水平上均主要由厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)及广古菌门(Euryarchaeota)这4种菌门组成。对微生物群落构成比例进一步进行差异显著性分析，结果见表 4。饲粮中添加柠檬酸对伊拉肉兔盲肠微生物中4个主要菌门的相对丰度均有极显著的差异(P＜0.01)。各试验组厚壁菌门的相对丰度均极显著低于空白对照组(P＜0.01)；拟杆菌门的相对丰度以试验Ⅲ组最高，极显著高于其他各组(P＜0.01)；各试验组变形菌门的相对丰度均极显著高于空白对照组(P＜0.01)，极显著低于抗生素对照组(P＜0.01)；试验Ⅰ组、试验Ⅱ组广古菌门的相对丰度极显著高于2个对照组(P＜0.01)。随后是放线菌门(Actinobacteria)，各试验组放线菌门的相对丰度均极显著高于空白对照组(P＜0.01)；相对丰度低于1%且组间存在差异显著或极显著的菌门包括异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、Epsilonbacteraeota、疣微菌门(Verrucomicrobia)和Kiritimatiellaeota(P＜0.01或P＜0.05)。其他菌门由于相对丰度较小，无统计学意义，未在表中列出。
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Firmicutes：厚壁菌门；Bacteroidetes：拟杆菌门；Proteobacteria：变形菌门；Euryarchaeota：广古菌门；Actinobacteria：放线菌门；Deinococcus-Thermus：异常球菌-栖热菌门；Deferribacteres：脱铁杆菌门；Verrucomicrobia：疣微菌门；Others：其他。 图 5 门水平上盲肠微生物群落相对丰度 Fig. 5 Relative abundance of caecal microflora at phylum level |
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表 4 试验兔盲肠微生物群落在门水平上的分布 Table 4 Distribution of caecal microflora in experimental rabbits at phylum level |
以属水平上相对丰度大于1%作为优势菌属的划分依据[9]，如表 5所示，空白对照组、抗生素对照组及试验Ⅰ组、试验Ⅱ组、试验Ⅲ组试验兔盲肠微生物中优势菌属分别为19、22、20、18、24个。除青枯菌属(Ralstonia)、伯克氏菌科未分类菌属(unassigned Burkholderiaceae)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)外，饲粮中添加柠檬酸对伊拉肉兔盲肠微生物中各优势菌属的相对丰度均存在显著或极显著的影响(P＜0.05或P＜0.01)。各组最大的优势菌书均为瘤胃球菌科NK4A214群(Ruminococcaceae NK4A214 group)，各试验组该菌属的相对丰度均极显著低于2个对照组(P＜0.01)，且其相对丰度随着柠檬酸添加量的增加而降低。甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)的相对丰度以抗生素对照组最低，极显著低于空白对照组与3个试验组(P＜0.01)。克里斯滕森氏菌R-7群(Christensenellaceae R-7 group)、瘤胃球菌科UCG-014(Ruminococcaceae UCG-014)、帕匹杆菌属(Papillibacter)的相对丰度随着柠檬酸添加量的增加先升高后降低，试验Ⅱ组极显著高于试验Ⅰ组、试验Ⅲ组(P＜0.01)。毛螺菌科NK4A136群(Lachnospiraceae NK4A136 group)、瘤胃梭菌属(Ruminiclostridium)、拟杆菌目未分类菌属(unassigned Bacteroidales)的相对丰度随着柠檬酸添加量的增加逐渐升高，以试验Ⅲ组最高，极显著高于试验Ⅰ组、试验Ⅱ组(P＜0.01)。拟杆菌属(Bacteroides)、瘤胃菌科未分类菌属(unassigned Ruminococcaceae)、瘤胃球菌科UCG-013(Ruminococcaceae UCG-013)、粪杆菌真核菌群([Eubacterium] coprostanoligenes group)、啮齿真杆菌群([Eubacterium] ruminantium group)、红球菌属(Rhodococcus)、节杆菌属(Arthrobacter)的相对丰度随着柠檬酸添加量的增加先降低后升高，试验Ⅱ组极显著低于试验Ⅰ组、试验Ⅲ组(P＜0.01)。各试验组瘤胃球菌属1(Ruminococcus 1)的相对丰度均极显著高于2个对照组(P＜0.01)，并随着柠檬酸添加量的增加逐渐降低。各试验组乳酸菌属(Lactobacillu)的相对丰度与抗生素对照组差异不显著(P＞0.05)，均极显著高于空白对照组(P＜0.01)。
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表 5 试验兔盲肠微生物群落在属水平上的分布 Table 5 Distribution of caecal microflora in experimental rabbits at genus level |
由表 6可知，与空白对照组和抗生素对照组相比，饲粮中添加柠檬酸对试验兔盲肠内容物pH及微生物代谢产物各挥发性脂肪酸的浓度均没有显著影响(P＞0.05)。
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表 6 柠檬酸对试验兔盲肠微生物代谢产物的影响 Table 6 Effects of citric acid on caecal microbial metabolites of experimental rabbits |
盲肠微生物群落是在长期进化过程中形成的，与宿主保持相对平衡的稳定状态，宿主和微生物菌群的平衡共生可维持动物机体的健康、提高生产性能。当肠道状况异常、免疫功能降低时，盲肠微生物群落的平衡被破坏，容易导致肠道疾病发生[10-11]。酸化剂可以通过改变胃肠道pH来调节盲肠微生物群落[12]，但其确切作用机理还不明确。
近年来，高通量测序成为研究盲肠微生物多样性的主要手段。本试验通过稀释曲线、丰度等级曲线分析，得到测序深度充分，测序量合理，足以覆盖群落物种组成，能够真实反映群落各物种间的相对比例关系。20个样本中物种丰度和均匀度都较好，说明分组合理，此次测序数据具有可靠性和科学性。本试验通过对伊拉肉兔盲肠微生物多样性指数的分析得出，不同试验组盲肠微生物OTU数、Alpha多样性指数均随着柠檬酸添加量的增加表现为先降低再增加，以试验Ⅲ组微生物菌群多样性最高，极显著高于2个对照组及其他试验组。Beta多样性的PCoA和非度量多维尺度分析发现，各试验组与2个对照组盲肠微生物多样性存在明显差异。综合各项数据，可以推测伊拉肉兔饲粮中添加柠檬酸可以增加盲肠微生物多样性，改变盲肠微生物的动态平衡。产生这一结果的原因可能是柠檬酸通过改变胃肠道pH来调节盲肠微生物菌群平衡，改变微生物群落结构。Halas等[13]研究发现饲粮中添加苯甲酸可以增加断奶仔猪盲肠菌群多样性，与本试验结果相近。
本试验测序结果表明，柠檬酸对试验兔盲肠微生物组成影响不大，但改变了盲肠微生物组成比例，相关研究也发现成年家兔肠道微生物的组成比例受其最初菌群定植的影响[14]。Abecia等[15]通过研究也发现饲粮是影响舍饲家兔盲肠微生物组成比例的主要因素。在门水平上，相对丰度最大的优势菌门为厚壁菌门，相对丰度均达到58%以上，其次是拟杆菌门、变形菌门，这与许多研究家兔盲肠微生物的结果[16-18]相一致。已有研究表明厚壁菌门与碳水化合物和蛋白质的吸收有关，拟杆菌门主要是促进碳水化合物发酵、吸收和降解多糖，这两大菌门的稳定对促进肉兔肠道健康十分重要[11, 19]。在本试验中，随着柠檬酸添加量的增加，试验兔盲肠微生物中厚壁菌门的相对丰度先升高再降低，高添加量柠檬酸组厚壁菌门相对丰度极显著低于2个对照组，这对试验兔养分消化利用是否产生影响还需要进一步研究。在属水平上，本试验结果显示各组试验兔盲肠微生物中的优势菌属主要是瘤胃球菌、瘤胃梭菌、相关菌属毛螺菌科未分类菌属、拟杆菌属及乳酸菌属等。饲粮中添加柠檬酸对试验兔盲肠微生物主要优势菌属的相对丰度均有显著或极显著的影响。现有许多研究表明，有机酸主要通过调节肠道微生物之间的比例而使微生物之间更趋于平衡[20]，这与本试验结果一致。本试验的优势菌属中，瘤胃菌科未分类菌属微生物主要与纤维降解密切相关[21]，毛螺旋菌科未分类菌属是盲肠内参与发酵的主要菌，具有降解半纤维素的能力[22]。本试验中，虽然柠檬酸极显著影响主要优势菌属的相对丰度，但作用效果并不一致，其原因一方面可能是由于相比其他有机酸，柠檬酸能被许多微生物代谢，另一方面可能是饲粮组成也会对盲肠微生物菌属产生影响，因此柠檬酸对这些菌属的影响还有待于进一步的深入研究。研究发现，与猪和鸡等单胃动物不同，家兔肠道中主要有益菌为拟杆菌，乳酸菌和双歧杆菌数量较少[1]。本试验中，与空白对照组相比，饲粮中添加柠檬酸极显著增加了盲肠微生物中有益菌拟杆菌属和乳酸菌属的相对丰度，这可能是因为柠檬酸可以降低胃肠道pH，而拟杆菌、乳酸菌能耐受较低的pH，因此饲粮中添加柠檬酸促进其生长，增加了它们在微生物群落中的相对比例。但也有研究表明，酸化剂对消化道乳酸杆菌数量无显著影响，甚至降低[23-24]。不同有机酸对乳酸菌的影响不尽一致，这可能与酸化剂的选择、剂量及饲粮组成等不同有关。
3.2 柠檬酸对伊拉肉兔盲肠微生物代谢产物的影响家兔盲肠微生物能够发酵前肠道未被消化的纤维素等成分，产生挥发性脂肪酸等营养物质，挥发性脂肪酸在后肠中迅速被吸收，可提供家兔40%的维持能量[2]。本试验结果表明，饲粮中添加柠檬酸对伊拉肉兔盲肠内容物pH没有显著影响，说明柠檬酸不是通过改变盲肠pH来影响微生物菌群结构的。朱克华[1]研究发现酸化饮水对幼兔盲肠pH的影响不显著，与本试验结果一致。这主要是因为与无机酸相比，有机酸主要是通过解离出氢离子(H+)，调节微生物群落结构来影响胃肠道pH。在本试验中，随着饲粮中柠檬酸添加量的增加，伊拉肉兔盲肠内容物中乙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸和正戊酸浓度均先减少后增加，但与2个对照组相比未达到显著水平。关于酸化剂对盲肠微生物代谢产物影响的报道不多，结果也不一致。Buhler等[25]研究发现，饲粮中添加苯甲酸可显著提高生长期猪盲肠和直肠内容物中丁酸浓度。陈宝江等[26]研究发现给仔猪饲喂由磷酸与有机酸组成的复合酸化剂后，盲肠内容物中异丁酸、正丁酸、异戊酸和正戊酸浓度随着酸化剂添加量的增加而增加。盲肠中挥发性脂肪酸主要由厌氧菌产生，不同酸化剂对盲肠微生物代谢产物的影响并不一致，可能是由于酸化剂种类、剂量、试验动物及饲粮组成等不同而引起的，其机理还需要进一步探讨。
4 结 论饲粮中添加柠檬酸可以提高伊拉肉兔盲肠微生物的多样性，通过改变盲肠微生物组成比例来改变盲肠微生物的动态平衡，以添加量为1.5%时盲肠微生物多样性最高。
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