2. 海北高原现代生态畜牧业科技试验示范园, 海北 810299;
3. 山东农业大学动物科技学院, 泰安 271018
2. Haibei Plateau Modern Ecological Animal Husbandry Science and Technology Experimental Demonstration Park, Haibei 810299, China;
3. College of Animal Science and Technology, Shandong Agricultural University, Tai'an 271018, China
植物纤维性饲料可被瘤胃微生物降解成可利用营养物质,提供给宿主大约70%的能量,转化成畜产品[1]。瘤胃微生物结构的变化与动物生产效率密切相关[2-3]。董春晓等[4]研究粗饲料来源对育肥湖羊瘤胃微生物组成的影响,发现玉米芯有利于纤维分解菌的增殖, 适于作为湖羊粗饲料来源。Zhao等[5]研究表明,随着奶牛饲粮中粗饲料的变化,瘤胃微生物结构会发生变化。李与琦等[6]研究发现,饲喂50%微贮棉秆在提高日增重的同时对湖羊瘤胃微生物菌群结构与功能影响较小。马万浩等[7]研究发现,瘤胃微生物多样性受饲粮和断奶日龄的影响, 早期断奶可加速瘤胃微生物区系的建立。前人对湖羊的研究主要集中在饲粮类型、断奶日龄及生理状态等对动物瘤胃微生物群落结构方面的影响,而生长环境对湖羊瘤胃微生物组成影响的研究较少。王慧慧等[8]通过对来自亚洲、非洲和欧洲等国家的1 002例健康人群肠道菌群数据分析表明,3岁以上亚洲、非洲和欧洲等地区健康人群肠道菌群则展示出了地域环境性特征。俞英豪[9]对不同生境下大青叶蝉肠道细菌多样性进行研究,结果表明不同季节和不同地理位置是影响大青叶蝉肠道微生态的重要因素。柴英辉等[10]研究揭示了仿刺参肠道微生物在不同地域环境之间存在明显差异。湖羊是世界上唯一的多胎白色羔皮羊品种, 主要分布于我国浙江、江苏太湖流域。由于其适应性强、耐粗饲、耐寒暑、抗病力强,近年来山东、河南、新疆、西藏等地区引进湖羊的数量与日俱增。本研究旨在探讨在饲粮营养物质基础相近的情况下,不同生长环境对湖羊生长性能及瘤胃内容物微生物组成与功能的影响,为湖羊跨地区引种提供科学参考。
1 材料与方法 1.1 试验环境 1.1.1 山东高密高密位于山东半岛中部,胶莱平原腹地,平均海拔19.3 m,地理位置为北纬36°8′44″至36°41′20″、东经119°26′16″至120°0′38″。境域属季风性暖温带大陆性半湿润气候,年降水量在880 mm左右,气候宜人,冬冷夏热,四季分明。年日照时数2 528.9 h左右。
1.1.2 青海海晏海晏位于青海省东北部,傍依祁连山脉,平均海拔3 000 m以上,地理位置为北纬36°44′至37°39′、东经100°23′至101°20′。境域属高原亚干旱气候,年降水量在400 mm左右,春季干旱多风,夏季凉爽,秋季短暂,冬季漫长。海晏年平均气温1.5 ℃左右,年日照时数2 980 h左右。
1.2 试验动物及设计选择遗传相似、同胎次的1岁左右的湖羊90只,其中45只运输至青海省海晏某肉羊繁育基地饲养繁育,另一部分留在山东高密某牧业有限公司饲养繁育,公母比例均为1 : 8。当年配种,次年产羔。2个地方所产的羔羊均75日龄断奶,标记作为备选试验对象。
试验分为2组:山东组(sdlw组)和青海组(qhlw组),每组按照体重相近的原则挑选90日龄健康湖羊40只,随机均分至4个饲养栏(公母混养)中,开始常规饲养试验。预试期10 d,正试期150 d。
1.3 试验饲粮试验羊均以地方饲料原料为主制作全混合日粮。饲粮配方参照《肉羊饲养标准》(NY/T 816—2004),按照肉羊体重25 kg、日增重0.25 kg/d营养需要量进行配制。饲粮组成及营养水平见表 1。
试验前对圈舍进行清扫、消毒,对羊只实行驱虫、防疫、打耳号。日饲喂2次(08:30、18:30),自由采食、饮水。其他管理均参照所属繁育基地执行。
1.5 采食量及体重测定每天饲喂前,记录前1天剩料量和加料量,每天收集1次剩料,计算干物质含量,用于计算整个试验期各组羊干物质采食量。试验羊于试验开始当天测定空腹体重,作为初始体重,正试150 d后测定终末体重,计算每只羊平均日增重。
1.6 样品采集饲养试验结束后第2天,每组随机选取4只公羊,颈静脉放血,立即剖开腹腔,结扎胃贲门与幽门,取出羊瘤胃,于左前腹盲囊处采集约50 mL瘤胃内容物,4层纱布过滤于离心管内,冰封迅速转入-80 ℃冰箱保存,以备送检。
1.7 样本送检将样品送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司,采用Illumina Miseq平台进行测序。
1.8 生物信息分析 1.8.1 测序数据处理先用Cutadapt对reads进行低质量部分剪切,再从所得reads中拆分出各样品数据,截去Barcode和引物序列初步质控得到原始数据(Raw reads),经过以上处理后得到的reads需要进行去除嵌合体序列的处理,通过将reads序列与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列,去除其中嵌合体序列,得到最终有效数据(clean reads)。
1.8.2 操作分类单元(OTUs)聚类和物种注释利用Uparse软件对全部clean reads进行聚类,以97%一致性(identity)将序列聚类为OTUs,选取OTUs代表性序列,筛选OTUs中出现高频序列作为OTUs代表序列。对OTUs序列进行物种注释,用SILVA132的SSUrRNA数据库与Mothur方法进行物种注释分析(设定阈值为0.8~1.0),获得分类学信息并分别在各分类水平(门、纲、目、科、属、种)统计各样本的群落组成。使用MUSCLE(Version 3.8.31)软件进行快速多序列比对,得到所有OTUs序列系统发生关系,以样品中数据量最少的OTUs为标准进行均一化处理,后续Alpha多样性分析和Beta多样性分析均基于均一化处理数据。
1.8.3 样本复杂度分析使用Qiime软件(Version 1.9.1)计算可见物种指数、Simpson指数、Chao1指数、Shannon指数、ACE指数、D_whole_tree指数、覆盖度,使用R软件(Version 2.15.3)绘制Rank abundance曲线、稀释曲线、物种累积曲线,并使用Tukey检验和Wilcox检验进行Alpha多样性指数组间差异分析。
使用Qiime软件(Version 1.9.1)计算Unifrac距离,使用非加权组平均法(UPGMA)绘制聚类树。使用R软件(Version 2.15.3)绘制主成分分析(PCA)、主坐标分析(PCoA)和非度量多维尺度分析(NMDS)图。使用R软件,分别进行有参数检验和非参数检验,用Tukey检验和Wilcox检验进行Beta多样性指数组间差异分析。
使用LEfSe软件进行LEfSe分析,默认设置线性判别分析分数(LDA score)的筛选值为4。
1.8.4 Tax4Fun功能注释提取KEGG数据库原核生物全基因组16S rRNA基因序列并利用BLASTN算法将其比对到SILVA SSU Ref NR数据库(BLAST bitscore>1 500)建立相关矩阵,通过超快速蛋白质序列分类工具(UProC)和DNA对准剂进行蛋白质比对(PAUDA)2种方法注释KEGG数据库原核生物全基因组功能信息,并将信息对应到SILVA数据库中,实现SILVA数据库功能注释。测序样品以SILVA数据库序列为参考序列聚类出OTUs,进而获取功能注释信息。
1.9 数据统计使用Excel 2010进行试验数据整理,采用SAS 9.1.3软件的ANOVA程序进行方差分析,并以Duncan氏法进行多重比较检验,P>0.05表示差异不显著,P < 0.05表示差异显著,试验结果用“平均值±标准误”表示。
2 结果与分析 2.1 不同生长环境对湖羊生长性能的影响由表 2可知,在经过5个月的饲养试验后,尽管试验羊遗传背景、日龄、饲粮营养物质基础相近,但青海组和山东组平均日增重差异显著(P < 0.05),料重比差异显著(P < 0.05)。
Venn图显示2组之间共有986个OTUs,青海组特有204个OTUs,山东组特有146个OTUs(图 1),说明不同生长环境下的湖羊瘤胃内容物微生物组成有所差异。
由表 3可知,湖羊饲养在青海和山东瘤胃内容物菌群的可见物种指数及Chao1指数、ACE指数、Shannon指数及Simpson指数差异均不显著(P>0.05),说明在饲粮营养物质基础相近的情况下,不同生长环境下的湖羊微生物丰富度变化不显著。覆盖度反映样品的测序深度,6个样品覆盖度均在0.99以上,表明本次测序结果可以反映样本的真实情况。
Beta多样性是指不同环境群落之间的物种差异性,用来比较样品在组间物种多样性方面存在的差异。Beta多样性与Alpha多样性一起构成了总体多样性或一定环境群落的生物异质性。PCoA展示各个样品间的差异大小,样品距离越近,表示样品的物种组成越相近。基于Unweighted Unifrac距离PCoA,PC2贡献率24.95%,PC1贡献率25.59%;以Weighted Unifrac距离矩阵做UPGMA聚类分析,样品越靠近,枝长越短,说明2个样本的物种组成越相似,并将聚类结果在门水平上对各样本的物种相对丰度整合展示。由图 2、图 3分析得出,山东组样品聚类较好,青海组相对分散,说明生长在青海的湖羊瘤胃内容物微生物物种组成差异较大,生活在山东的湖羊瘤胃内容物微生物物种差异较小。Anosim分析是一种非参数检验,用来检验组间差异是否显著大于组内差异,从而判断分组是否有意义。由图 4可知,山东组和青海组组间群落结构差异显著(R=0.427,P=0.027)。
由图 5-A可知,在门水平上,2组优势菌门主要为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes),山东组绿弯菌门(Chloroflexi)相对丰度显著高于青海组(P < 0.05);在属水平上,优势菌属包括未鉴定普雷沃氏菌科(unidentified_Prevotellaceae)、未鉴定瘤胃菌科(unidentified_Ruminococcaceae)、未鉴定拟杆菌属(unidentified_Bacteroides)。青海组未鉴定普雷沃氏菌科相对丰度显著高于山东组(P < 0.05),而未鉴定瘤胃菌科相对丰度显著低于山东组(P < 0.05)(图 5-B)。这表明饲养在山东和青海的湖羊瘤胃内容物微生物结构存在差异。
利用Kruskal-Wals秩和检验检测所有的特征物种,通过检测不同组间的物种丰度差异,获得显著性差异物种; 再利用Wilcoxon秩和检验检测上1步获得的显著性差异物种的所有亚种是否都趋同于同一分类级别,然后通过线性判别分析(LDA)实现降维,从而评估差异物种的影响大小,即得到LDA score,最后绘制差异物种的LDA值分布柱状图。通过对青海组和山东组LEfSe分析,LDA score>4的biomarker共有8个,由图 6可知,普雷沃菌属(Prevotella_sp_DJF_CP65)、普雷沃氏菌科(f_Prevotellaceae)在青海组中起着重要作用,而瘤胃球菌科(f_Ruminococcaceae)、克柔丝菌(g_Flexilinea)、厌氧绳菌纲(c_Anaerolineae)、o_Anaerdlineales、绿弯菌纲(p_Chloroflexi)、厌氧绳菌科(f_Anaerolineaceae)在山东组中起着重要作用。数据分析表明,不同的生长环境改变了瘤胃内容物微生物组成。
本试验共获得7类生物代谢通路功能分析一级功能层(图 7-A):人类疾病、新陈代谢、遗传信息处理、生物体系统、未鉴定功能、细胞过程和环境信息处理。山东组在环境信息处理、细胞代谢、新陈代谢和未鉴定功能4个生物代谢通路的基因表达丰度较青海组高,青海组在遗传信息处理、人类疾病、有机系统方面基因表达丰度高。进一步对预测基因二级功能层进行分析,发现其由遗传信息处理、感染性疾病、氨基酸代谢等35个子功能组成(图 7-B)。对其基因表达丰度进行分析,发现山东组在转录、氨基酸代谢、碳水化合物代谢、膜运输、脂质代谢、原核生物细胞社区、新陈代谢、细胞过程和信号、细胞活性生物降解和代谢等方面生物代谢通路的基因表达丰度明显高于青海组。
赵亚星等[11]研究表明,粗饲料不同会导致动物采食量和消化率不同,其生长性能就会存在差异。本试验中尽管试验羊遗传背景、日龄、饲粮营养物质基础相近,但青海地区海拔高,空气含氧量低,运输到青海的湖羊生理负荷重,羔羊初生重明显降低,同时饲粮组成方面青海组与山东组存在较大差异,生长环境和饲粮的差异导致青海组平均日增重和料重比显著低于山东组,影响了湖羊的生长性能。
3.2 不同生长环境对湖羊瘤胃内容物微生物组成的影响研究表明,湖羊20日龄时在其瘤胃内就可发现拟杆菌门、厚壁菌门[12]。李与琦等[6]也发现,拟杆菌门和厚壁菌门是组成湖羊瘤胃门水平微生物的主要类群。Henderson等[13]对来自不同国家和地区的742头反刍动物瘤胃微生物区系研究发现,虽然地理位置不同,但核心菌群仍然是反刍动物所共有。本研究结果与前人结果相一致,尽管青海组和山东组湖羊生长环境不同,但其瘤胃内容物核心菌群未发生变化。
本研究中,山东组湖羊瘤胃内容物绿弯菌门相对丰度显著高于青海组。绿弯菌门是一类通过光合作用产生能量的细菌,又称作绿非硫细菌,尼丽[14]研究表明,绿弯菌门是严格的化能异养型细菌,且具有多种代谢途径;王金凤[15]发现,不同植被演替、水位土壤微生物结构和多样性不同,其中在不同植被和不同水位时期绿弯菌门和变形菌门所占比例均较高;刘佳斌[16]对土壤微生物群落研究发现,放线菌门、绿弯菌门的相对丰度与含水量呈显著正相关。本研究中,山东安丘年降水量在880 mm左右,而青海海晏年降水量在400 mm左右,估计土壤含水量的差异影响到当地土壤微生物群落中绿弯菌门的含量,进而影响到当地水分与植物中绿弯菌门的含量,最终山东组绿弯菌门相对丰度高于青海组。
微生物可将粗饲料中纤维物质快速降解转化为营养物质,从而满足反刍动物的能量需求,而纤维素的降解主要受到纤维素降解菌的影响[17-19]。Wongwilaiwalin等[20]报道,降解纤维素的微生物由厚壁菌门和拟杆菌门下的菌属组成。拟杆菌门是瘤胃中蛋白质和非纤维植物多糖的主要分解者[21],该菌门中的普雷沃氏菌属在反刍动物瘤胃中含量最高[22]。Thoetkiattikul等[23]研究了3种不同纤维、淀粉的饲粮对奶牛瘤胃菌群多样性的影响,结果发现高淀粉饲粮组具有多聚糖降解功能的普雷沃氏菌属和黄杆菌属的含量最高。普雷沃氏菌在瘤胃中可降解并利用淀粉和植物细胞壁多糖,如木聚糖和果胶,某些栖瘤胃普雷沃氏菌株具有很强的降解燕麦木聚寡糖的能力[24]。本研究中,青海组未鉴定普雷沃氏菌科和普雷沃氏菌属相对丰度显著高于山东组,推测与青海饲粮中含有21%的燕麦有关,这说明瘤胃内容物菌群结构会随着饲粮的改变而改变。
厚壁菌门中占有较大比例的丁酸弧菌属、醋酸弧菌属和瘤胃球菌属主要分解纤维[25],瘤胃球菌在胃肠道中降解纤维素[26]。Hoetkiattikul等[23]研究发现,饲喂高纤维饲粮的动物胃肠道中毛螺旋菌(Lachnospiraceae)、纤维杆菌科(Fibrobacteraceae)及瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)等纤维降解菌的相对丰度最高;另有研究表明,在同一作物中,生长地域的海拔高度、气候条件、土壤酸碱性和含氧量等因素都会在不同程度上影响作物秸秆中粗纤维素含量[27]。本研究中,山东组瘤胃球菌科相对丰度显著高于青海组,可能与山东组饲粮中的粗纤维含量有关。
高凤[28]研究指出,不同自然环境下的土壤微生物菌群结构及多样性差异显著,高原放牧区奶牛肠道菌群与土壤微生物群落结构间某些菌属存在显著相关性。推测本研究中瘤胃菌群结构的差异和青海地区海拔高、空气含氧量低、昼夜温差大、积温少以及饲粮差异等因素有关。因此,不同地区土壤微生物结构不同,影响饲粮菌群组成,进而影响到瘤胃内容物菌群结构,这也从瘤胃微生物区系的角度揭示了动物对环境的适应机制。
3.3 不同生长环境对湖羊瘤胃内容物微生物生物代谢通路的影响通过对生物代谢通路一级功能层分析发现,山东组在环境信息处理、细胞代谢、新陈代谢和未鉴定功能4个生物代谢通路的基因表达丰度较青海组高,青海组在遗传信息处理、人类疾病、有机系统方面基因表达丰度高;对二级功能层分析发现,山东组在转录、氨基酸代谢、碳水化合物代谢、膜运输、脂质代谢、原核生物细胞社区、新陈代谢、细胞过程和信号、细胞活性生物降解和代谢等方面生物代谢通路的基因表达丰度明显高于青海组。
青海海晏属于高原亚干旱气候,春季干旱多风,夏季凉爽,秋季短暂,冬季漫长,空气稀薄,具有气温低、昼夜温差大、降雨少而集中、日照长、太阳辐射强等,而山东高密以暖温带大陆性半湿润气候气候为主。湖羊运输到青海后,先经过了一段时间的适应。由于地势海拔高,空气含氧量低,湖羊到青海后生理代谢均需经过一定的调整。两地不同的水源、气溶胶中的微生物含量、气温、空气含氧量、日照时间等,均影响着生物代谢通路基因丰度的表达。从功能预测上来讲,饲喂在山东的湖羊在转录、氨基酸代谢、碳水化合物代谢、膜运输、脂质代谢、原核生物细胞社区、新陈代谢、细胞过程和信号、细胞活性生物降解和代谢等方面生物代谢通路的基因丰度表达明显优于饲喂在青海的湖羊。是否可以通过添加适宜的微生态制剂调控其瘤胃代谢,改善其瘤胃功能,进而促进湖羊较好的适应新环境尚待进一步研究。
4 结论① 在遗传背景、日龄、饲粮营养物质基础相近情况下,青海组和山东组湖羊平均日增重差异显著,料重比差异显著。
② 不同生长环境可以显著改变同源湖羊瘤胃微生物组成与多样性。
③ 山东组湖羊在转录、氨基酸代谢、碳水化合物代谢、膜运输、脂质代谢、细胞群落原核生物、新陈代谢、细胞过程和信号、细胞活性生物降解和代谢等方面生物代谢通路的基因丰度表达明显优于青海组湖羊。
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