褪黑激素,化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺,是色氨酸的衍生物,是主要由哺乳动物松果体分泌的一种吲哚胺类激素[1]。褪黑激素具有调节毛皮动物季节性换毛的作用,广泛用于毛皮动物生产中[2-5]。獭兔作为典型的皮用兔品种,褪黑激素可以显著增加獭兔的被毛密度,促进獭兔皮张提前成熟[6-7]。研究发现,褪黑激素也参与生殖、中枢神经、内分泌、消化、免疫等系统的调节[8]。因此,在研究褪黑激素对獭兔皮毛性能影响的同时,有必要对褪黑激素在獭兔生殖方面的影响进行研究。褪黑激素对动物生殖系统的影响并不一致,褪黑激素对长日照动物(牛、鼠类、禽类等)和人的生殖系统具有抑制作用,对短日照动物(绵羊、鹿等)具有促进作用,而对光不敏感的动物无作用[9]。研究还发现,褪黑激素影响动物繁殖性能的关键是褪黑激素供给的持续性[10]。目前,褪黑激素对獭兔生殖系统和繁殖性能的影响还鲜见报道。因此,本试验通过研究饲粮中添加褪黑激素对獭兔繁殖性能的影响,探讨褪黑激素在提高獭兔毛皮质量的同时,对獭兔生殖器官及繁殖性能所造成的影响。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验兔为240只130日龄体况良好、体重相近的白色后备獭兔,公母各占1/2。试验所用褪黑激素购自湖北某药厂(含量99.5%)。
1.2 试验饲粮在对饲料原料的营养价值进行评价后,参考谷子林等[11]推荐的家兔饲养营养推荐值设计基础饲粮,基础饲粮组成及营养水平见表 1。在预混料中分别添加不同水平(10、25、40 mg/kg)的褪黑激素,加工成直径为4 mm的颗粒料。
选用130日龄健康状况良好、体重相近的獭兔240只,随机分为4组,每组30只母兔、30只公兔。对照组饲喂基础饲粮,试验组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组)分别饲喂含不同水平(10、25和40 mg/kg)褪黑激素的试验饲粮。试验前对兔舍及兔笼进行彻底清洗、消毒;全部试验兔在同一兔舍内单笼饲养,按照常规程序进行免疫,兔舍自然采光、通风。试验期每日08:00和17:00各饲喂1次,自由饮水。试验期间,密切观察母兔情况,做好试验记录。饲养试验30 d,之后对母兔进行配种,至仔兔45日龄试验结束。
1.4 测定指标及方法 1.4.1 性腺发育指标饲喂褪黑激素30 d后,每组随机抽取5只母兔,注射促排3号(注射用黄体素释放激素A3),16 h后屠宰。对卵巢进行称重,并对排卵点计数。每组随机抽取5只公兔进行屠宰,迅速取出两侧睾丸,去除周围结缔组织,进行称重,测量其纵切面长、宽,计算纵切面面积:
纵切面面积(cm2)=纵切面长×纵切面宽。
1.4.2 母兔繁殖性能受胎率:人工授精后怀孕的母兔所占的百分比。
产仔数:母兔的实际产仔数(包括死胎、畸形胎等)。
活仔数:称量初生窝重时的活仔兔数。
初生窝重:整窝仔兔出生后未吮乳之前的重量。
断奶窝重:整窝仔兔断奶时的重量。
泌乳力:整窝仔兔21日龄窝重与初生窝重之差。
成活率:断奶仔数占活仔数的百分比。
1.4.3 精液品质饲喂褪黑激素30 d后,每组选择健康公兔15只,人工采精,在18~25 ℃室温条件下进行精液品质检查。射精量通过集精杯的刻度直接读取。精子活力:先将载玻片和盖玻片放在保温板上预热至37 ℃左右,取一滴新鲜精液于载玻片上,盖上盖玻片,迅速在400倍显微镜下观察视野中直线前行运动的精子数占所有精子数的比例。精子活力采用10级评分制,即在显微镜下观察一个视野内的精子运动,若全部直线运动,则为1.0级;有90%的精子呈直线运动则活力为0.9,依次类推。
1.4.4 睾丸组织生理学结构饲喂褪黑激素30 d后,每组随机抽取5只公兔,禁食16 h后,进行屠宰,取睾丸,固定于10%福尔马林溶液中,送山西农业大学,采用日本OLYMPUS正置荧光显微镜进行睾丸组织生理学结构测定。
1.5 数据统计与分析采用Excel 2007对数据进行初步整理,并采用SPSS 19.0软件对各指标进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法多重比较。受胎率采用卡方检验。除受胎率外,试验结果表示为平均值±标准差。P < 0.05为差异显著,P < 0.01为差异极显著。
2 结果 2.1 褪黑激素对獭兔性腺发育的影响由表 2可知,与对照组相比,Ⅰ、Ⅱ组睾丸重量显著增加(P<0.05),Ⅲ组与对照组差异不显著(P>0.05)。各组之间睾丸纵切面面积、卵巢重量及排卵点数量差异均不显著(P>0.05)。
由表 3可知,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组曲精小管直径显著大于对照组(P<0.05),Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组曲精小管面积极显著大于对照组(P<0.01),且Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组之间差异不显著(P>0.05)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组曲精小管上皮厚度有高于对照组的趋势(P=0.069)。各组之间附睾上皮厚度、附睾管直径、附睾管管腔直径、圆形精子数、支持细胞数及支持细胞率差异均不显著(P>0.05)。
由表 4可知,各组之间射精量和精子活力差异均不显著(P>0.05)。
由表 5可知,Ⅲ组泌乳力显著低于对照组及Ⅰ、Ⅱ组(P<0.05),Ⅰ、Ⅱ组与对照组之间差异不显著(P>0.05);随着褪黑激素添加量的增加,试验兔断奶窝重有逐渐降低的趋势(P=0.099)。各组之间受胎率、产仔数、活仔数、初生窝重、成活率差异均不显著(P>0.05)。
目前,褪黑激素在畜禽中的应用研究主要集中在动物生殖功能、免疫系统、抗氧化功能和被毛成熟等方面[12]。在哺乳动物中,褪黑激素通过激活其受体在下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴内的结合位点进而调控生殖功能[13]。研究发现,因动物的种类、生理状况不同,褪黑激素对生殖系统的影响表现出促进或抑制或无作用的多重性。褪黑激素对大多数动物的生殖活动是抑制性的,然而一些试验证明褪黑激素的作用并不总是抑制性的,外源褪黑激素只有与内源褪黑激素协同作用才会导致性腺萎缩。研究认为,褪黑激素供给的持续性是影响动物繁殖性能的关键[10]。
3.1 褪黑激素对獭兔性腺发育的影响性腺器官重量在一定程度上可以反映其功能强弱[14]。刘淑英等[1]研究发现,褪黑激素能与卵巢、睾丸和肾上腺的β-受体结合,直接调节它们的生理功能,进而控制生殖器官的发育成熟,褪黑激素还通过对下丘脑-垂体-性腺轴功能的抑制作用来影响生殖系统的功能。本试验中,褪黑激素对公兔睾丸纵切面面积、母兔卵巢重量、排卵点数量没有显著影响。与对照组相比,饲粮添加10和25 mg/kg褪黑激素显著提高了公兔睾丸重,但当添加量达到40 mg/kg时,睾丸重量开始降低,与对照组显著不差异,这说明褪黑激素对獭兔性腺重量的影响存在剂量效应。这与乔妍婷等[15]得出的长期注射褪黑激素对雄性布氏田鼠性腺发育的抑制具有时间效应和剂量效应结论相一致。宋兴超等[16]研究发现,饲粮添加褪黑激素可使取皮期水貂单侧睾丸平均重量极显著高于对照组;在狐狸皮下埋植褪黑激素可使性腺明显增大[17]。但褪黑激素对性腺发育的影响也不尽一致。傅祥伟等[6]研究发现,皮下埋植褪黑激素对獭兔睾丸重量、睾丸纵切面面积及母兔排卵点数量的影响均不显著。一些研究也发现,褪黑激素会使公兔睾丸重量减轻[18-19]。在其他动物研究中发现,切除幼年雄性大鼠的松果腺时,大鼠睾丸重量增加[20]。Swelum等[21]报道,皮下埋植褪黑激素可以显著增加非繁殖季节公牛的睾丸体积。产生这些结果的原因可能是褪黑激素对季节性生殖动物作用较明显,对那些非季节性生殖的动物不敏感,因此不同动物对外源褪黑激素的需要量不一致,导致对性腺发育产生不同的影响。相较于饲喂和注射褪黑激素,研究发现皮下埋植褪黑激素效果不好[22],这可能与皮下埋植的方式、褪黑激素作用的时间和剂量不同有关。
3.2 褪黑激素对公兔繁殖性能的影响睾丸是重要的雄性生殖腺,可产生精子和雄性激素,对雄性生殖系统的发育起着重要作用,因此对其组织学水平进行研究可全面反映睾丸结构与功能的变化规律[23]。研究发现,雄性动物睾丸中含有特异的褪黑激素结合位点,并且其结合可逆,褪黑激素能通过与受体结合从而影响睾丸的生殖功能[24-25]。本试验中,褪黑激素显著增加了公兔曲精小管直径,极显著增加了曲精小管面积,并且有增加曲精小管上皮厚度的趋势。研究发现,曲精小管上皮厚度及曲精小管面积与生殖细胞数量呈正相关,生殖细胞数量的增加导致曲精小管面积增大,曲精小管上皮厚度增加[26]。产生这些结果可能是因为添加褪黑激素使公兔睾丸中褪黑激素受体与充足的褪黑激素结合,从而影响生殖细胞发育与分化,促进睾丸的生殖功能。张培玉等[27]通过组织学切片发现埋植褪黑激素能明显促进雄貂睾丸的发育,促进精子产生,提高繁殖力。宋兴超等[16]也报道褪黑激素可使水貂取皮期生精小管直径、附睾管与管腔直径及附睾上皮厚度极显著高于对照组。伊卜拉伊木·胡达拜尔迪等[28]发现,外源性褪黑激素可以使和田羊睾丸曲细精管的管壁厚度和直径明显增加,同时使曲细精管内各类生精细胞的数量明显增多。这些研究结果与本试验基本一致,但本试验中饲喂褪黑激素对附睾管直径、管腔直径及附睾上皮厚度没有显著影响,这可能是由于试验动物不同,品种特异性造成的。支持细胞率是评价睾丸功能的一个重要指标,本试验中,褪黑激素对睾丸支持细胞率没有显著影响,这主要是由于每个睾丸的支持细胞数在性成熟前就已确立[29]。支持细胞具有支持和营养生精细胞的作用,支持细胞率是决定生精效率的重要因素,这与试验中饲喂褪黑激素对公兔射精量及精子活力没有显著影响的结果相一致。沈伟等[30]研究发现,埋植褪黑激素对公兔精液品质无明显影响;周战江等[31]研究也发现,埋植褪黑激素对公狐精液品质没有显著影响。这些研究与本试验结果一致,但也有一些研究与本试验结果不同。汪兴生等[19]对雄兔进行褪黑激素主动免疫,降低了精子活力;在接受松果体切除后的大鼠身上,发现通过在其下丘脑视前区添加外源褪黑激素,可以引起精液量下降和性腺萎缩[32]。产生这些差异的原因可能与给予褪黑激素的方式不同有关,随着给予方式的不同,褪黑激素作用于动物的时间、剂量、频率都会产生差异,因此,褪黑激素不同给予方式对添加效果的影响还需要进一步研究。
3.3 褪黑激素对母兔繁殖性能的影响光照周期对母兔繁殖性能会产生显著影响[33],而光照对繁殖活动影响的关键介质是褪黑激素,光信号传达到视网膜,变为神经冲动,传递到松果体,抑制褪黑素的分泌,使下丘脑中促性腺激素释放激素上升,从而提高繁殖性能[34]。在本试验中,褪黑激素对母兔受胎率、产仔数影响不显著,但当添加量达40 mg/kg时,母兔的泌乳力显著降低,与以上研究结果一致。产生这些结果的原因主要是褪黑激素对动物繁殖性能的影响主要取决于外源褪黑激素的补充是否能使体内褪黑激素保持到一定水平,从而调节光照效应对动物繁殖性能产生的影响。沈伟等[30]研究发现,埋植褪黑激素对母兔产仔性能无明显影响;段春辉等[35]研究发现,埋植褪黑激素对绒山羊产羔数、羔羊初生重影响不显著;马明新[36]报道,饲粮添加褪黑激素可提高绵羊窝重。这些研究都与本试验结果相近,但褪黑激素对动物繁殖性能的影响随动物种类的不同而表现出不同的作用。蔡珍等[37]通过在蓝狐皮下埋植褪黑激素发现,褪黑激素能降低母狐受胎率。相关研究发现,人卵泡的颗粒细胞和猪卵丘颗粒细胞中有褪黑激素的结合位点,并且褪黑激素可能在排卵过程中起重要作用[38]。马友记等[22]报道,通过调节口服褪黑激素浓度的变化节律可提高哺乳母猪的哺乳及繁殖效率。Mura等[39]研究发现,埋植褪黑激素可以显著提高母羊产羔率,尤其是在4~5月份期间。这些结果与本试验结果不同,其原因可能是动物种类及褪黑激素饲喂剂量不同引起的,羊属于短日照动物,褪黑激素对其繁殖性能的影响表现出季节性。
4 结论综上所述,獭兔饲粮中添加一定剂量的褪黑激素可以改善公兔繁殖性能,对母兔繁殖性能影响不大,但当饲粮中褪黑激素添加量过高时,獭兔繁殖性能降低。
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