在蒸汽调质制粒评估植酸酶的耐热性时，首先需要探讨调质前、调质后和制粒冷却后各过程中采样时间区域获得样品植酸酶活性的变异，以及该变异对酶活性残留率测定的影响。在配合饲粮生产中，调质时高温、高湿及造粒时高剪切力会造成饲粮中添加的植酸酶容易变性、失活^[1-4]。在植酸酶及其他饲用酶的耐热评估中，研究者多通过水浴法、鼓风干热法以及蒸汽发生加热法来评估^[5]。这些加热条件与实际生产的调质过程尚存在较大的差距^[6]，因此，饲粮生产者仍质疑上述评估方法对真实的调质制粒过程的代表性。然而，采用调质制粒生产线评估植酸酶的耐受性又存在上批生产的饲粮残留量大、调质温度难以精确控制、采样时间区域不明确等客观问题。De Jong等^[7]采用小型调质制粒生产线(产量 < 100 kg/h)评估植酸酶对高温调质的耐受性，虽然植酸酶活性随调质温度的升高而线性下降，但是测定的重复性仍不理想(残留率SEM=8.80%)。为了提高调质制粒生产条件的稳定性，本课题组建设了蒸汽调质制粒评估热敏性物质的小型制粒生产线，实现了调质温度的自动精确控制与自动监测，确保了调质条件的稳定性。然而，在调质制粒过程中所采集样品的代表性是影响残留率的重要因素之一。现有报道对调质制粒的样品采集描述不详^[7-8]。虽然Gilbert等^[9]提出了酶制剂的制粒评估规程，但对制粒过程中采集哪一时间段的样品并未明确。为此，本试验探讨调质制粒前、后不同时间区域样品中植酸酶活性的变异程度及其对酶活性残留率的影响，为采用调质制粒评估植酸酶耐热性的方法提供参考。

1 材料与方法 1.1 试验材料

从中国市场采购商品植酸酶，呈浅黄色颗粒状。标识酶活性为10 000 U/g，使用时样品经万能粉碎机粉碎后在试验饲粮中以4 kg/t的剂量添加。

1.2 试验饲粮

将玉米、豆粕粉碎过2 mm筛后，将植酸酶与豆粕等比逐级稀释至10 kg时，与其他原料共计100 kg投入混合机中，混合后调质制粒成颗粒饲粮，其组成及营养水平见表 1。

1.3 试验设计

采用单因素完全随机设计，待蒸汽制粒稳定后在调质前、调质后、制粒后和冷却后每2 min采集1 min样品，100~200 g。每个采样位点共计采集30个样品。以20 min内10个样品为1个采样时间区域，共计21个时间区域(如0~18 min、2~20 min，依此类推)。比较0~18 min、20~38 min和40~58 min采样区间3组无重叠样品间植酸酶活性的差异。通过比较采样区域内调质前、调质后、调质—制粒后、调质—制粒—冷却后植酸酶活性与该位点全程平均活性及植酸酶活性残留率的差异，确定代表性采样时间区域。比较代表性采样时间区域内样品植酸酶活性与该区域样品合并后植酸酶实测活性的差异。

1.4 制粒的参数设置及制粒过程

蒸汽环模制粒机采用江苏牧羊小批量产量的制粒机。其中调质器为双轴差速调质器，调质筒长度1.2 m，双筒直径22 cm，调质时间约35 s，调质温度75 ℃(温度探头在调质器的上侧下探)。制粒环模压缩比为6 : 1，孔径为4 mm。喂料频率3.86 Hz，产量为100 kg/h。在调质器的前、中、后及制粒出口设有电子温度传感器，整个调质制粒过程均由电脑全自动控制，并采集温度数据。

制粒过程如下：打开蒸汽总阀门及压缩空气阀。植酸酶与豆粕逐级稀释预混合好后，将饲粮配方中剩余的其他原料投入混合机中混合55 s后自动卸入制粒缓冲仓。依次开启蒸汽阀、排水阀(排出冷水后关闭)。然后在电脑系统中依次打开制粒机、调质器、喂料器。待调质温度达到75 ℃，且制粒机电流稳定，按试验设计在相应的时间区域及位置取样。调质后、制粒后、冷却后采集的样品立即放入4 ℃冰箱冷却，保存备用。

1.5 测定指标及方法

通过调质器、制粒机出料口的温度传感器记录调质、制粒的温度。根据GB/T 6435—2006^[12]方法测定饲粮中水分的含量。植酸酶的活性根据GB/T 18634—2009^[13]方法测定，但稀释液采用方法中描述的缓冲液1。其活性单位定义为：在37 ℃、pH为5.50条件下，每分钟从浓度为5.0 mmol/L植酸钠溶液中释放1 μmol无机磷，即为1个植酸酶活性单位，以U表示。

1.6 数据处理与统计

采用SAS 9.0 Means模块计算基本统计量。采用GLM模块对0~18 min、20~38 min和40~58 min所采集样品的植酸酶活性进行单因素方差分析，以LSMEANS对处理间进行t检验比较。在采样区间内样品植酸酶活性与该区域样品合并后植酸酶实测活性的差异，采用TTEST模块进行t检验。

2 结果与分析 2.1 蒸汽调质制粒过程中样品温度、干物质含量及植酸酶活性的变异

在蒸汽调质制粒稳定后的0~58 min中，调质前的饲粮温度为28.8 ℃，且变化幅度小(CV=0.6%)。蒸汽调质器中部饲粮的平均温度为74.3 ℃，CV为2.1%。在采样开始前40 min温度比较平稳，40~58 min波动增大。蒸汽调质—制粒后0~18 min采样区间由于物料没有完全覆盖住感温探头，因此，测定的温度数据不是颗粒饲粮的真实温度。在采样区间的20~58 min，制粒后物料完全盖住感温探头，且温度相对平稳，该采样区间颗粒饲粮的平均温度为80.4 ℃，CV为2.8%(图 1)。调质前饲粮的干物质含量为88.1%(CV=0.2%)。调质后和制粒后饲粮的干物质含量分别为85.4%(CV=0.6%)和85.9%(CV=0.5%)。制粒冷却后饲粮干物质含量为86.7%(CV=0.5%)(图 2)。沿着调质—制粒—冷却工艺过程，温度呈逐步升高，最后恢复到室温，饲粮干物质含量呈先降低再升高的变化规律。

在0~58 min采样区间，调质前饲粮中植酸酶的平均活性为39.8 U/g(CV=15.5%)，调质后饲粮中植酸酶的平均活性为28.3 U/g，且波动变大(CV=25.8%)。调质—制粒后饲粮中植酸酶的平均活性为20.1 U/g，波动变小(CV=12.5%)。调质—制粒—冷却后饲粮中植酸酶的平均活性为14.7 U/g，波动变大(CV=21.9%)(图 3)。沿着调质—制粒—冷却工艺过程，饲粮中植酸酶活性残留率依次下降(图 4)。

2.2 蒸汽调质制粒过程中采样区间对植酸酶活性残留率的影响

在蒸汽调质温度达到设定75 ℃稳定后的0~58 min内，调质制粒各采样位点以采样时间为序每10个样品为1个采样区间，共计21个采样区间(表 2)。在0~18 min、20~38 min和40~58 min 3个无重叠样品组间，调质前植酸酶活性平均值无显著差异(P>0.05)，调质后0~18 min植酸酶的平均活性显著低于20~38 min的样品平均值(P < 0.05)。调质—制粒后植酸酶活性平均值无显著差异(P>0.05)。调质—制粒—冷却后0~18 min和20~38 min植酸酶的平均活性均显著高于40~58 min的样品平均值(P < 0.05)。

以0~58 min采集的全部30个样品的平均值为全程平均值参照，根据植酸酶活性测定的允许相对偏差为判别依据，筛选可代表调质制粒全程平均值的采样时间区间。在调质前采样位点以14~24 min开始计时后的6个采样区间和40~58 min的1个采样区间，在调质后采样位点以4~12 min和32~40 min开始计时后的10个采样区间，在调质—制粒后所有21个采样区间，在调质—制粒—冷却后以0 min、12~32 min开始计时后的10个采样区间内饲粮中植酸酶活性的平均值与该位点全程平均值在植酸酶活性测定的误差允许范围内。在采样区间内10个饲粮样品植酸酶活性的CV中，调质前样品的CV平均值为12.2%，调质后样品的CV平均值为19.5%，调质制粒后样品的CV平均值为9.2%，调质—制粒—冷却后样品的CV平均值为14.7%。

在各位点植酸酶活性的残留率上，在调质后采样位点以12~18 min开始计时的4个采样区间(偏差 < 6%)，调质制粒后以12~18 min和36~40 min开始计时后的7个采样区间(偏差 < 3%)，在调质—制粒—冷却后以0~18 min和24~36 min开始计时后的17个采样区间(偏差 < 3%)内饲粮中植酸酶活性的残留率与该位点全程样品平均残留率接近。综合上述数据，在饲粮植酸酶活性、植酸酶活性的残留率与全程平均值最接近的采样时间区域为12~30 min、14~32 min、16~34 min和18~36 min。

2.3 采样区间内样品植酸酶活性的平均值与合并样品后植酸酶活性实测值的比较

在采样时间区域的14~32 min、16~34 min和18~36 min中(图 5~图 8)，14~32 min采样时间区域调质—制粒后10个样品植酸酶的平均值与合并后植酸酶实测活性存在显著差异(P < 0.05)。16~34 min采样时间区域4个采样位点，每个位点10个样品植酸酶的平均值与该10个样品等重量合并后植酸酶实测活性均存在显著差异(P < 0.05)。18~36 min采样时间区域调质—制粒及调质—制粒—冷却后10个样品植酸酶的平均值与合并后植酸酶实测活性存在显著差异(P < 0.05)。然而，所有采样时间区域内10个饲粮样品植酸酶活性的平均值与合并后实测值的相对偏差均低于8%。

3 讨论 3.1 蒸汽调质制粒过程中饲粮温度及水分含量的变异

饲粮从喂料器进入调质器与饱和蒸汽混合后温度逐渐升高。通常调质器的前、中、后分别有多个蒸汽入口(本试验中3个，生产中6~8个)，以便使蒸汽在物料中快速分布。将粉料在调质器出口的温度作为调质温度^{[7, 14]}。在调质器内，物料靠近喂料口的温度较低而靠近蒸汽开口处的温度较高，两者相差较大。本试验中，调质器前、中、后的温度最大相差达10 ℃以上。然而，目前尚鲜见关于调质器不同位置温度变异的报道。当蒸汽中的水分与粉料混合，水分含量每增加1%，物料的温度升高14.5~15.0 ℃^[15]。Sivhus等^[16]报道调质温度达到75 ℃，水分含量增加3%~4%。周兵等^[17]报道饲粮在调质器中从37 ℃升到80~84 ℃时，水分含量增加2.06%~3.11%；调质—制粒后饲粮的温度在调质的基础上升高13 ℃，水分含量降低0.5%；冷却后，水分含量在调质—制粒的基础上再次降低2.4%。在本试验中，物料温度从28.8 ℃升高到74.3 ℃，水分含量增加了2.7%；调质—制粒后物料温度平均升高了6.1 ℃，水分含量降低了0.5%。调质—制粒—冷却后水分含量在调质—制粒的基础上再次降低0.8%。从全过程温度和饲粮水分含量变化的规律看，本试验与周兵等^[17]的试验结果比较接近。冷却后两者的水分含量相差稍大，可能主要与冷却时空气的流量与时间参数有所差异有关。在本试验中，调质后粉料的水分含量相对于其他位点变化最大，这是因为本研究所用生产线采用温度传感器反馈控制蒸汽阀的开度，因而进入调质器的蒸汽量是小幅度波动的，这一变化与调质温度的变异相对应。而调质—制粒后温度的变异较大，且在调质后的温度基础上升幅与Jongbloed等^[18]的试验结果接近，但比周兵等^[17]、杨洁等^[19]报道的数据偏低。Inborr等^[20]及Homan等^[4]的试验表明，调质—制粒后与调质后饲粮的温度分别相差10~15 ℃和1~4 ℃。这可能与制粒后物料水分快速散发，所测温度并非刚出制粒机的实际温度有关。在本试验中发现制粒机环模出口的温度传感器未完全被颗粒饲粮覆盖(主要发生在开始采样后的前20 min)，因此，所测温度比饲粮的实际温度低，同时也导致了温度的波动较大。

3.2 蒸汽调质制粒过程中代表性样品的采样方案

猪禽饲粮经适当的调质温度(65~85 ℃)和调质时间(30~55 s)^{[14-15, 21]}处理后可灭活饲粮中的有害微生物、破坏抗营养因子，使部分淀粉糊化，有利于养分的消化，同时也可以将导致酶制剂和维生素失活、可溶性纤维的黏度增大的不利后果降到较小，从而达到最大的边际效益^{[14, 16-17, 22]}。这一效应在饲粮的营养浓度处于中、低水平时更加凸显^[23]。在调质制粒对酶制剂的破坏中，Sivhus等^[16]总结得出，调质制粒过程导致酶的变性主要是水分子与酶蛋白通过非共价的范德华力相互作用，在其外围形成了1层膜有利于酶蛋白的稳定性。随着温度升高，水分子达到较高的能量状态，酶蛋白在水分含量低时可以承受严酷的热处理，而在水分高时大部分酶蛋白质会在60~70 ℃变性。因此，调质—制粒过程中物料的水分含量与植酸酶活性的残留率存在一定的相关性^[24]。然而，这一准确的相关系数却难以获得。这是因为在调质制粒过程中，一方面酶制剂在饲粮中的含量受混合均匀度的影响，另一方面物料在调质器不同位置及制粒后的温度和水分含量都存在变异。上述因素导致了同一批次生产中样品的酶制剂活性含量存在较大幅度的变异。本试验调质前和调质—制粒—冷却的全程生产中饲粮植酸酶活性的CV为12.5%~25.8%，这表明在调质—制粒—冷却不同位置所采集的样品中植酸酶的活性均存在较大的变异。不同研究者的试验结果表明，蒸汽调质制粒后植酸酶活性的残留率存在非常大的差异(12.6%~106.0%)^{[14, 25-26]}，虽然在调质制粒参数、饲粮的组成、植酸酶来源等方面存在很多的差异，导致不同研究结果间具有不可比性，但是试验过程不稳定的随机因素较多也是导致残留率变异较大的原因。这一推断可以从Timmons等^[2]报道中得出，其试验结果表明2种植酸酶经蒸汽调质制粒后残留率相差16.5%(残留率64.3%~81.0%)，但统计学上检验不显著。De Jong等^[7]的试验数据也证明了类似的结论。这表明即使在相同的调质制粒参数条件和饲粮下，同一处理不同生产批次间植酸酶的残留率存在较大的差异。为此Gilbert等^[9]提出在蒸汽调质制粒评估植酸酶的耐热性中，每个批次采集5个调质前的粉料样品，在制粒冷却后每隔20~30 s采集1个样品，共计采集10个成品料，共计重复5个生产批次。De Jong等^[7]、Slominski等^[26]在植酸酶的耐热性评估中仅描述了每次调质—制粒过程采集4~5个子样品。然而，上述采样方案所采集的样品能否能代表生产全程的平均值仍存质疑。本试验调质—制粒—冷却各阶段植酸酶的活性及活性残留率在调质温度稳定在设定值后的12~18 min开始，每2 min采集1 min样品，共计采集10个样品，其植酸酶的活性及残留率均与全程的相应值接近，因此，在该时间区间内采集的样品具有较好的代表性。

4 结论

在调质前、调质—制粒—冷却后各位点，饲粮样品中植酸酶活性存在较大的变异(CV=12.5%~25.8%)。调质制粒过程中代表性样品的采集方案建议为在调质温度稳定在设定值后的12~18 min开始，每2 min采集1 min样品，共计采集10个样品。