2. 国家水禽产业技术体系营养与饲料功能研究室, 青岛 266109
2. National Waterfowl Industry Technical System Nutrition and Feed Function Laboratory, Qingdao 266109, China
肠炎性疾病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种复发的慢性黏膜免疫相关疾病,包括克罗恩病(Crohn’s disease,CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)[1]。UC是一种慢性的炎症疾病,它的临床特征包括肠道黏膜病变和溃疡、结肠变窄、腹泻和大便带血等现象。越来越多的现象表明,UC是一个由多因素导致的复杂病变过程,包括基因、免疫系统损伤和环境因素[2]。虽然UC的发病机制已逐渐被揭示,但也很难找到预防和改善这种炎症性疾病的有效方法。目前,药物干预是治疗UC的一种常见方法,但大多数药物成本高或伴有副作用,例如氨基水杨酸盐、皮质类固醇和免疫抑制剂等[3]。但是,伴随个体的差异性,此类药物的临床疗效很不一致。治疗UC的难点在于病变部位位于肠道后部,由于肠道高酸和各种酶的干扰,使用的抗生素或激素类药物难以到达,有效浓度降低较大,往往很难治愈,同时还会造成耐药性。而畜禽饲养过程中由于饲料发霉、油脂酸败、大肠杆菌感染和应激等原因也会造成UC,给畜禽养殖造成很大损失。因此,寻找一种新的UC修复治疗方法对维护肠道健康是非常有必要的。
甘油二酯(diacylglycerol,DAG)结构与甘油三酯(triglycerides,TAG)相似,但代谢和消化途径不同,在膳食中使用DAG替代TAG后可减轻体重,降低血液胆固醇和葡萄糖含量[4]。DAG作为低热量的脂肪替代物也得到了广泛关注,并已被纳入各种食品基质中[5]。谢玉娥等[6]研究发现,鹅油甘油二酯(goose oil diglycerol, GDG)在体外对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和表皮金黄色葡萄球菌有抑菌作用。Song等[7]研究发现,甘油二酯激酶(diacylglycerol kinase,DGK)参与氧化应激肠细胞损伤的调节。鸭油甘油二酯(duck oil diglycerol, DDG)对胆汁酸的分泌有抑制作用,可用来防治腹泻及其他疾病引起的刺激性腹泻症状。
维生素K1是一种脂溶性维生素,是具有止血功能的有效药物,主要用于维生素K缺乏引起的出血,比如梗阻性黄疸和出血性肠炎等引起的出血。维生素K1调节凝血因子的产生,γ-羧基谷氨酸作为维生素K1依赖的羧化酶的辅酶,催化谷氨酸残基的羧化反应[8]。维生素K1可以通过降低炎症细胞因子白细胞介素(IL)-6含量,从而起到治疗肠道性炎症的作用[9]。然而,维生素K1为脂溶性维生素,口服不溶于水,在肠道靠胆汁部分乳化吸收,利用率很低,尤其是在胆管梗阻胆汁分泌受阻情况下维生素K1吸收更少;如果采用注射方式,对于畜禽群体治疗会造成很大应激。此外,维生素K1本身没有消炎作用,单一服用不能够达到肠道炎症修复治疗的满意效果。由此可见,脂溶性维生素K1与DDG协同对肠道炎症的研究是很好的一个切入点。目前,维生素K1多采用注射方式给药应用于临床急症,而维生素K1与DDG的联合使用对UC的修复作用还未见报道。因此,本试验通过研究维生素K1与DDG协同对UC小鼠血清炎症细胞因子含量和结肠组织发育的影响,旨在分析不同水平的维生素K1和DDG的互作效应及其对UC小鼠结肠组织的修复效果,探究一种修复治疗UC的新方法,为维护肠道健康提供技术支撑。
1 材料与方法 1.1 试验材料与基础饲粮DDG为国家水禽产业技术体系营养与饲料研究室自制,纯度>85%。维生素K1购于上海源叶生物有限公司(纯度>98%),葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)购于合肥博美生物科技有限公司。6周龄的雄性小鼠购于青岛大任富城有限公司。基础饲粮由德州诺唯实生物技术有限公司提供,基础饲粮组成及营养水平见表 1。
试验分为UC小鼠造模阶段和修复干预阶段2个阶段,按照《实验动物福利伦理审查指南》(GB/T 35892—2018)实施。
第1阶段:UC小鼠模型的建立[10]。选择6周龄雄性小鼠,体重(20±2) g,饲养于无特定病原体(SPF)级动物房中,环境温度为23~25 ℃,光暗周期为12 h;提供基础饲粮和蒸馏水。试验小鼠适应性喂养7 d。考虑到第2阶段UC小鼠修复干预试验UC小鼠模型需要量较多,此时将小鼠随机分为2组:对照组和炎症模型组。对照组每组5个重复,每个重复10只,共50只小鼠;炎症模型组每组20个重复,每个重复10只,共200只小鼠。造模期间,对照组自由饮用蒸馏水7 d,炎症模型组自由饮用3%的DSS溶液7 d,DSS溶液每2 d更换1次。造模结束后,对照组和炎症模型组分别随机抽取20只小鼠,禁食不禁水24 h后,眼球取血,取血清和结肠,测量小鼠初始体重、造模后体重、结肠长度及血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6含量,验证是否造模成功。
第2阶段:UC小鼠修复干预试验。造模成功后,将UC模型建立成功的小鼠转入第2阶段试验。设计对照组(Ⅰ组)、炎症模型组(Ⅱ组)和炎症修复组(Ⅲ~Ⅷ组),每组5个重复,每个重复4只,共160只小鼠。Ⅰ和Ⅱ组给予蒸馏水灌胃7 d;Ⅲ~Ⅷ组采用2×3两因素交叉试验设计,DDG添加水平分别为2.50、3.75、5.00 mL/kg BW,维生素K1添加水平分别为1.00、2.00 mg/kg BW,灌胃治疗7 d。试验设计见表 2。
试验结束后,小鼠眼球取血,收集血液样本并于3 000×g离心10 min,分离上清获得血清样本,-80 ℃保存待测。采用MPO活性检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)检测小鼠血清MPO活性。
1.3.2 血清炎症细胞因子含量的检测采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定血清IL-1β、IL-4、IL-6、IL-17、IL-10和TNF-α含量,使用全自动酶标仪(美国Bio-Rad公司)进行测定。
1.3.3 结肠肠道组织学观察试验结束后立即收集每只小鼠的结肠,并测量结肠长度,取距肛门1 cm处的5 mm长的结肠样品固定在10%中性福尔马林中用于制作石蜡切片。样品组织经流水冲洗12 h、乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片、展片、苏木精-伊红(HE)染色、中性树胶封片制成结肠组织石蜡切片。在OLYMPUS系统显微镜10×20倍镜下观察,获取结肠石蜡切片图像,LY-WN-HP SUPPER CCD软件测量结肠的绒毛高度、隐窝深度,计算绒毛高度/隐窝深度。
1.3.4 肝脏维生素K1含量的检测试验结束后,精密称取肝脏组织样品0.1 g于组织匀浆器中,加入400 μL生理盐水进行匀浆,将匀浆液置于离心管中,10 000×g离心10 min,吸取上清液,使用ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定肝脏维生素K1含量。
1.4 数据统计与分析使用SPSS 17.0软件中GLM模型分析主效应和互作效应,再利用ANOVA程序和LSD法对数据进行差异显著性分析,炎症模型组和对照组组间差异采用Student-t检验分析。数据用平均值和均值标准误(SEM)表示,P>0.05为差异不显著,P < 0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 DSS诱导的UC小鼠模型的建立由表 3可知,适应性喂养7 d后,小鼠的初始体重无显著差异(P>0.05)。自由饮用7 d的DSS后,炎症模型组小鼠的造模后体重和结肠长度显著低于对照组(P<0.05),血清TNF-α和IL-6含量显著高于对照组(P<0.05)。由此表明,DSS诱导的UC小鼠模型造模成功[10]。
由表 4可知,Ⅱ组修复后体重显著低于Ⅰ组(P<0.05);DDG与维生素K1协同修复UC小鼠7 d后,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ组修复后体重显著高于Ⅱ组(P<0.05),Ⅳ、Ⅴ组修复后体重与Ⅰ组无显著差异(P>0.05),Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ组修复后体重显著低于Ⅰ组(P<0.05)。DDG与维生素K1协同对UC小鼠修复后体重的交互作用不显著(P>0.05)。
Ⅱ组结肠长度显著低于Ⅰ组(P<0.05);DDG与维生素K1协同修复UC小鼠7 d后,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ组结肠长度显著高于Ⅱ组(P<0.05),Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ组结肠长度与Ⅰ组无显著差异(P>0.05),Ⅳ组结肠长度显著低于Ⅰ组(P<0.05)。DDG与维生素K1协同对UC小鼠结肠长度的交互作用不显著(P>0.05)。
Ⅱ组血清MPO活性显著高于Ⅰ组(P<0.05);Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组血清MPO活性与Ⅰ组无显著差异(P>0.05),但显著低于Ⅱ组(P<0.05);Ⅲ、Ⅶ、Ⅷ组血清MPO活性与Ⅱ组无显著差异(P>0.05),但显著高于Ⅰ组(P<0.05)。Ⅳ组血清MPO活性显著低于Ⅲ、Ⅶ、Ⅷ组(P<0.05)。DDG与维生素K1协同对UC小鼠血清MPO活性的交互作用显著(P<0.05)。
2.3 DDG与维生素K1协同对UC小鼠血清炎症细胞因子含量的影响由表 5可知,Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组血清IL-17含量与Ⅰ组无显著差异(P>0.05),Ⅲ、Ⅶ、Ⅷ组血清IL-17含量显著高于Ⅰ组(P<0.05),Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ组血清IL-17含量显著低于Ⅱ组(P<0.05)。DDG与维生素K1协同对UC小鼠血清IL-17含量的交互作用显著(P<0.05)。
Ⅰ组血清IL-1β含量显著低于Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ组(P<0.05),Ⅱ组血清IL-1β含量显著高于Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ组(P<0.05)。DDG与维生素K1协同对UC小鼠血清IL-1β含量的交互作用显著(P<0.05)。
Ⅰ组血清TNF-α含量与Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ组无显著差异(P>0.05),Ⅱ组血清TNF-α含量显著高于Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ组(P<0.05)。DDG与维生素K1协同对UC小鼠血清TNF-α含量的交互作用显著(P<0.05)。
Ⅰ组血清IL-6含量与Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ组无显著差异(P>0.05),Ⅱ组血清IL-6含量显著高于Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ组(P<0.05)。DDG与维生素K1协同对UC小鼠血清IL-6含量的交互作用显著(P<0.05)。
Ⅰ组血清IL-10含量与Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ组无显著差异(P>0.05),Ⅱ组血清IL-10含量显著高于Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ组(P<0.05)。DDG与维生素K1协同对UC小鼠血清IL-10含量的交互作用显著(P<0.05)。
Ⅰ组血清IL-4含量与Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ组无显著差异(P>0.05),Ⅱ组血清IL-4含量显著高于Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ组(P<0.05),Ⅴ组血清IL-4含量显著低于Ⅲ、Ⅵ组(P<0.05)。DDG与维生素K1协同对UC小鼠血清IL-4含量的交互作用显著(P<0.05)。
以上结果表明,DDG与维生素K1协同可有效减少UC小鼠炎症细胞因子的释放,加快肠炎收敛愈合。
2.4 DDG与维生素K1协同对UC小鼠结肠组织修复和发育的影响由图 1可知,Ⅰ组结肠结构完整,无炎症细胞浸润;与Ⅰ组相比,Ⅱ组结肠结构不完整,小肠绒毛高度明显缩短;经DDG和维生素K1协同干预治疗后,与Ⅱ组相比,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ组结肠组织得到明显修复。
由表 6可知,与Ⅰ组相比,Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组的结肠绒毛高度无显著差异(P>0.05),Ⅲ、Ⅶ、Ⅷ组的结肠绒毛高度显著降低(P<0.05)。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ组的结肠绒毛高度显著高于Ⅱ组(P<0.05)。Ⅳ、Ⅵ组的结肠绒毛高度显著高于Ⅲ、Ⅶ、Ⅷ组(P<0.05)。DDG与维生素K1协同对UC小鼠结肠绒毛高度的交互作用显著(P<0.05)。
与Ⅰ组相比,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ组的结肠隐窝深度无显著差异(P>0.05);Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ组的结肠隐窝深度显著低于Ⅱ组(P<0.05)。DDG与维生素K1协同对UC小鼠结肠隐窝深度的交互作用不显著(P>0.05)。
与Ⅰ组相比,Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ组的结肠绒毛高度/隐窝深度无显著差异(P>0.05);Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ组结肠绒毛高度/隐窝深度显著高于Ⅱ组(P<0.05)。DDG与维生素K1协同对UC小鼠结肠绒毛高度/隐窝深度的交互作用显著(P<0.05)。
以上结果表明,DDG与维生素K1协同可有效修复UC小鼠的绒毛高度和隐窝深度。
2.5 DDG与维生素K1协同对UC小鼠肝脏维生素K1含量的影响由表 7可知,与Ⅰ组相比,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ组的肝脏维生素K1含量无显著差异(P<0.05);Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ组的肝脏维生素K1含量显著高于Ⅱ组(P<0.05),Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ组的肝脏维生素K1含量显著高于Ⅲ、Ⅳ组(P<0.05)。DDG与维生素K1协同对UC小鼠肝脏维生素K1含量的交互作用不显著(P>0.05)。
以上结果表明,DDG能促进UC小鼠肝脏中维生素K1的吸收。
3 讨论 3.1 DDG与维生素K1协同对小鼠炎症反应的影响UC主要涉及破坏结肠黏膜完整性和屏障功能障碍[11]。Sánchez-Fidalgo等[12]研究发现,DSS诱导的UC小鼠出现体重下降、直肠出血、血清MPO活性增加等现象,经药物干预后有效缓解了小鼠体重的降低,降低了结肠中性粒细胞的浸润。Shiraishi等[9]研究发现,维生素K1的缺乏能加重DSS诱导的小鼠UC。本研究发现,与对照组相比,DSS诱导的UC小鼠体重下降,出现便血现象,结肠缩短,血清MPO活性增加,DDG与维生素K1协同干预修复后,有效补偿了小鼠体重下降、结肠缩短及血清MPO活性的增加。
3.2 DDG与维生素K1协同对小鼠血清炎症细胞因子含量的影响Dong等[13]研究发现,DSS处理会增加细胞中IL-17A和IL-21 mRNA表达量,经药物干预治疗后有效降低了细胞中IL-17A和IL-21 mRNA表达量。维生素K1具有凝血功能,参与骨代谢和抗炎作用。Ohsaki等[8]研究发现,维生素K1能够抑制脂多糖诱导的炎症性肠病大鼠细胞中IL-6的释放。Iijima等[14]通过研究维生素D和维生素K对炎症性肠病骨骼健康和免疫功能的重要性发现,维生素D和维生素K1有助于维持IBD患者的骨骼健康,可能抑制免疫介导的炎症因子,参与调节疾病活性。IL-6是一种促结肠炎症的炎症因子,参与UC和结肠癌的产生。研究表明,IL-6可以抑制和阻断UC的产生。Zhou等[15]通过研究亚麻籽油对DSS诱导的UC大鼠的缓解作用发现,亚麻籽油能够降低结肠IL-6 mRNA的表达水平。Yang等[1]通过研究短双歧杆菌对DSS诱导的小鼠UC的修复作用发现,短双歧杆菌主要通过共轭亚油酸的产生来抑制UC小鼠中促炎症细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的mRNA表达。刘亚楠等[16]研究发现,DDG与维生素D3协同可以提高炎症性大鼠脾脏过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)mRNA的表达,从而下调炎症因子,促进炎症修复。本试验中,DDG与维生素K1协同对UC小鼠血清炎症细胞因子含量的交互作用显著,可有效减少UC小鼠中炎症细胞因子(IL-1β、IL-4、IL-6、IL-17、TNF-α和IL-10)的释放,这可能与维生素K1的促进凝血作用及抑制免疫介导的炎症因子IL-6有关;另外,由于DDG的抑菌作用,选择性地抑制大肠杆菌、沙门氏菌等变形菌的繁殖,同时使厚壁菌门数量增加,促进机体营养吸收,加快优化肠道菌群[6],从而达到抑制炎症的效果,其机理还有待进一步探究。
3.3 DDG与维生素K1协同对小鼠结肠发育的影响肠黏膜屏障是动物肠道内具有高效选择性功能的屏障系统,能防止致病物质的入侵,阻止肠腔内细菌和内毒素的位移[17]。肠绒毛是吸收营养物质的主要组织,常超等[18]研究发现,合生元替代部分抗生素可提高空肠与回肠的绒毛高度,降低隐窝深度,增强消化吸收功能。由此可见,绒毛高度和隐窝深度可反映肠道的功能情况。惠华英等[19]通过研究四磨汤口服液对脾虚便秘小鼠肠黏膜结构的影响发现,四磨汤口服液能显著增加肠道绒毛高度,促进营养物质的吸收。本试验研究发现,DDG与维生素K1协同对小鼠结肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度的交互作用显著,进而促进小鼠肠道功能的恢复和发育;尽管干预方法不一样,但是得到修复效果一致,且无抗生素药物残留与抗药性风险。
3.4 DDG与维生素K1协同对小鼠肝脏维生素K1含量的影响炎症性肠病的发生常伴有维生素K1的缺乏[20]。Ohsaki等[8]研究发现,饲粮中添加维生素K能够增加大鼠肝脏维生素K1含量。路则宝[21]研究表明,TAG促使脂溶性维生素被人体吸收利用,若是缺乏则会导致各类疾病的产生。Campani等[22]开发了一种基于脂质体的维生素K1皮肤喷雾配方,研究发现,脂质的使用可以增加维生素K1在表皮的积累。由此可见,脂质物质可以促进脂溶性维生素K1的溶解与吸收。本试验中,DDG能够促进维生素K1在小鼠体内的吸收与消化,表明机体内DDG具有TAG脂溶性的功能,促进脂溶性维生素K1在肝脏中的吸收,从而对肠道炎症的出血起到止血、收敛作用。
综上结果表明,DDG与维生素K1对UC小鼠的血清MPO活性、炎症细胞因子(IL-1β、IL-4、IL-6、IL-17、TNF-α、IL-10)含量及结肠组织发育的交互作用显著。DDG具有TAG的脂溶性特性,且具有抑菌、优化肠道菌群、促进炎症修复作用;同时可促进维生素K1的吸收,保持维生素K1的有效浓度,调节炎症因子IL-6的释放,能够与维生素K1协同加快DSS诱导的小鼠UC的修复。
4 结论① DDG与维生素K1协同可有效减少UC小鼠炎症细胞因子的释放,加快肠炎收敛愈合,促进肠道组织的修复发育;DDG能促进UC小鼠肝脏中维生素K1的吸收,加快对肠炎的止血修复。
② 小鼠按3.75 mL/kg BW的DDG和1.00 mg/kg BW的维生素K1灌胃对UC损伤的修复效果最佳。
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