随着我国饲料“禁抗”日期的临近,如何有效避免禁抗所产生的各种各样的影响,将在很长时间内成为饲料行业要解决的重要问题。益生素作为一种绿色饲料添加剂,能够在动物胃肠道黏膜上定植,并通过生物夺氧的方式抑制病原菌繁殖,促进有益菌的生长,能够有效调控动物肠道中的微生物菌群平衡[1-2],在生产中广泛被单胃动物所应用[3-4]。而对于反刍动物,因其特殊的消化道结构和生理特点,研究作用效果更强、更全面的复合益生菌就显得更有意义。付晓政等[5]饲喂澳洲荷斯坦奶牛复合益生菌(主要成分为乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌)能够显著提高粪便中乳酸菌的含量,显著降低牛粪中氨气含量;丁赫等[6]在杜寒杂交羊的饲粮中添加由枯草芽孢杆菌、光合细菌、酵母菌、双歧杆菌和黑曲霉菌组成的复合益生菌,显著提高了羊瘤胃液中乙酸浓度及拟杆菌门、疣微菌门和互养菌门的相对丰度,显著降低了变形菌门的相对丰度;王志成等[7]将植物乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌组成的复合益生菌饲喂仔猪,显著提高了仔猪肠道中有益双歧杆菌和乳酸杆菌的增殖,显著抑制了大肠杆菌的增殖。且还有研究表明,复合益生菌可以减少羔羊的腹泻率,具有提高羊采食饲粮的利用率和促进其生长的能力[1-2]。本课题组前期体外研究发现:培养底物的饲粮精粗比不同,相同的益生菌对体外发酵参数的影响结果不同[8-9],推测在不同精粗比饲粮中的同种益生菌对反刍动物瘤胃微生物的影响不同,进而影响动物的生长性能。因此,本试验拟针对前期的体外试验结果,选取组合效应效果最佳的复合益生菌添加到绵羊不同精粗比饲粮中,研究其对绵羊瘤胃内典型微生物数量的影响,从而为开发利用复合益生菌提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物及试验设计选用体重[(45.50±1.52) kg]相近、体况良好、装有永久性瘤胃瘘管的蒙古羯羊6只作为试验动物,按体重差异不显著(P>0.05)的原则随机分为2组,每组3只,采用交叉试验设计方法分2期进行试验:第1期,2组绵羊分别饲喂低精料饲粮(精粗比为3 : 7)和高精料饲粮(精粗比为7 : 3),同时投喂复合益生菌(课题组自主配制);第2期,2组绵羊饲粮互换,饲喂方式相同。每期试验预试期15 d,正试期25 d,2期间隔21 d。
1.2 试验饲粮及饲养管理试验饲粮参照《肉羊饲养标准》(NY/T 816—2004)配制,饲粮组成及营养水平见表 1。饲粮营养水平检测方法参考谢明欣等[10]。试验动物单笼饲养,自由采食饮水,每天08:00和18:00分别等量饲喂1次,每次饲喂量0.6 kg。
复合益生菌由酿酒酵母1号、克鲁斯假丝酵母、东方伊萨酵母、酿酒酵母3号、热带假丝酵母2号、枯草芽孢杆菌组成,均来源于内蒙古农业大学。
根据课题组前期研究人员的试验结果[8-9],将冻存的5株酵母菌和1株芽孢杆菌分别活化扩繁后,保证每毫升菌液中有活菌数1.1×109~1.4×109 CFU,然后按照1 : 1的比例混合配制成复合益生菌液,然后3 000 r/min离心,弃上清,用生理盐水溶解剩余菌体,并于试验期加入精料中混匀饲喂试验绵羊,添加量按照活菌数7×109~8×109 CFU/d投喂。
1.4 样品采集及微生物基因组DNA的提取分别于试验正试期的第1、10和20天晨饲前采集瘤胃液样品,每次连续采集3 d,并加入0.5倍瘤胃液体积的磷酸盐缓冲液(PBS),冰上振荡20 s,然后用4层纱布过滤,将滤液1 000 r/min 4 ℃离心10 min,取上清液分装冻于-80 ℃保存,用QLAamp® Fast DNA Stool Mini kit试剂盒提取微生物基因组DNA,并用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量和完整性。
1.5 聚合酶链式反应(PCR)扩增及质粒的制备 1.5.1 PCR扩增及目的片段的克隆引物序列见表 2,委托北京华大科技股份有限公司合成。
PCR反应体系为:DNA模板2 μL,上、下游引物各1 μL,DNA连接酶Mix 11 μL,ddH2O 10 μL。反应参数为:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,54~60 ℃退火40 s,72 ℃延伸40 s,35个循环;72 ℃ 5 min,4 ℃保存。产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果,用胶回收试剂盒回收目的片段,再用PMDTM19-T Vector Cloning Kit试剂盒进行载体连接克隆。
1.5.2 质粒的提取将克隆成功的载体转入Trans5α感受态细胞中,PCR检测菌液连接状况,并将连接成功的菌液送至北京华大基因科技公司进行测序,将序列正确的菌液,用质粒小提试剂盒(Aidlab)提取质粒DNA,作为标准品备用。
1.6 标准曲线的制备标准曲线制备参照吕莉华[20],拷贝数按以下公式计算:
待测样品的实时荧光定量PCR(qPCR)反应体系和环境条件与制作标准曲线时相同,均为25 μL体系。将待测样品全部稀释到50 ng/μL,96孔板上均含有稀释后的待测样品、阴性对照样品(ddH2O)和稀释到103的标准品,均做3个重复,将所得阈值循环数(Cp值)带入标准曲线获得DNA稀释后的拷贝数,再用以下拷贝数公式[21]计算每毫升瘤胃液中所含微生物的数量。
式中:MQ为根据标准曲线计算所得的DNA稀释后的拷贝数(copies);C为样品DNA浓度(ng/μL);VD为提取基因组DNA的ddH2O体积(μL);S为qPCR DNA的量(ng);V为提取DNA时所用瘤胃液的体积(mL)。
1.8 数据统计试验数据用Excel 2016初步整理,采用SPSS 17.0软件对数据进行正态分布检验,数据服从正态分布后,用SAS 9.0软件的GLM模型进行两因素方差分析,并用Duncan氏法进行多重比较,以P < 0.05表示差异显著,结果以平均值和均值标准误的形式表示。
2 结果与分析 2.1 质粒构建验证通过将送检的菌液测序结果与BLAST数据库中的目的片段序列进行比对,发现总细菌、总厌氧真菌、产琥珀酸拟状杆菌、白色链球菌、黄色链球菌、总产甲烷菌、短普雷沃氏菌、牛链球菌、乳酸杆菌、反刍兽新月形单胞菌、嗜淀粉瘤胃球菌和溶纤维丁酸弧菌的序列同源性均在98%~100%,且检测的菌液测序结果包含完整的引物序列,成功构建了有目的片段的质粒,可用于制作标准品。
2.2 标准曲线以标准品浓度的常用对数(lg)为横坐标,Cp值为纵坐标绘制标准曲线:总细菌、总厌氧真菌、产琥珀酸拟状杆菌、白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌、乳酸杆菌、牛链球菌、溶纤维丁酸弧菌、反刍兽新月形菌单胞菌、总产甲烷菌、嗜淀粉瘤胃杆菌、短普雷沃氏菌的qPCR标准曲线方程分别为y=-3.886lg(X)+62.18、y=-3.135lg(X)+53.42、y=-3.529lg(X)+59.26、y=-3.846lg(X)+66.17、y=-3.693lg(X)+60.22、y=-3.198lg(X)+53.51、y=-3.795lg(X)+61.22、y=-3.792lg(X)+59.47、y=-3.769lg(X)+62.50、y=-3.632lg(X)+58.04、y=-3.723lg(X)+60.30、y=-3.890lg(X)+61.46,且所有的R2值均在0.98以上,扩增效率在90.35%~104.20%,符合qPCR标准曲线要求,且模板拷贝数的对数与Cp值之间均呈较好的线性关系。
2.3 不同精粗比饲粮条件下复合益生菌对绵羊瘤胃中总细菌和总厌氧真菌数量的影响由表 3可知,不同饲粮精粗比对绵羊瘤胃中的总厌氧真菌数量影响显著(P < 0.05),复合益生菌作用时间对绵羊瘤胃中的总厌氧真菌和细菌数量影响不显著(P>0.05),饲粮精粗比和复合益生菌作用时间互作,但并未显著改变绵羊瘤胃内总细菌和总厌氧真菌的数量(P>0.05)。
由表 4可见,饲粮精粗比和复合益生菌作用时间对绵羊瘤胃中的牛链球菌的数量没有显著差异(P>0.05),但对乳酸杆菌数量影响趋于显著(P=0.070 5,P=0.056 9)。
由表 5可知,饲粮精粗比为3 : 7的瘤胃中反刍兽新月形单胞菌、嗜淀粉瘤胃球菌和溶纤维丁酸弧菌的数量均显著低于精粗比7 : 3饲粮(P < 0.05)。随着饲粮中添加的复合益生菌作用时间的延长,绵羊瘤胃中的乳酸利用菌数量呈现增加趋势,饲喂20 d时瘤胃反刍兽新月形单胞菌和嗜淀粉瘤胃球菌数量显著高于饲喂10 d时的数量(P < 0.05),嗜淀粉瘤胃球菌和溶纤维丁酸弧菌数量显著高于饲喂1 d时的数量(P < 0.05)。当绵羊采食精粗比3 : 7的饲粮时,复合益生菌饲喂20 d可以显著增加瘤胃中反刍兽新月形单胞菌和溶纤维丁酸弧菌的数量(P < 0.05);当绵羊采食精粗比7 : 3的饲粮时,瘤胃中反刍兽新月形单胞菌的数量呈现先下降后上升趋势,复合益生菌饲喂10 d时,反刍兽新月形单胞菌的数量显著低于饲喂1 d的数量(P < 0.05)。
由表 6可见,随着复合益生菌作用时间的增加,绵羊瘤胃中产琥珀酸拟状杆菌的数量逐渐增加,饲喂20 d时数量最大且显著高于饲喂1和10 d的数量(P < 0.05)。白色瘤胃球菌的数量呈先下降后上升趋势,饲喂20 d时数量最大,显著高于饲喂10 d的数量(P < 0.05)。当绵羊采食精粗比3 : 7的饲粮时,复合益生菌饲喂20 d可以显著增加绵羊瘤胃中白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌的数量(P < 0.05);绵羊采食精粗比7 : 3的饲粮时,随着复合益生菌作用时间的增加,绵羊瘤胃中的白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌的数量呈先下降后上升趋势,且白色瘤胃球菌的数量饲喂1 d>20 d>10 d,差异显著(P < 0.05)。
由表 7可见,绵羊采食精粗比3 : 7的饲粮时,瘤胃中总产甲烷菌的数量显著低于精粗比7 : 3的饲粮(P < 0.05)。与复合益生菌饲喂1和10 d相比,饲喂20 d可以显著提高绵羊瘤胃中总产甲烷菌的数量(P < 0.05)。当绵羊采食精粗比3 : 7的饲粮时,随着复合益生菌作用时间的增加,绵羊瘤胃中总产甲烷菌的数量逐渐上升,且饲喂20 d时绵羊瘤胃中的总产甲烷菌数量显著高于饲喂1和10 d的数量(P < 0.05);当绵羊采食精粗比7 : 3的饲粮时,绵羊瘤胃中总产甲烷菌的数量先下降后上升,且饲喂10 d复合益生菌的绵羊瘤胃中的总产甲烷菌的数量显著低于饲喂1和20 d的数量(P < 0.05)。
动物胃肠道中微生物菌群失去平衡会影响消化道的正常功能,会加快胃肠道中病原微生物的生长繁殖,引起疾病并降低动物的生长性能[22]。益生素是一种无毒、安全的微生态制剂,具有促进动物快速生长[23-24]、提高动物生产性能、提高免疫功能[25]、防御疾病[26]和改善养殖环境等作用[27]。虽然对于单一的益生菌已经研究多年,但由于其功能的局限性,不能更全面完成对动物机体的调节,所以对复合益生菌展开深入的研究具有重要意义。付玉洁等[28]通过对抗生素导致菌群失调的小鼠灌胃3种益生菌,有效促进了菌群失调的小鼠生长,重建肠道菌群;Hu等[29]通过对哺乳期母猪饲喂0.2%的复合益生菌(枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌),发现0.2%的复合益生菌可以显著增加试验第3周母猪、未断奶仔猪第2、3、4周重量和试验期的平均日增重,还能显著减少断奶前仔猪体内的大肠杆菌数量。以上均证明了复合益生菌可以有效调节动物胃肠道内微生物菌群,抑制有害菌的生长。本试验初期,饲喂低精料饲粮(精粗比为3 : 7)的绵羊瘤胃液中乳酸利用菌(反刍兽新月形单胞菌和溶纤维丁酸弧菌)、纤维降解菌(白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌)和总产甲烷菌的数量显著低于饲喂高精料饲粮(精粗比为7 : 3),这与饲粮中易发酵碳水化合物的数量密切相关;复合益生菌饲喂10 d后,饲喂低精粗比饲粮的绵羊瘤胃中溶纤维丁酸弧菌和黄色瘤胃球菌数量显著升高,饲喂20 d后,除上述2种菌外,反刍兽新月形单胞菌、白色瘤胃球菌和总产甲烷菌数量也显著升高,这也证明了前人的研究结论。
乳酸产生菌和乳酸利用菌可以控制绵羊瘤胃内乳酸的数量,本试验中所用的复合益生菌包含有枯草芽孢杆菌,而枯草芽孢杆菌在益生菌制剂中常常以孢子的状态存在,当制剂进入动物肠道后,可以在短时间内复苏过来,消耗肠道中的氧气以及减弱氧化还原电势,创造出低氧或无氧的环境,可以使其他有益菌如乳酸菌、双歧杆菌和肠道球菌等更好地在肠道中生长和繁殖,抑制有害需氧菌的生长,从而调节胃肠道微生物平衡,利于营养物质的吸收,提高饲料利用率[22, 30-31]。赵效南等[32]给SPF鸡饲喂枯草芽孢杆菌,抑制了肠道中有害菌的生长,促进了有益菌的生长,显著增加了鸡盲肠中的微生物菌群多样性。而且试验所用复合益生菌中的酿酒酵母也有被大量研究者们证明能够改善动物肠道的菌群结构、调节动物肠道菌群平衡,提高动物对饲粮中的干物质、粗蛋白质、纤维素等营养物质的消化吸收,提高动物的生长性能。白永平等[33]在泌乳早期荷斯坦奶牛的基础饲粮中添加300 g/(d·头)的酿酒酵母培养物,显著提高了奶牛对干物质的采食量,显著增加了奶牛的产奶量和奶中的乳脂率。杨东吉等[34]向断奶仔猪饲粮中添加酿酒酵母培养物,提高了粗蛋白质、粗脂肪和磷表观消化率,改变了仔猪盲肠微生物优势菌群的丰度,有提高普雷沃氏菌属相对丰度的趋势,促进仔猪对饲粮中营养物质的吸收,进而显著增加了仔猪的平均日增重,降低了料重比。本试验将枯草芽孢杆菌和酿酒酵母结合饲喂绵羊发现,复合益生菌对牛链球菌和乳酸杆菌这2种主要的乳酸产生菌的数量没有显著影响,但对反刍兽新月形单胞菌和溶纤维丁酸弧菌这2种乳酸利用菌有显著的影响:复合益生菌在低精料饲粮条件下可以显著增加绵羊瘤胃中乳酸利用菌(反刍兽新月形单胞菌和溶纤维丁酸弧菌)的数量,且随着复合益生菌作用时间的增加,作用效果越显著;在高精料饲粮条件下,复合益生菌使绵羊瘤胃中反刍兽新月形单胞菌数量呈现先下降后上升的趋势,并未呈现当初设想调节乳酸利用菌群数量、缓解高精饲粮带来的潜在酸中毒的风险。本试验中,若只考虑饲喂复合益生菌时间长短的作用效果,可以看出绵羊饲喂20 d复合益生菌显著提高了乳酸利用菌(嗜淀粉瘤胃球菌和溶纤维丁酸弧菌)的数量,有利于饲粮中纤维素的利用和降低乳酸的累积。这也与李晓斌等[35]通过对3~6月龄的伊犁马补喂复合益生菌(枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌),发现复合益生菌可以促进马后肠道纤维降解菌和淀粉分解菌的建立,降低伊犁马粪中纤维和淀粉含量的研究结果相同。本试验绵羊瘤胃中纤维降解菌的数量变化也进一步证明了该结论:在低精料饲粮中复合益生菌显著增加了白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌的数量,在高精料饲粮中复合益生菌显著降低了白色瘤胃球菌的数量,使饲喂20 d时2组绵羊瘤胃中的白色瘤胃球菌数量均达到一致水平,表明在低精料饲粮中复合益生菌的作用效果快且效果显著;在高精料饲粮中复合益生菌的调节作用效果呈先上升再下降的趋势,与乳酸利用菌的作用规律相同。
大部分的纤维降解菌在降解纤维素的时候都会产生大量的氢气(H2),甲烷菌能够利用H2和二氧化碳(CO2)合成甲烷(CH4),当H2在瘤胃内大量积累的时候,会抑制纤维降解菌的降解速率。本试验中,产甲烷菌和纤维素降解菌数量的变化趋势是一样的,说明在绵羊饲粮中添加该复合益生菌保证瘤胃中纤维降解速率不会降低。
4 结论本试验条件下,在不同精粗比饲粮中添加相同的复合益生菌对有益菌群的影响趋势不同:在低精料饲粮条件下,饲喂10 d可显著提高绵羊瘤胃中溶纤维丁酸弧菌和黄色瘤胃球菌的数量,饲喂20 d后,除上述2种菌外,又显著提高了反刍兽新月形单胞菌、白色瘤胃球菌和总产甲烷菌的数量;在高精料饲粮条件下,饲喂10 d可显著降低绵羊瘤胃中白色瘤胃球菌、反刍兽新月形单胞菌和总产甲烷菌的数量,饲喂20 d后,上述微生物(除白色瘤胃球菌)数量又恢复到饲喂前的水平。从作用效果看,该复合益生菌在精粗比为3 : 7的饲粮中起到的益生作用较好。
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