我国是肉鸭养殖第一大国，2019年全国出栏商品肉鸭约44.3亿只，鸭肉约580万t，年生产总值接近1 400亿元，肉鸭养殖逐渐成为了我国畜牧业的重要支柱产业，对我国农民增收、脱贫发挥着不可替代的作用[1]。同时，近年来，肉鸭产业正在转型升级，从过去的水面养殖、半开放式地面平养逐渐转型升级为全封闭式网上养殖和立体多层笼养，标志着我国肉鸭现代化规模化养殖已逐步形成。据中国饲料工业协会统计，2019年我国肉禽饲料产量为8 464.8万t，同比增长21.0%，其中肉鸭饲料增长25.2%，肉鸭饲料产量接近3 500万t，由此可见，我国肉鸭健康养殖及肉鸭饲料产业发展空间巨大。现代育种工作关注于肉鸭的体增重和饲料转化率，对肉鸭的骨骼健康关注较少，这种不均衡的选择导致肉鸭体重增加和骨骼生长钙化失衡[2]，使集约化养殖条件下的肉鸭易发生如腹水、呼吸系统疾病、胫骨软骨发育不良(TD)等。据估计，快大型商品肉鸭1~21日龄和22~42日龄腿病的发生率分别约为14%和21%[3]，造成了极大的经济损失，严重制约了肉鸭的健康高效养殖。
我国鸭肉产品的消费具有明显的地域特色，如北方地区以消费“烤鸭”和“烧鸭”为主，需要肉鸭沉积较多的体脂肪，而西南地区鸭肉产品的消费以“卤鸭”和“老鸭汤”为主，需要肉鸭饲养时间长、体重适中、体脂沉积低等。因此，西南地区肉鸭养殖形成了一种新的模式，即大型肉鸭优质化生产模式，俗称“吊白鸭”模式，其特点是以快大型肉鸭品种为主，饲养时间延长至49~53日龄出栏，同时出栏体重控制在2.5 kg左右，用手触摸胸骨钙化程度高，料重比在2.6~3.0，其肉品质更适合卤制加工。因此，近年来，四川农业大学家禽营养团队围绕肉鸭胫骨和胸骨发育与钙化规律及其营养调控开展了大量研究工作，现将本团队的研究工作及他人相关类似研究结果综述如下。
1 肉鸭骨骼生长发育及钙化规律 1.1 骨骼的生长发育、钙化与重建 1.1.1 骨骼的生长发育从宏观的角度来看，骨骼的生长发育是指骨形态和维度的变化，即长度和宽度的增加。骨骼绝对重量和相对于体重的百分比均是衡量骨骼生长发育及质量的重要指标[4]。从微观的角度来看，长骨末端的纵向生长遵循软骨成骨的模式，即软骨细胞成熟，然后骨化从软骨中心(骨干)开始，向两端(骨骺)扩展；在这个过程中，软骨细胞表型从表达Ⅱ型胶原蛋白(Coll-Ⅱ)和Ⅸ型胶原蛋白(Coll-Ⅸ)的圆形未成熟增殖细胞转变为平行排列的扁平化细胞，最终转变为表达Ⅹ型胶原蛋白(Coll-Ⅹ)的肥大细胞；当肥大细胞被骨细胞替代时，钙化骨主要表达Ⅰ型胶原蛋白(Coll-Ⅰ)[5]。因此，胶原蛋白类型也是评估骨骼生长发育的关键指标。因生长板(growth plate)是骨骼生长的关键来源，其宽度和厚度的变化受生化信号通路的控制，其中甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroid hormone-related protein, PTHrP)和Indian hedgehog(IHH)系统是最为人们所熟悉；IHH是由增生前期的软骨细胞产生，它可以刺激未成熟软骨细胞向扁平的软骨细胞转化，然后再向肥大的软骨细胞转化，从而有利于软骨在骨干中被骨替代；同时，IHH还可刺激关节周围软骨细胞产生PTHrP，而PTHrP又可抑制IHH的产生，延缓骨骺中未成熟软骨细胞的分化，提示IHH-PTHrP形成负反馈环，维持生长板中未成熟软骨细胞的协调分化[6]。由此可见，生长板的发育及形态也是衡量骨骼生长发育的重要指标。
1.1.2 骨骼的钙化骨的钙化过程也是骨的矿化过程。骨矿化是指矿物质(主要是羟基磷灰石形状的钙和磷)在成骨细胞内外沉积的过程。矿化是骨骼达到硬度和刚度的必要步骤，通过促进骨灰分、强度和密度的增加，使骨骼抵抗重力和机械负荷；松质骨也相应地增加骨体积与组织体积的比值(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb. Th)和骨小梁数目(Tb. N)，减小骨小梁间距即骨小梁分离度(Tb. Sp)[7]。
骨矿化一般可分为2个阶段：1)成骨细胞或软骨细胞分泌多种基质蛋白，释放基质小泡(MVs)形成类骨，MVs中首先形成羟基磷灰石晶体；2)羟基磷灰石晶体从囊泡中生长出来形成钙化结节，通过聚集羟基磷灰石晶体而变得更大，之后矿化沿着Coll-Ⅰ进行[8]。MVs含有一些与钙、磷转运密切相关的蛋白，如膜联蛋白、钙结合蛋白、钠依赖性磷转运蛋白，它们促进MVs吸收钙和磷；此外，MVs中的一些酶被认为与MVs及其周围的矿化作用密切相关，包括核苷焦磷酸酯酶(nucleoside pyrophosphate phosphoesterase，NPP)、磷酸化乙醇/磷酸胆碱磷酸酶(phosphorylated ethanol/phosphocholine phosphatase，PHOSPHO1)、组织非特异性碱性磷酸酶(tissue non-specific alkaline phosphatase，TNAP)等；PHOSPHO1在MVs内将磷氨基乙醇和磷酸胆碱转化为有机磷；NPP也被MVs膜固定，并催化胞外核苷三磷酸(如ATP)水解以释放焦磷酸盐(PPi)——一种众所周知的羟基磷灰石晶体生长抑制剂；而TNAP是软骨细胞肥大的标志物和软骨钙化的指示物，可水解PPi并提供无机磷酸盐(Pi)促进矿化[9]。
在骨矿化过程中，由于细胞外焦磷酸盐阻碍了羟基磷灰石的形成，抑制了硬组织的矿化，因此Pi和PPi的比值(Pi/PPi)在骨矿化中起着极其重要的作用[10]。低Pi/PPi导致矿化抑制，而高Pi/PPi促进矿化。此外，成骨细胞分泌的各种基质蛋白也在这一过程中发挥重要作用，包括骨结合蛋白、骨钙素、骨唾液蛋白、骨桥蛋白和蛋白多糖等。骨结合蛋白作为成骨细胞分化成熟的标志蛋白，与钙有很强的亲和力，可能与钙在骨和肾小管中的转运、沉积和排泄有关[11]；骨钙素是由成骨细胞合成和分泌的，可以作为连接羟基磷灰石和Coll-Ⅰ的桥梁，从而调节羟基磷灰石的生长[12]；骨唾液蛋白是一种矿化组织特异性蛋白，在成熟成骨细胞中表达，是成骨细胞分化的晚期标志物，能促进钙在MVs中的沉积，与Pi结合形成羟基磷灰石，并通过促进钙的沉积进而与Pi结合来启动矿化过程[13]。
1.1.3 骨骼的重建骨重建在骨组织中不断发生，以协调生长和适应整个生命周期中的机械负荷，该过程涉及到骨形成和骨吸收的动态调控；骨重建的不平衡促使骨代谢偏向骨形成时，骨异常增加，如骨硬化症；若不平衡导致骨吸收增加，导致骨丢失，如骨质疏松症[14]。成骨细胞是与骨形成相关的原代细胞，在用最终矿化的新类骨完全替代移除的骨中发挥着关键作用；在这种情况下，成骨细胞被羟基磷灰石包围，并达到其分化终点，转变为骨细胞表型，该过程受磷酸盐调节内肽酶同系物x-连接(endopeptidase homolog x-linked，Phex)、牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1，Dmp1)和硬化蛋白(sclerostin，Sost)基因的调控[15]。而破骨细胞通过分泌蛋白酶和氢离子来负责骨吸收，该过程受液泡H+-ATP酶(V-ATP酶)和组织蛋白酶K(cathepsin K)的调节[16]。虽然骨重建受多种内源性和外源性因素的调控，但主要是通过核因子-κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)/RANK配体(RANK ligand，RANKL)/骨保护素(osteoprotegerin，OPG)途径来调节，其中RANKL与RANK结合以诱导破骨细胞前体细胞的分化和融合，随后促进骨吸收，而OPG通过阻断RANKL和RANK的相互作用充当诱饵受体[17]。已知影响RANK/RANKL/OPG途径的各种局部和全身因素，包括转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、骨形态发生蛋白(bone morphogenic proteins，BMP)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等细胞因子，以及甲状旁腺激素(PTH)、维生素D和雌激素等激素[18]；此外，还涉及外源因素，特别是机械负荷和营养因素。骨细胞通过诱导骨合成代谢信号(包括一氧化氮和前列腺素)来感知和响应机械刺激；在营养素中，钙和维生素D都是维持骨重建平衡的主要营养素[19-20]。
1.2 肉鸭骨骼生长发育及钙化规律四川农业大学家禽营养团队Zhang等[21-22]研究探讨了肉鸭1~56日龄胫骨和35~63日龄胸骨的生长发育及钙化规律，结果表明，肉鸭胫骨和胸骨生长发育存在不同步性，且胫骨的生长钙化早于胸骨。
1.2.1 肉鸭胫骨生长发育及钙化规律Zhang等[21]对肉鸭胫骨发育规律进行了深入地剖析，发现肉鸭体重和胫骨长度、宽度、灰分含量、密度和强度呈显著的正相关；通过非线性回归模型分析发现胫骨特性参数的拐点日龄均早于体重的拐点日龄；对体重和胫骨长度、宽度、脱脂重和强度数据进行log转换后进行线性拟合发现，胫骨长度、宽度、强度和脱脂重与体重的斜率分别为0.28、0.39、0.70和0.96。Allen等[23]研究发现，若胫骨特征参数与体重呈异速生长时，胫骨长度、宽度、强度和脱脂重与体重的期望斜率分别为0.33、0.33、0.67和1.00，而实际斜率分别为0.28、0.39、0.70和0.96。由此可见，肉鸭胫骨长度与体重呈负向的异速生长，而胫骨宽度与体重呈正向的异速生长；胫骨脱脂重和强度与体重呈等量的异速生长[24]，胫骨形态结构的变化可能是为了提高胫骨负重能力和适应肉鸭体重变化的结果。
胫骨在形态上除在横向和纵向增加外，为适应体重的增加和外界负荷的变化，胫骨也不断的进行骨的钙化和重建，其主要是无机矿物质在骨细胞周围的沉积，宏观上表现为骨量和灰分含量的增加，即胫骨的钙化过程[25]。作为骨矿物质含量的重要指标，灰分主要由钙和磷构成。Zhang等[21]进一步对肉鸭不同日龄胫骨脱脂重以及灰分、钙和磷含量进行检测发现，胫骨的脱脂重以及灰分、钙和磷含量在1~42日龄快速的增加，42日龄后逐渐进入到各自的平台期；采用Logistic和von Bertalanffy非线性回归模型分别对胫骨脱脂重和灰分含量进行的日龄函数拟合分析显示，肉鸭胫骨脱脂重和灰分含量的快速增长期均为1~42日龄，42日龄后接近其相应的渐近值。随着矿物质在骨组织中的不断沉积，矿物质在骨中的比重也逐渐增加，因而使骨的密度和强度增加[26]。同样，肉鸭胫骨密度和强度在1~42日龄随日龄的增加而增加，42日龄后趋于稳定；采用von Bertalanffy非线性模型对胫骨密度和强度进行拟合发现，肉鸭42日龄后胫骨密度和强度接近其极限值，分别为0.67 g/cm3和34.3 kg[21]。
1.2.2 肉鸭胸骨生长发育及钙化规律胸骨由胸骨体、胸骨喙、胸骨隆凸组成，它是一个扁平的骨头，垂直延伸到前胸廓中部的中间，为翼骨和龙骨状结构的连接提供锚。对于肉鸭而言，胸骨作为其呼吸系统，可影响气囊的体积和促进肺中空气单向流动，因此胸骨的发育和矿化可能对肉鸭呼吸系统的健康有重要影响。Zhang等[22]对肉鸭胸骨的形态(图 1)进行测定后发现，肉鸭胸骨宽度(即乌喙骨间距、胸骨中部宽、剑突宽和后侧突间距)在35~42日龄快速增加，42日龄后增加速度逐渐下降，然而，胸骨的长度和深度快速增加至49日龄，提示肉鸭胸骨的宽度进入发育平台期早于胸骨的长度和深度；而胸骨的脱脂重和密度均随日龄呈“S”型曲线生长，分别于49和56日龄趋于稳定，胸骨的脱脂重与密度转折点的不同可能源于胸骨组织中有机物和无机矿物基质比例的改变。
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Coracoid distance：胸骨乌喙骨突间距；Sternum central distance：胸骨中部间距；Posterior process distance：后侧突间距；Xiphoid wide：剑突宽；Sternum depth：胸骨深；Sternum length：胸骨长。 图 1 胸骨形态学测定示意图 Fig. 1 Schematic diagram of measurement of sternum morphometry[22] |
此外，除了脱脂重和密度外，骨的灰分含量也是评价骨骼质量的另一个重要指标。灰分含量的增加主要是通过矿物质在骨组织中的积累增加骨组织的硬度，用于承受体重和机械负重，该过程受动物日龄和性别的影响[27]。肉鸭胸骨也不例外，其钙化过程也受日龄的影响，胸骨灰分、钙和磷含量在42~49日龄迅速的增加，49日龄后进入平台期；但是，性别及性别与日龄的交互作用对胸骨灰分、钙和磷含量无显著影响[22]。上述结果提示，无论是公鸭还是母鸭，42~49日龄均可能为胸骨的快速钙化时期。
同时，Zhang等[22]研究还发现，血清中的碱性磷酸酶(ALP)活性随肉鸭日龄的增加以及胸骨和胫骨钙化进程逐渐降低，说明高活性的ALP是启动肉鸭胸骨和胫骨钙化所必需的。ALP和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)作为骨重建过程中重要的磷酸酶，分别负责骨的形成和吸收[28-29]。ALP是成骨细胞分泌的非胶原蛋白，可分解PPi为Pi，减少PPi对骨骼钙化的抑制作用，从而促进骨骼的钙化；ALP活性的降低也间接地说明大量的成骨细胞向骨细胞分化，从而促进骨骼的成熟[30]。而TRAP是破骨细胞在骨吸收过程中分解骨基质所必需的磷酸酶，血清中TRAP的活性被作为表征骨吸收的良好标志物；临床数据显示TRAP活性与骨密度呈负相关，并且骨质疏松症患者血清中TRAP活性显著高于健康人群[31]。
2 肉鸭骨骼发育及钙化的营养调控 2.1 矿物元素钙对大型肉鸭优质化生产条件下骨骼发育及钙化的调控因西南地区大型肉鸭优质化生产需要控制体重在2.5 kg左右，饲喂低营养浓度饲粮(low-nutrient density diet, LND)是控制肉鸭体重增加的常用营养策略。因此，在LND条件开展肉鸭胸骨发育及钙化的营养调控具有重要的生产意义。
钙作为重要的矿物质营养素，在家禽骨骼发育和钙化过程中起着重要的生物学作用。饲粮钙水平不足可显著降低肉鸡胫骨的灰分含量，充足的饲粮钙可促进肉鸡胫骨矿物质的沉积[32]。Zhang等[33-34]研究发现，饲喂含0.5%钙的LND(15~35日龄，饲粮代谢能水平为11.01 MJ/kg，粗蛋白质含量为15.8%；36~56日龄，饲粮代谢能水平为10.26 MJ/kg，粗蛋白质含量为13.4%)显著降低了肉鸭胫骨灰分和钙、磷含量，增加了肉鸭胫骨TD的发生率；相对于0.5%的钙，0.7%~1.1%的钙可显著增加肉鸭胸骨的钙化比，并增加胸骨的矿物质沉积和密度，表明饲粮钙水平除了影响胫骨发育及质量外，还可影响胸骨的钙化；进一步对骨微观计量学进行分析发现，相对于含0.5%钙的LND组，含0.7%、0.9%和1.1%钙的LND组肉鸭胫骨和胸骨骨髓腔内有大量整齐和结构完整的骨小梁填充；饲喂含0.5%钙的LND显著降低了肉鸭胫骨和胸骨BV/TV和Tb.N，并显著增加了骨Tb.Sp；胸骨骨量的降低可能与含0.5%钙的LND导致钙摄入不足有关；血清生化结果显示，相比于含0.5%钙的LND，含0.7%~1.1%钙的LND可显著提高肉鸭血清中钙浓度，并且含0.5%钙的LND显著提高了血清中PTH和维生素D3的浓度，表明含0.5%钙的LND导致肉鸭发生了低血钙症，反馈性增加PTH和维生素D3的浓度来刺激肠道或者肾脏对钙进行吸收。
Zhang等[34]进一步研究发现，0.7%~1.1%钙的LND组肉鸭胸骨和胫骨中Dmp1和Sost表达水平较高暗示大量的成骨细胞演变为骨细胞，即饲喂含0.7%~1.1%钙的LND可促进肉鸭胸骨和胫骨的钙化，增加骨量。骨量的增加可能源于钙对骨形成过程的促进或者对骨吸收过程的抑制[35]。BMP-2和runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)也是调控成骨细胞增殖的重要因子，与成骨细胞的增殖密切相关。研究显示，钙能够上调卵巢切除大鼠胫骨或者骨髓间充质干细胞(BM-MSC)BMP-2和Runx2的表达，从而诱导成骨细胞相关特异性基因的转录，包括骨保护素(OC)[36]。然而，Zhang等[33]研究发现，含0.7%~1.1%钙的LND降低肉鸭血清中BMP-2的浓度及胫骨组织Runx2、ALP和OC mRNA的表达，表明含0.7%~1.1%钙的LND通过抑制BMP-2/Runx2途径降低成骨细胞的增殖分化。An等[37]研究也发现1.8~16.2 mmol/L钙可显著抑制人牙髓细胞Runx2和ALP mRNA的表达。以上结果提示，含0.7%~1.1%钙的LND增加肉鸭胫骨和胸骨的骨量可能不是通过增加骨形成来实现的。
前文提到，破骨细胞是哺乳动物骨组织中负责骨吸收的唯一细胞，它通过分泌蛋白酶和H+去溶解骨基质中的有机物和羟基磷灰石，高活性的V-ATP酶和组织蛋白酶K可作为衡量骨吸收增强的重要指标[16]。Zhang等[33-34]研究发现，相对于含0.5%钙的LND组，含0.7%~1.1%钙的LND降低了肉鸭胫骨组织V-ATP酶和组织蛋白酶K mRNA的表达水平，显著降低胫骨和胸骨骨小梁周围的破骨细胞数量，还显著降低了肉鸭血清中TRAP的活性和骨组织中RANK mRNA的表达水平，并显著上调了骨组织中OPG mRNA的表达水平。研究显示，高浓度的钙可显著降低小鼠骨髓细胞组织蛋白酶K的表达水平和切除卵巢鼠胫骨RANK的表达水平，显著上调切除卵巢鼠胫骨OPG的表达水平[38]。以上结果提示，含0.7%~1.1%钙的LND可通过抑制RANKL/RANK/OPG途径抑制破骨细胞的增殖分化，从而降低肉鸭胫骨和胸骨的骨吸收过程，提高胫骨和胸骨的质量。
2.2 矿物元素钙对短喙侏儒综合征肉鸭骨骼发育及质量的调控近年来，肉鸭因感染新型鹅细小病毒(NGPV)导致短喙侏儒综合征发生率较高，表现为急性传染，发病率和死亡率都非常高，被感染后存活下来的肉鸭表现出短喙与侏儒的症状，造成了重大的经济损失。田江波[39]利用NGPV建立樱桃谷肉鸭短喙侏儒综合征模型，研究钙的营养调控作用，研究发现，NGPV感染显著降低肉鸭胫骨鲜重、胫骨长、胫骨直径、胫骨强度、胫骨脱脂重、胫骨灰分、喙鲜重及喙脱脂重，显著增加肉鸭胫骨破骨细胞数量及胫骨生长板组织蛋白酶K基因的表达水平，并有降低鸭胫骨ALP和Runx2表达水平的趋势，表明NGPV通过增加破骨细胞数量及活性增加骨吸收来抑制骨骼生长；此时，增加饲粮钙水平可提高感染NGPV肉鸭胫骨长及灰分含量以及喙脱脂重，其主要与钙降低了胫骨破骨细胞数量和活性(如血清TRAP浓度下降)，增加了肠道钙、磷主动吸收[如肠道钙结合蛋白-D28K(calcium binding protein calbindin D-28K, CaBP-28K)、钠-磷共转运蛋白Ⅱb(type Ⅱb sodium-coupled phosphate, NaPi-Ⅱb)表达增加]有关，且感染NGPV肉鸭饲粮适宜钙水平为：1~14日龄，1.15%；15~35日龄，1.10%。
2.3 维生素对肉鸭骨骼发育及钙化的调控 2.3.1 复合维生素水平对肉鸭骨骼发育及钙化的调控维生素作为重要的营养素，对骨骼健康有显著影响，如维生素K[40]和维生素E[41]可下调RANKL的表达，降低炎性因子水平，抑制破骨细胞的增殖分化；维生素D[42]可增加肠道和肾脏对钙和磷的吸收，促进骨的形成和钙化等。对肉鸭而言，目前所使用的维生素水平常常参照NRC(1994)推荐水平(低)、中国《肉鸭饲养标准》(NY/T 2122—2012)推荐水平(中)、英国樱桃谷农场推荐水平(CVF，2001)(中)以及DSM公司推荐水平(DSM, 2016)(高)。Zhang等[43]研究了饲粮高、中、低复合维生素水平对肉鸭胸骨钙化的影响，结果发现，相对于低维生素水平，高维生素水平可增加胸骨的脱脂重、密度、灰分、钙和磷水平，表明饲喂高维生素水平饲粮可促进肉鸭胸骨钙化。对饲粮中维生素水平的分析发现，相对于低维生素水平饲粮，中、高维生素水平饲粮中维生素D3、维生素K和维生素E水平增加幅度最大，在中、高维生素水平饲粮中增加倍数分别为9.43和17.86倍(维生素D3)、7.64和14.29倍(维生素E)、6.21和11.43倍(维生素K)；B族维生素中的维生素B1、维生素B12、叶酸和生物素在低维生素水平饲粮中无添加，在中、高维生素水平饲粮中分别添加1.5和3.0 mg/kg维生素B1、0.02和0.04 mg/kg维生素B12、1和2 mg/kg叶酸、0.125和0.250 mg/kg叶酸。研究证实，B族维生素也是一种很有潜力的抗骨质疏松预防剂，如维生素B12和叶酸，它们能改善骨骼的微观结构，降低骨骼的脆性[44]。因此，针对肉鸭骨骼发育及钙化而言，其复合维生素的合理配伍值得进一步关注。
2.3.2 不同维生素组合对大型肉鸭优质化生产条件下骨骼发育及钙化的调控Zhang等[45]为探讨营养限饲条件下不同维生素组合的效果，采用2×4+1试验设计进一步比较了低营养水平饲粮分别按照NRC(1994)、中国《肉鸭饲养标准》(NY/T 2122—2012)、英国樱桃谷农场(CVF, 2001)和DSM公司(DSM, 2016)推荐的维生素水平添加4种不同复合维生素以及是否添加25-OH-D3对肉鸭骨骼发育及钙化的影响，结果发现，在LND条件下，相比于NRC(1994)，NY/T 2122—2012推荐的维生素水平可显著提高肉鸭胫骨和胸骨矿物质沉积；同时，NY/T 2122—2012推荐的维生素水平降低了血清中骨形成标志物[ALP和Ⅰ型胶原氨基末端肽(aminoterminal propeptide of type Ⅰ collagen，P1NP)]和骨吸收标志物[TRAP和Ⅰ型胶原C端肽(C-terminal telopeptide of type Ⅰ collagen, CTx)]的浓度。上述结果表明，NY/T 2122—2012推荐的维生素水平降低了肉鸭胸骨的骨转换率，从而增加了胫骨和胸骨的骨量[46]；同时也表明，在LND条件下因采食量增加导致维生素摄入量增加，NY/T 2122—2012推荐的维生素水平已可满足肉鸭骨骼发育及钙化的需要，即大型肉鸭优质化生产条件下，利用营养水平限饲时，维生素水平可采用NY/T 2122—2012推荐的维生素需要量。
2.3.3 25-OH-D3对肉鸭骨骼发育及钙化的调控25-OH-D3是维生素D在机体内的主要活性和储存形式[47]。Bar等[48]指出25-OH-D3和维生素D3均能被禽类肠道所吸收；雏鸡对25-OH-D3的吸收率(74.9%)高于维生素D3(66.5%)，且在肉鸡生长过程中，25-OH-D3在提高骨灰分含量上的效果优于维生素D3[49]。Zhang等[50]研究发现，饲粮添加0.069 mg/kg 25-OH-D3可显著增加肉鸭胫骨脱脂重、矿物质沉积和密度以及BV/TV和Tb.N，并显著降低Tb.Sp；类似的，25-OH-D3也可显著促进肉鸭胸骨矿物质沉积和密度，显著增加胸骨BV/TV和Tb.N，并显著降低Tb.Sp。骨密度和骨小梁的微结构与骨骼的强度密切相关[51]，表明饲粮25-OH-D3在改善肉鸭骨小梁结构和增加骨密度的同时增加了肉鸭骨骼的强度。
此外，田江波[39]研究发现，饲粮添加0.069 mg/kg 25-OH-D3显著增加了感染NGPV肉鸭胫骨长和胫骨磷含量，改善了胫骨质量，其作用机制与25-OH-D3促进了肾脏瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员6(transient receptor potential cation channel subfamily V member 6, TRPV6)、CaBP-28K和NaPi-Ⅱa基因的表达有关，即与25-OH-D3可调控肾脏对钙、磷的重吸收有关。
维生素D对骨骼的作用主要是通过：1)调控钙和磷的吸收[52]；2)直接作用于骨骼细胞，调控骨的稳态[53]；3)调控机体内分泌系统[54]、免疫系统、氧化应激和肠道微生物等影响骨代谢[55]。维生素D3作为调控血清钙和磷稳态的重要因子，其主要作用是调控肠道或者肾脏对钙和磷的吸收；在发生低血钙症状时，维生素D3与其受体结合刺激肠道或者肾脏对钙的吸收，同时也同PTH产生协调作用，动用骨骼中的钙来维持血清钙的稳态[56]。研究发现，饲粮添加25-OH-D3可增加肉鸭血清中总维生素D3和钙的浓度，血清钙浓度增加提示25-OH-D3可增加肠道或者肾脏对钙的吸收，从而促进肉鸭骨骼的发育及钙化[45]。
Richy等[57]认为，维生素D3可抑制骨的吸收，增加骨密度，可作为骨质疏松症治疗剂；但也有体内和体外的研究结果显示维生素D3可促进骨的吸收，降低骨量[58]。Zhang等[50]进一步研究发现，正常营养水平饲粮添加25-OH-D3可显著降低肉鸭血清中骨吸收标志物TRAP的活性和CTx的浓度，表明肉鸭饲粮中添加25-OH-D3提高胫骨和胸骨的骨量可能是通过抑制骨的吸收实现的；通过分析骨代谢相关基因表达发现，25-OH-D3可显著上调肉鸭胫骨OPG mRNA的表达水平，降低RANKL/OPG的比值，从而降低破骨细胞的数量；同时，25-OH-D3可下调肉鸭胫骨中H+-ATP酶和组织蛋白酶K mRNA的表达水平，表明25-OH-D3可有效抑制破骨细胞的活性。以上研究结果提示，25-OH-D3可通过抑制骨的吸收来提高肉鸭胫骨和胸骨的骨量。
3 肉鸭肠骨轴的营养调控 3.1 肠骨轴的概念及研究进展肠道微生物区系是动物体内稳态的重要调节因子，包括肠内和肠外效应。有学者提出了肠骨轴的概念，并将其定义为肠道微生物或它们产生合成的分子对骨骼健康的影响[59]。研究表明，肠道菌群与机体能量代谢、免疫系统发育以及骨重建等生理过程密切相关，肠道菌群通过调节破骨细胞和成骨细胞，影响机体的骨代谢平衡[60]。Mccabe等[61]对14周龄的C57Bl/6J雄性小鼠进行了为期4周罗伊乳杆菌处理，发现小鼠股骨骨小梁的骨体积分数增加，骨矿物质含量、骨密度以及骨小梁数量、厚度、面积增加，并且腰椎骨小梁也有类似的变化。Abdelqader等[62]在蛋鸡饲粮中添加枯草芽孢杆菌，饲喂6周后发现蛋鸡的产蛋性能和蛋壳硬度提高，且胫骨骨密度和灰分含量显著提高。Mutuş等[63]研究报道，在肉鸡饲粮中添加地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌可有效提高肉鸡的胫骨厚度。
较早在无菌小鼠的研究中发现，肠道菌群因增加骨吸收而不利于骨骼生长发育[64]，但是近年来的研究表明，肠道菌群可刺激骨形成。Schwarzer等[65]对8周龄无菌BALB/c雄性小鼠进行的研究发现，无菌小鼠股骨长度较短、骨皮质较薄、骨密度较低、小梁体积较小，且雄性BALB/c小鼠对骨合成代谢因子胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)的敏感性较高。Yan等[66]也发现正常肠道菌群定植提高了无菌小鼠的骨形成率和股骨长度，并增加了IGF-1和骨形成血清标志物P1NP的浓度，因此，推测肠道菌群可能通过IGF-1来刺激骨形成；同时，该研究还发现，肠道菌群代谢产物短链脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)可以促进骨形成。由于SCFAs受体在不同骨细胞类型上的表达尚未见报道，肠道菌群是否通过SCFAs受体来刺激骨重构尚不清楚，但用高效液相色谱法测定骨髓和血清中SCFAs的浓度时发现浓度低于检测值；由于血清和骨髓中SCFAs浓度极低，说明SCFAs可能主要通过间接机制来调控骨代谢[67]。
3.2 磷对肉鸭肠道微生物和骨骼发育的调控Shapiro等[68]研究指出，磷对于骨骼的发育较钙更为重要，磷对骨骼灰分重量的影响是钙的6倍。代述均[69]研究发现，饲粮非植酸磷(non-phytate phosphorus, NPP)水平显著影响肉鸭胫骨强度、脱脂重、长度、直径、密度以及胫骨中钙的含量；低磷饲粮(0.22% NPP)显著增加血液中ALP的活性，血液中的ALP主要是由骨骼和肝脏合成分泌，机体磷缺乏时ALP活性显著增加，表明机体骨代谢发生障碍与病变；胫骨组织苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色结果显示，低磷饲粮(0.22% NPP)组胫骨骨髓中细胞成分严重减少，骨小梁小部分钙化；胫骨TRAP与Masson染色结果发现，胫骨组织中破骨细胞数量随饲粮NPP水平降低而升高，说明低磷饲粮(0.22% NPP)使破骨细胞的数量及活性增加，导致胫骨的骨吸收大于骨形成，从而使胫骨的发育与质量下降。刘海霞等[70]在体外培养番鸭破骨细胞的试验中发现，相比对照组，磷的增加会抑制破骨细胞的生成与骨吸收的活性，但是随着磷浓度的增大，破骨细胞的数量会随之降低。代述均[69]进一步分析骨代谢相关基因表达发现，饲粮NPP水平对肉鸭胫骨中Runx2与骨钙蛋白(bone-carboxyglutamate protein, BGP)基因的相对表达量无显著影响，但胫骨中成纤维生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1)的表达量随着饲粮NPP水平的升高呈线性降低。有研究指出，FGFR1主要是抑制成熟成骨细胞矿化作用[71]，表明低磷组成骨细胞矿化作用受到抑制，破骨细胞活性大于成骨细胞，导致低磷组肉鸭胫骨发育不良。
因肠道负责钙、磷及微量元素等营养素的吸收，低磷饲粮导致肉鸭胫骨发育不良及质量下降的一个可能原因是低磷饲粮导致了肠道消化吸收功能下降。代述均[69]研究发现，饲粮0.46% NPP组肉鸭十二指肠肠道微绒毛轮廓清晰分明、结构层完整，肠道整体的物理性结构较0.22% NPP组完整，结果提示，低磷饲粮导致肉鸭肠道物理形态学结构受到一定程度的损伤，与代谢试验结果一致，即饲粮NPP水平低于0.34%显著降低了肉鸭对饲粮中干物质、蛋白质、能量以及钙、磷的利用率。Rhoads等[72]研究指出，Na+-K+-ATP酶的活性可间接反映肠道黏膜的吸收功能，磷主动吸收需要ATP提供能量。Xu等[73]研究发现，增加饲粮NPP水平线性降低了肉鸭空肠Na+-K+-ATP酶的活性，表明低磷组由于磷的摄入不足，肠道消化吸收功能下降，机体为了自身需求主动提高Na+-K+-ATP酶的活性，以提高营养物质消化吸收效率来弥补机体关键营养素的缺乏。同时，磷以磷酸氢根(HPO42-)和磷酸二氢根(H2PO4-)等离子的形式在消化道中经主动吸收或自由扩散被肉鸭所利用，主动吸收不仅需要ATP供能，而且还需要Na-Pi-Ⅱb参与。有研究指出，磷吸收的分子机制与NaPi-Ⅱb基因表达有着密切的关系[74]。Xu等[73]研究发现，肉鸭十二指肠和空肠中NaPi-Ⅱb基因的相对表达水平随饲粮NPP水平的增加呈线性降低。以上研究结果表明，低磷饲粮导致肉鸭肠道钙、磷吸收和利用率下降，进而损伤胫骨发育及质量。
更为重要的是，Dai等[75]研究发现，低磷饲粮导致了肉鸭盲肠微生物菌群多样性及结构发生改变，微生物代谢产物SCFAs合成量下降。Heyer等[76]研究指出，磷对于机体后肠维持微生态区系的稳定、防御病原体入侵和改善机体免疫功能非常重要。磷缺乏可抑制猪体内纤维发酵，导致SCFAs合成量减少，这表明细菌降解纤维素酶的活性受周围介质中有效磷浓度的调控。Dai等[75]进一步分析发现，饲粮NPP水平影响了肉鸭盲肠微生物操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)数目与物种的丰富程度，且α-多样性指数均随饲粮NPP水平的增加呈线性降低；同时，分析发现，饲粮NPP水平显著影响了盲肠变形菌门(Proteobacteria)、产粪甾醇真杆菌(Eubacterium coprostanoligenes)、瘤胃球菌科UCG-014(Ruminococcaceae UCG-014)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)和毛螺菌科(Lachnospiraceae)的相对丰度。磷对细菌增殖、菌群结构和代谢过程非常重要，Durand等[77]研究指出，矿物元素中钙、磷对于大鼠、反刍动物微生物的发酵有很好的调节能力。Ptak等[78]研究发现，低钙、磷水平饲粮(1~14日龄，0.71%钙、0.269% NPP；15~42日龄：0.56%钙、0.189% NPP)降低了肉鸡回肠的总菌、产气荚膜梭菌、肠杆菌科和拟球梭菌的数量。Borda-Molina等[79]研究发现，在肉鸡饲粮添加磷可通过调控盲肠微生物来提高生长性能。Bovee-Oudenhoven等[80]在大鼠上研究发现，饲粮中的钙、磷能够通过改变回肠胆汁酸的组成保护肠道微生物区系，以抵抗沙门氏菌感染，缓解细胞的毒性。从以上研究结果可以看出，低磷饲粮导致的肉鸭胫骨发育不良和胫骨质量下降与肉鸭肠道消化吸收功能及盲肠微生物菌群之间存在密切相关，从宏观上证实了肠骨轴的存在。
3.3 抗性淀粉(resistant starch，RS)对肉鸭肠道微生物和骨骼发育的调控RS是指饲料原料中在体外2 h内不会被酶水解，在机体内不被小肠胰腺淀粉酶消化，进入后肠可被肠道微生物发酵的一种淀粉。RS根据其来源和酶解抗性可以分成4种类型：RS1型、RS2型、RS3型和RS4型[81]。RS属于植物性多糖，从功能上也被视作是一种膳食纤维。RS具有多种生理功能，可以降低血清中的胆固醇含量、调节肠道菌群、增加肠道SCFAs含量、降低肠道内的pH等，还可以有效预防Ⅱ型糖尿病、肥胖并发症、心血管疾病和结直肠癌等疾病的发生[82]。研究发现，饲粮中添加12%生马铃薯抗性淀粉(potato resistant starch，RPS)显著增加了肉鸭盲肠中乙酸、丙酸和丁酸的含量，并提高了肉鸭盲肠内厚壁菌门以及粪杆菌属、罕见小球菌属和Erysipelatoclostridium等产丁酸菌的相对丰度，从而改善了肉鸭的生产性能，降低了肉鸭体内的炎症反应[83-84]。
正如前面所言，肠道菌群与机体能量代谢、免疫系统发育以及骨重建等生理过程密切相关，肠道菌群通过调节破骨细胞和成骨细胞影响机体的骨代谢平衡[60]。Tousen等[85-87]以去卵巢(OVX)小鼠为模型研究了大豆苷元(daidzein，DZ)和RS联合使用，大豆异黄酮(isoflavone，ISO)和RS联合使用以及20%加酸水解的高支链玉米RS单独使用对骨质量的影响，结果发现，DZ或ISO和RS联合使用或单独使用RS均能增加OVX小鼠胫骨近端和胫骨中端的骨密度及股骨远端骨强度。徐慧敏[88]研究发现，饲粮添加12% RPS显著降低了采食低磷饲粮肉鸭血清钙、磷含量，显著提高了肉鸭胫骨直径、脱脂重、密度和灰分含量，表明RPS可促进骨发育，提升骨质量；该作者进一步分析盲肠微生物菌群结构发现，RPS显著提高了采食低磷饲粮肉鸭盲肠中拟杆菌门(Bacteroidetes)、迷踪菌门(Elusimicrobia)、罕见小球菌属和甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)的相对丰度，显著降低了肉鸭盲肠中螺杆菌属(Helicobacter)、理研菌科RC9肠道群(Rikenellaceae RC9 gut group)、理研菌属(Rikenella)和Barnesiella的相对丰度。
为进一步证实肠道微生物及其代谢产物对肉鸭胫骨发育及质量的调控作用，徐慧敏[88]利用抗生素(氨苄青霉素、新霉素、庆大霉素、甲硝唑和万古霉素)建立肉鸭肠道菌群紊乱模型，通过菌群移植研究发现，移植采食RPS肉鸭盲肠食糜可显著提高肉鸭盲肠丁酸含量以及回肠丙酸、丁酸含量，并显著提高肉鸭盲肠微生物中的放线菌门(Actinobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、拟杆菌属(Bacteroides)、YRC22以及产SCFAs菌双歧杆菌属(Bifidobacterium)、优杆菌属(Eubacterium)和琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)的相对丰度，显著降低了Proteobacteria和脱硫弧菌属(Desulfovibrio)的相对丰度；同时，显著降低了肉鸭血清ALP和CTx活性、胫骨近端组织骨小梁Tb.Sp和胫骨骨髓TNF-α和RANK mRNA表达水平，显著提高了肉鸭胫骨强度和灰分含量、胫骨近端软骨面积及骨小梁骨表面积(bone surface，BS)、骨表面积与骨体积比值(BS/BV)、Tb.Th和骨密度，有增加OPG mRNA表达水平的趋势；结果表明，肠道菌群及其代谢产物通过重塑肠道菌群稳态来降低采食低磷饲粮肉鸭胫骨破骨细胞的数量，抑制胫骨TNF-α和RANK基因的表达，上调OPG基因的表达来抑制胫骨内骨吸收作用，最终促进肉鸭胫骨发育，改善胫骨宏观或微观质量，TNF-α可能是肠骨轴潜在的信号分子。最近有研究表明，肠道微生物通过调整宿主免疫状态来调控骨骼的健康，其中炎性因子和骨髓T细胞是重要的肠骨轴信号分子[89]。但是，肠骨轴关键cross-talk信号分子及信号途径需要大量的研究去挖掘和证实。
4 小结综上所述，营养素、营养水平、营养来源等均可以通过影响骨骼的生长发育、钙化、周转代谢以及肠骨轴等来调控肉鸭骨骼健康。但因在家禽实际生产过程中，与骨健康相关的问题逐渐增多，也日益复杂，有很多问题还有待深入研究，营养调控理论和技术非常欠缺。继续系统深入开展家禽骨骼发育及质量的营养理论和技术的研究对于提高家禽福利及健康养殖，确保家禽产品品质具有重要的理论和实践价值。
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