良好的肠道机能是仔猪生长发育的基础,而健康的肠道菌群是维持仔猪机体有效免疫力和抗病能力的重要保障。仔猪断奶时,常常出现“断奶应激综合征”,表现为肠道绒毛萎缩、隐窝增生、上皮细胞受损及菌群结构失衡。研究表明,丙氨酰-谷氨酰胺(Ala-Gln)和甘露寡糖(MOS)在改善肠道环境上发挥着积极作用。在肠外营养液中附加3.0% Ala-Gln可以增加大鼠移植小肠黏膜上皮细胞的DNA含量,促进肠上皮细胞的分裂、增殖,并提高小肠黏膜厚度及绒毛高度/隐窝深度(V/C)[1]。草鱼饲粮中添加谷氨酰胺(Gln)替代品Ala-Gln可促进了肠道绒毛的发育,使绒毛密度增加,且黏膜厚度和杯状细胞数量有所升高[2]。研究发现,Ala-Gln主要是通过上调仔猪小肠上皮细胞间紧密连接蛋白的表达,促进细胞间紧密连接结构的形成[3],同时提高肠黏膜固有层免疫球蛋白A(IgA)浆细胞数量、黏膜分泌型免疫球蛋白A(SIgA)分泌量及白细胞介素(IL)含量[4],进而增强仔猪小肠黏膜的屏障功能和免疫功能。MOS作为一种绿色饲料添加剂,同样具有改善畜禽肠道健康的作用。在断奶仔猪饲粮中添加0.2%毕赤酵母甘露寡糖可以显著提高小肠绒毛高度[5],而0.1%甘露寡糖可以提高仔猪小肠双歧杆菌的数量[6]。MOS主要通过促进有益菌的增殖和抑制病原菌的黏附定植发挥其对仔猪肠道微生物菌群结构的改善作用[7]。但Ala-Gln和MOS组合使用,并发挥各自优势是否能够对仔猪肠道微生态结构起到更为积极的作用?目前尚无此类报道。因此,本研究旨在探讨Ala-Gln和MOS组合对断奶仔猪肠道形态和微生物菌群结构的影响,研究结果将为指导Ala-Gln和MOS在仔猪饲粮中的科学利用提供一定的理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料MOS购买于济南某化工有限公司,纯度≥99%;Ala-Gln购买于上海某化工有限公司,纯度≥99%。
1.2 试验设计及饲养管理试验选用体重相近的21日龄杜×长×大断奶仔猪162头,完全随机区组分为9个组,每组3个重复,每个重复6头仔猪。对照组饲喂基础饲粮,其他组饲喂在基础饲粮中分别添加0.10% MOS、0.20% MOS、0.15% Ala-Gln、0.30% Ala-Gln、0.10% MOS+0.15% Ala-Gln、0.20% MOS+0.15% Ala-Gln、0.10% MOS+0.30% Ala-Gln、0.20% MOS+0.30% Ala-Gln的试验饲粮。基础饲粮参照NRC(2012)和《猪饲养标准》(NY/T 65—2004)配制,其组成及营养水平见本课题组已发表文献[8]。
试验在江西某大型种猪场进行,试验猪在保育床上饲养,采用高床、漏缝塑料地板,水泥可移动式料槽。自由采食和饮水,每天投喂4~5次,免疫和驱虫程序按猪场常规同步进行,随时观察并记载仔猪采食和健康状况,试验期28 d。
1.3 样品采集及处理试验第14、28天08:00,从每个重复中随机选取1头体重接近平均体重的仔猪进行屠宰,沿腹部中线剖开腹腔,剪取十二指肠、回肠、空肠中段5 cm左右,用蒸馏水洗去肠道外食糜,然后用滤纸吸干水分,将肠道一端结扎后,置于4%甲醛溶液中固定1 d以上,用于制作石蜡切片;另剪取仔猪空肠中段2 cm左右,纵向切开并用蒸馏水洗去食糜,用镊子将组织块移至前1天已预冷的戊二醛固定液(含量为2.5%)的小广口瓶中固定,用于空肠绒毛超微结构测定;再取盲肠中段肠管,两端双线结扎,用锡箔纸和保鲜膜包裹后,做好标记,置于液氮中速冻,再转至-80 ℃保存,用于盲肠微生物菌群结构分析。
1.4 测定指标与方法 1.4.1 肠道形态结构取出甲醛溶液中固定的十二指肠、回肠、空肠组织,进行常规脱水、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色后,利用Motic Images Advanced 3.2软件,测量肠道隐窝深度和绒毛高度,每张切片观察10个视野,计算V/C。另取空肠样品,在冰面上用刀片将其切割成1 mm×1 mm×1 mm大小。样品经磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次,梯度酒精脱水2次,纯丙酮脱水2次,EPON812 :丙酮(1 : 1)浸透,纯包埋液浸透,纯包埋液固化,使用超薄切片机(BROMMA LKB-V,瑞典)切片,经醋酸双氧铀、枸橼酸铅双重染色后用透射电镜(日立H-600,日本)观察其超微结构并拍照。
1.4.2 盲肠微生物菌群结构首先进行盲肠内容物总DNA提取。将盲肠组织解冻后,无菌条件下取其内容物,采用试剂盒(Tiangen-Magnetic Soil and Stool DNA Kit,北京)检测其DNA纯度、浓度及质量,然后进行PCR扩增、产物纯化、文库制备与库检、HiSeq上机检测。测序工作由北京诺禾致源科技有限公司完成。其次进行盲肠微生物多样性分析。在考虑序列丰度的前提下,计算不同随机抽样下多样性指数(Shannon指数、Simpson指数)和丰富度指数(Chao指数、Ace指数、Observed-species指数)。采用GraphPad Prism(V.7.0.1)软件进行显著性检验。利用R Stodio(V.3.0.2)软件基于加权的UniFrac距离进行主成分分析。最后进行盲肠微生物分类学统计。在门(phylum)、纲(class)、目(order)、科(family)、属(genus)5个水平上统计每个样品的肠道群落组成。使用Wilcox秩和检验对各组间微生物群落在门和属水平上进行假设检验,评估物种丰度的显著差异,分析组间显著性差异物种。
1.5 数据处理与统计分析所有数据用Excel 2013简单处理后,采用SPSS 17.0软件中one-way ANOVA模型进行单因素方差分析,Duncan氏法进行多重比较,各组数据以平均值和标准误表示。以P < 0.05为显著性判断标准。再进行双因素方差分析,分析MOS和Ala-Gln两因子之间是否存在互作效应。
2 结果与分析 2.1 Ala-Gln和MOS对断奶仔猪小肠形态结构的影响由表 1可以看出,相比于对照组,饲粮中添加0.10% MOS、0.20% MOS、0.15% Ala-Gln、0.30% Ala-Gln、0.10% MOS+0.15% Ala-Gln、0.20% MOS+0.15% Ala-Gln、0.10% MOS+0.30% Ala-Gln、0.20% MOS+0.30% Ala-Gln后,35日龄仔猪十二指肠绒毛高度均显著提高(P < 0.05)。MOS和Ala-Gln组合使用组十二指肠绒毛高度均显著高于单独使用MOS组和对照组(P < 0.05),而0.10% MOS+0.30% Ala-Gln组十二指肠绒毛高度均显著高于单独使用MOS、Ala-Gln组和对照组(P < 0.05)。添加0.10% MOS+0.15% Ala-Gln后空肠绒毛高度获得最大值,显著高于对照组、0.10% MOS组、0.15% Ala-Gln组(P < 0.05),但与0.20% MOS、0.30% Ala-Gln、0.10% MOS+0.30% Ala-Gln、0.20% MOS+0.30% Ala-Gln组之间差异不显著(P>0.05)。饲粮中添加0.20% MOS+0.15% Ala-Gln、0.10% MOS+0.30% Ala-Gln、0.20% MOS+0.30% Ala-Gln后,回肠绒毛高度显著高于对照组(P < 0.05)。其中,0.10% MOS+0.30% Ala-Gln、0.20% MOS+0.30% Ala-Gln组回肠绒毛高度显著高于0.10% MOS、0.20% MOS、0.15% Ala-Gln、0.30% Ala-Gln及0.10% MOS+0.15% Ala-Gln组(P < 0.05)。与对照组相比,饲粮中添加MOS、Ala-Gln或其组合,均未显著改变十二指肠、空肠、回肠的隐窝深度(P>0.05)。饲粮中添加0.10% MOS+0.15% Ala-Gln、0.20% MOS+0.15% Ala-Gln、0.10% MOS+0.30% Ala-Gln、0.20% MOS+0.30% Ala-Gln显著提高了十二指肠V/C(P < 0.05),而添加0.10% MOS+0.15% Ala-Gln还显著提高了空肠V/C(P < 0.05),添加0.20% MOS+0.15% Ala-Gln、0.10% MOS+0.30% Ala-Gln、0.20% MOS+0.30% Ala-Gln同时对回肠V/C有显著改善作用(P < 0.05)。表中数据还显示,MOS和Ala-Gln对仔猪空肠绒毛高度存在显著的互作关系(P < 0.05),但对十二指肠和回肠绒毛高度,十二指肠、空肠及回肠隐窝深度,以及十二指肠、空肠及回肠的V/C未表现出显著的互作效应(P>0.05)。
由表 2可以看出,相比于对照组,饲粮中添加0.10% MOS、0.20% MOS、0.15% Ala-Gln、0.30% Ala-Gln、0.10% MOS+0.15% Ala-Gln、0.20% MOS+0.15% Ala-Gln、0.10% MOS+0.30% Ala-Gln、0.20% MOS+0.30% Ala-Gln后,49日龄仔猪十二指肠绒毛高度均显著提高(P < 0.05)。饲粮中添加0.10% MOS+0.30% Ala-Gln、0.20% MOS+0.30% Ala-Gln显著提高了仔猪空肠绒毛高度(P < 0.05),其中0.20% MOS+0.30% Ala-Gln组空肠绒毛高度还显著高于0.10% MOS、0.20% MOS、0.15% Ala-Gln、0.30% Ala-Gln、0.10% MOS+0.15% Ala-Gln组(P < 0.05),而与0.20% MOS+0.15% Ala-Gln、0.10% MOS+0.30% Ala-Gln组差异不显著(P>0.05)。各试验组对回肠绒毛高度均没有显著的影响(P>0.05),对十二指肠和空肠隐窝深度也没有显著影响(P>0.05),但添加0.10% MOS+0.30% Ala-Gln显著降低了回肠隐窝深度(P < 0.05)。相比于对照组,各试验组十二指肠V/C显著提高(P < 0.05),其中,组合型的0.10% MOS+0.15% Ala-Gln、0.20% MOS+0.15% Ala-Gln、0.10% MOS+0.30% Ala-Gln、0.20% MOS+0.30% Ala-Gln还显著提高了空肠和回肠的V/C(P < 0.05)。表中数据还显示,Ala-Gln和MOS对十二指肠的绒毛高度及十二指肠V/C存在显著的互作效应(P < 0.05)。
图 1、图 2结果印证了表 1、表 2的数据分析,与对照组仔猪空肠微绒毛稀疏、不整齐以及部分脱落相比,饲粮中添加MOS、Ala-Gln尤其是两者组合(0.20% MOS+0.15% Ala-Gln、0.10% MOS+0.30% Ala-Gln、0.20% MOS+0.30% Ala-Gln)使用后,仔猪空肠微绒毛高度获得较大改善,微绒毛整体表现清晰、整齐、密集。
由表 3可以看出,与对照组相比,饲粮中添加0.10% MOS、0.20% MOS、0.15% Ala-Gln、0.30% Ala-Gln、0.10% MOS+0.15% Ala-Gln、0.20% MOS+0.15% Ala-Gln、0.10% MOS+0.30% Ala-Gln、0.20% MOS+0.30% Ala-Gln对35、49日龄仔猪盲肠的Sobs、Chao、Ace、Shannon及Simpson指数均没有显著影响(P>0.05)。
由图 3可以看出,在35、49日龄时分别检测出18、17个盲肠菌门,2次采样盲肠中主要分布9个菌门,即放线菌门(Actinbacteria)、拟杆菌门(Bacteroidets)、蓝藻细菌门(Cyanbacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋菌门(Spirochaetae)以及软壁菌门(Tenericutes),这9个菌门数量占总细菌数量的90%以上。饲粮添加0.20% MOS+0.15% Ala-Gln可以显著促进35日龄仔猪盲肠纤维杆菌门的生长繁殖(图 3-B)。但是,单独添加Ala-Gln和MOS对35、49日龄仔猪盲肠门水平菌群的影响不大。
由图 4可以看出,在35、49日龄时分别检测出37、35个盲肠菌属,2次采样盲肠中主要分布12个菌属,即乳杆菌属(Lactobacillus)、拟杆菌属(Bacteroides)、放线杆菌属(Actinobacillus)、普氏菌属(Prevotella)、梭状芽孢杆菌(Clostridium)、梭状芽孢杆菌(Clostridium)、柯林斯菌属(Collinsella)、粪球菌属(Coprococcus)、真杆菌属(Eubacterium)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio),它们的数量占总细菌数量的90%以上。其中,饲粮中添加0.10% MOS+0.15% Ala-Gln、0.20% MOS+0.15% Ala-Gln显著提高了35日龄仔猪盲肠乳杆菌属、粪球菌属等有益菌的相对丰度(P < 0.05),添加0.10% MOS+0.15% Ala-Gln还显著提高了琥珀酸弧菌属的相对丰度(P < 0.05)。
给断奶仔猪补充适量的Gln和MOS能有效防止断奶应激并提高仔猪的生长性能。赵玉蓉等[9]在断奶仔猪饲粮中添加l.0% Gln,结果显示仔猪肠道双歧杆菌和乳酸杆菌获得良好生长,而大肠杆菌生长受到有效抑制。邓宸玺[3]研究发现,0.30% Ala-Gln可以提高28日龄仔猪十二指肠和空肠的绒毛高度,而0.15% Ala-Gln组和0.30% Ala-Gln组还可提高42日龄仔猪十二指肠、回肠绒毛高度。MOS在抑制仔猪结肠、盲肠和直肠大肠杆菌增殖中发挥着积极的作用,其中以0.1% MOS效果最好[10]。本试验结果显示,相比于对照组,饲粮中添加0.10% MOS+0.30% Ala-Gln、0.20% MOS+0.30% Ala-Gln后,35日龄仔猪十二指肠、空肠、回肠的绒毛高度以及十二指肠、回肠V/C均显著提高,微绒毛整体表现清晰、整齐、密集。试验同时发现,饲粮中单独添加MOS可提高仔猪盲肠纤维杆菌门和粪球菌属相对丰度,添加0.10% MOS+0.15% Ala-Gln也能显著增加盲肠中粪球菌属相对丰度。但当Ala-Gln添加量再增加时,无论是复合添加Ala-Gln与MOS还是单独添加Ala-Gln,盲肠中粪球菌属相对丰度均无显著差异。而盲肠中纤维杆菌门相对丰度的增加主要依赖饲粮中MOS的添加。因此,Ala-Gln重在调节仔猪肠道绒毛形态结构,而MOS重在调节肠道微生物菌群结构。
Gln和MOS组合使用首先表现的是两者单一成分所发挥的各自作用。Gln二肽通过释放Gln为小肠黏膜提供氧化燃料和氮源是最早被认为调节肠黏膜屏障功能的一个机理。研究表明,在正常生理状态下,肠道所需的Gln来源于体内合成和摄食,肠道几乎完全依赖Gln来支持黏膜细胞和巨噬细胞的生理代谢以维持肠黏膜结构和功能的完整[11]。而在应激状态,机体对Gln的消耗将大大增加,体内合成远不能满足需要。当仔猪肠上皮中来自血浆和肌肉的内源性Gln不足以维持上皮细胞的完整时,肠道将发生绒毛萎缩、隐窝增生,以至影响小肠对养分的吸收[12]。肠黏膜上皮细胞大约每3~5 d更新1次[13],细胞增殖和分化所需的能量及代谢前体主要来自Gln[14]。Ala-Gln还可以通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/p38丝裂原活化蛋白激酶(mTOR/p38MAPK)信号通路调节仔猪小肠上皮细胞的凋亡与自噬来,实现其对仔猪肠道屏障功能的改善作用[15]。MOS可以与有害细菌的受体结合,与有害菌形成竞争关系,一定程度上可以阻止有害细菌与肠道上皮细胞上相应受体的结合,致使有害细菌从肠道排出速度加快,改善肠道微生态系统,调节动物机体免疫功能,达到促进生长性能、增强抵抗力的良好作用[16-17]。本试验发现,MOS和Ala-Gln对35日龄仔猪空肠绒毛高度、49日龄仔猪十二指肠绒毛高度及十二指肠V/C均存在显著的互作效应,这说明Ala-Gln和MOS组合使用除了发挥各自的积极作用外,还表现在两者之间的协同作用。
4 结论① 饲粮中添加0.10% MOS+0.30% Ala-Gln、0.20% MOS+0.30% Ala-Gln后,仔猪小肠绒毛高度及其V/C显著提高,微绒毛整体表现地更为清晰、整齐、密集。
② 饲粮中添加MOS可显著提高仔猪盲肠纤维杆菌门和粪球菌属相对丰度,添加0.10% MOS+0.15% Ala-Gln能显著增加盲肠中粪球菌属相对丰度,但Ala-Gln添加量并非越高效果越好。
③ MOS和Ala-Gln对35日龄仔猪空肠绒毛高度、49日龄仔猪十二指肠绒毛高度及十二指肠V/C存在显著的互作效应。
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